萌發(fā)小麥種子中淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究解析

1、 萌發(fā)小麥種子中淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究 （東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省 哈爾濱市 150030） 摘要： 酶是酶是一種生物催化劑，它具有催化劑屬性，同是也具有一些無(wú)機(jī)催化劑所不具有的特性。催化特定化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)、RNA或其復(fù)合體。是生物催化劑，能通過(guò)降低反應(yīng)的活化能加快反應(yīng)速度，但不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用淀粉酶水解還原糖，還原糖能使3，5-二硝基水楊酸還原，生成棕色的3-氨基-5硝基水楊酸。淀粉酶活力與還原糖的量成正比，用比色法測(cè)定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位質(zhì)量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成還原糖的量表示酶活力。以淀粉在碘液中顯藍(lán)色性質(zhì)，探究酶活性影響因素，常見(jiàn)的影響因素

2、有：溫度 pH 活性劑和抑制劑等。 Abstract:Enzyme is a biological catalyst is an enzyme, the catalyst having the property, the same also has some inorganic catalysts do not have the characteristics. Proteins catalyze specific chemical reactions,RNA or a composite thereof. Are biological catalysts,by reducing the ac

3、tivation energy of the reaction to accelerate the reaction rate, but does not change the equilibrium reaction. In this study, the use of enzymatic hydrolysis of starch sugar, sugar makes 3,5-dinitrosalicylic acid reduction ,a brown 3-amino-nitro-salicylic acid.Proportional to the amount of amylase a

4、ctivity and reducing sugars,measuring the amount of amylase in starch sugar produced by colorimetry ,a unit mass of the sample at the certain time.關(guān)鍵詞： 淀粉酶 活性 溫度 PH 激活劑和抑制劑 引言： 新陳代謝是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)最重要的特征。而構(gòu)成新陳代謝的許多復(fù)雜而有規(guī)律的物質(zhì)變化與能量變化，都是在酶催化下進(jìn)行的。生物的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、遺傳、運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)傳導(dǎo)等生命活動(dòng)都與酶的催化過(guò)程緊密相關(guān)，可以說(shuō)，沒(méi)有酶的參與，生命活動(dòng)一刻也不能進(jìn)

5、行。酶是細(xì)胞產(chǎn)生的，受多種因素調(diào)節(jié)控制的具有催化能力的生物催化劑，與一般催化劑比較有以下不同點(diǎn)：酶易失活、酶具有很高的催化效率、酶具有高度專(zhuān)一性、酶活性受到調(diào)節(jié)和控制。而調(diào)節(jié)和控制又包括調(diào)節(jié)酶濃度、抑制劑和激活劑的調(diào)節(jié)等。1 按照淀粉酶水解淀粉的作用方式，可以分為-淀粉酶、-淀粉酶、異淀粉酶和麥芽糖酶四種類(lèi)型。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)谷類(lèi)種子萌發(fā)時(shí)，兩類(lèi)淀粉酶（，型）都存在，淀粉酶總酶活性隨種子萌發(fā)將升高，有利于淀粉被降解為植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的葡萄糖。許多微生物包括1 細(xì)菌、真菌和酵母都能生產(chǎn)淀粉酶，這些廉價(jià)的淀粉酶來(lái)源，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料和環(huán)保等生產(chǎn)實(shí)踐中。2 酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力

6、，酶活力的大小可以在一定條件下所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率來(lái)表示。酶催化的反應(yīng)速率越大，酶的活力越高；反應(yīng)速率越小，酶的活力zx越低，所以測(cè)定酶的活力就是側(cè)訂酶促反應(yīng)速率。3通過(guò)兩種方法可以進(jìn)行酶活力的測(cè)定，其一測(cè)定完成一定量的反應(yīng)時(shí)間，其二測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)的酶催化的反應(yīng)量。而本實(shí)驗(yàn)所采用的是方法二，測(cè)定5min內(nèi)反應(yīng)量。酶活力的測(cè)定方法有分光光度法、熒光法、同位素測(cè)定方法、電化學(xué)方法，還有一些適用于個(gè)別酶的方法，如旋光法、量氣法、量熱法和層析法等。本實(shí)驗(yàn)采用的是分光光度法。 1 材料與方法 1.1材料 實(shí)驗(yàn)材料為小麥。 1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 離心機(jī) 分光光度計(jì) 容量瓶 研缽 電爐 恒溫水

7、浴 離心管 標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（1mg/ml） 3，5-二硝基水楊酸 0.1 mol/l的檸檬酸緩沖液 1% 淀粉溶液等 1.3實(shí)驗(yàn)方法 1.3.1麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 取6支干凈的具塞刻度試管，編號(hào)，按表13-1加入試劑 管號(hào) 1 2 3 4 5 6 2.0 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液/ml 1.2 0.4 0 0.8 1.6 0 2.0 蒸餾水/ml 1.6 1.2 0.4 0.8 2.0 /ml 麥芽糖含量1.6 0.4 0 0.8 1.2 2 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 3,5-二硝基水楊酸/ml 0.273 0 0.158 0.044 0.215 0.101 光密度值 號(hào)管作為空白

8、1分鐘。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容只20ml. 以搖勻，置沸水浴煮沸5波長(zhǎng)下比色測(cè)定光密度。以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，光密度縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)540nm調(diào)零點(diǎn)，在13-2 準(zhǔn)曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的記錄如表 2 1.2 1.6 麥芽糖含量 0 0.4 0.8 0.273 0.158 光密度值 0.101 0 0.044 0.215 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制如圖13-3 1.3.2淀粉酶粗酶液的提取 蒸餾水，研磨勻漿。將2mL萌發(fā)3d的小麥種子，置于研缽中，加入少量石英砂和稱(chēng)取2g，每隔數(shù)分鐘攪動(dòng)15-20min25mL。提取液在室溫下放置提取勻漿到入刻度試管中，定容至，將上清液倒入一個(gè)干凈的試管轉(zhuǎn)速下離心4000r/m

9、in10min一次，使其充分提取。然后在 3中，即為淀粉酶粗酶液。 酶活力的測(cè)定 1.3.3 13-4加入試劑3取支干凈試管，編號(hào)，按表 表13-4 項(xiàng)目 淀粉酶活性的測(cè)定 3 II-2 II-3 試管號(hào) II-1 1.0 ） 1.0 1.0 淀粉酶原液（ml 水浴中鈍化-淀粉酶 15min,冷卻置于700 0 酶稀釋液 (ml) 0 10min 將各試管和淀粉溶液置于預(yù)保溫 40水浴中保溫1.0 mlPH5.6緩沖液（） 1.0 1.0 4.0 0 0 0.4mol/LNaoH(ml) 2.0 ）2.0 2.0 1%淀粉（ml5min 保溫 40恒溫水浴中在 4.0 0 0.4mol/L N

10、aoH(ml) 4.0 加入試劑支干凈試管，編號(hào)，按表13-5取313-5 表 總淀粉酶活性的測(cè)定 項(xiàng)目 II-1 II-2 試管號(hào) II-3 0 淀粉酶原液（ml） 0 0 置于70水浴中15min,冷卻 鈍化-淀粉酶 1.0 1.0 1.0 酶稀釋液 (ml) 將各試管和淀粉溶液置于40水浴中保溫10min 預(yù)保溫 1.0 1.0 緩沖液（ml）1.0 PH5.6 4.0 0 0.4mol/LNaoH(ml) 0 2.0 ） 2.0 ml1%淀粉（2.0 在保溫 40恒溫水浴中5min 0 4.0 0.4mol/L NaoH(ml) 4.0 5min2mlDNS試劑混勻沸水浴煮沸刻度管中，

11、再加入放入將各試管搖勻，分別取2ml25ml處進(jìn)行比色，測(cè)定光密度取出冷卻，再用蒸餾水稀釋至25ml混勻，在分光光度計(jì)上540nm 值，記錄測(cè)定結(jié)果。 原始數(shù)據(jù)記錄： II-1 II-2 編號(hào)II-3 淀粉酶- 0.314 0.312 0.189 總 0.245 0.404 0.413 酶 結(jié)果計(jì)算：2=80.9mg/g.min 25）=(2.21-1.32-淀粉酶活性8/1.1 2=216.3mg/g.min 總酶活性25） = (2.91-1.728/1.14 淀粉酶學(xué)性質(zhì)的研究 1.3.4 淀粉粉酶液的制備 蒸餾水，研磨2ml芽長(zhǎng)約1cm)，置于研缽中，加少量石英砂和2g稱(chēng)

12、取萌發(fā)3d的小麥種子(每隔數(shù)15-20min, 勻漿。將勻漿倒入刻度試管中，定容至25ml.提取液在室溫下放置提取將上清液倒入一個(gè)干凈的試轉(zhuǎn)速下離心，使其充分提取。然后在4000r/min分鐘攪動(dòng)一次， 管中，即為淀粉酶液。4 溫度對(duì)淀粉酶活性的影響 13-610支試管，編號(hào)，按表加入試劑，并記錄觀察到的結(jié)果取 表13-6溫度對(duì)淀粉酶活性的影響 D C c d B A a 管號(hào) b 1 - - 1 - 1 - 緩沖（PH=5.6） 1 - - 2.5 2.5 2.5 2.5 - - 淀粉溶液/ml - 1 - 1 - 1 - 1 淀粉酶提取/ml 沸水浴室溫 40 4預(yù)保溫10m

13、in d C倒入c 倒入B 倒入倒入混合 Aa b D 沸水浴 ）酶促反（10min 404 室溫 各3滴碘液 無(wú)色 無(wú)色 無(wú)色藍(lán)色顯色 對(duì)淀粉酶活性的影響 PH 記錄觀察到的顏色取三支試管，編號(hào)，按表13-7 對(duì)淀粉酶活性的影響表13-7 PH III I II ）（PH=5.6（緩沖液/ml ） PH=8.02）2（PH=3.0 22.5 各淀粉溶液/ml 1 /ml 淀粉提取液各 40搖勻，水浴10min 10min）酶促反應(yīng)（ 碘液 3各滴 顯色 無(wú)色 淺藍(lán)色淺藍(lán)色激活劑和抑制劑對(duì)酶活性的影響 5 操作，并記錄觀察到的顏色取四支試管，編號(hào)，按表13-8 活劑

14、和抑制劑對(duì)淀粉酶活性的影響表 13-8III II I 2ml 緩沖液/ml各（ph=5.6）- NaCL - 1 - 1 - CuSO4 1 - H2O - 2.5ml 淀粉溶液各1ml 酶提取液 各10min 酶促反應(yīng)混勻，40 碘液 滴各1無(wú)色 顯色無(wú)色 淺藍(lán)色 2 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 2.1溫度對(duì)淀粉酶活性的影響 40，溫度偏高偏低都會(huì)影響酶的活性甚至導(dǎo)致酶的失活。現(xiàn)象分析：淀粉酶的最適溫度是致使在一定時(shí)間內(nèi)淀粉的水解，如果淀粉失活這淀粉不水解（例如本實(shí)驗(yàn)的100的試管）。在一定溫度范圍內(nèi)，淀粉酶的活性隨溫度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到某一溫度（40左右）時(shí)，酶的活性達(dá)到最大，當(dāng)超過(guò)這一溫度后，酶的活性

15、隨溫度的升高而減弱。 6 2.1PH對(duì)淀粉酶活性的影響 值是影響酶活的主要因素，通常各種酶只。PH PH現(xiàn)象分析：pH=5.6是小麥淀粉酶的最適其活性最高PH下所表現(xiàn)的活性不同，在一定的PH范圍內(nèi)才表現(xiàn)出活性，同一種酶在不同的,影響酶分子極性基團(tuán)的解離狀態(tài)影響酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性值。PH,時(shí)的PH稱(chēng)為酶的最適PH它可隨底物的濃度和種類(lèi)、酶的純度、緩沖液,也影響底物的解離。PH值不是酶的特定常數(shù) 的種類(lèi)和濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短以及抑制物的作用等而改變。 激活劑和抑制劑對(duì)淀粉酶活性的影響 2.3 離子中Cl離子使淀粉酶活性增強(qiáng)；CuSO4Cu離子為淀粉酶激活劑，中現(xiàn)象分析：NaClCl ,Cu為淀

16、粉酶抑制劑，離子使淀粉酶活性減弱水對(duì)酶活性幾乎無(wú)影響。7 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 3.1溫度對(duì)淀粉酶活性的影響 4：酶的活性幾乎完全被抑制，淀粉未被水解，加入碘液后呈深藍(lán)色； 室溫：酶的活性受到一定的抑制，淀粉被部分水解，加入碘液后呈淺藍(lán)色； 40：酶的活性達(dá)到相對(duì)最大，淀粉完全被水解，加入碘液后接近無(wú)色； 沸水?。好竿耆Щ睿矸畚幢凰猓尤氲庖汉蟪噬钏{(lán)色； 由此可以看出40是小麥淀粉酶的最適溫度。 淀粉酶的最適溫度是40，溫度偏高偏低都會(huì)影響酶的活性甚至導(dǎo)致酶的失活。致使在一定時(shí)間內(nèi)淀粉的水解，如果淀粉失活這淀粉不水解（例如本實(shí)驗(yàn)的100的試管）。在一定溫度范圍內(nèi)，淀粉酶的活性隨溫度的升高而增

17、強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到某一溫度（40左右）時(shí)，酶的活性達(dá)到最大，當(dāng)超過(guò)這一溫度后，酶的活性隨溫度的升高而減弱。5 3.2PH對(duì)淀粉酶活性的影響 ：淀粉酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深藍(lán)色較深PH=3.0 ：淀粉酶活性達(dá)到相對(duì)最大，淀粉被完全水解，加入碘液后呈無(wú)色PH=5.6 ：酶活性受抑制，淀粉被少量水解，加入碘液后呈藍(lán)色PH=8.0PH pH=5.6是小麥淀粉酶的最適由此可以看出PH值是影響酶活的主要因素，通常各種酶只在一定的P。是小麥淀粉酶的最適pH=5.6PH H8 范圍內(nèi)才表現(xiàn)出活性，同一種酶在不同的PH下所表現(xiàn)的活性不同，其活性最高時(shí)的PH稱(chēng)為酶的最適PH值。PH影響酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性,

18、影響酶分子極性基團(tuán)的解離狀態(tài),也影響底物的解離。PH值不是酶的特定常數(shù),它可隨底物的濃度和種類(lèi)、酶的純度、緩沖液的種類(lèi)和濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短以及抑制物的作用等而改變。 3.3激活劑與抑制劑對(duì)淀粉酶活性的影響 空白對(duì)照組：加入碘液后幾乎呈無(wú)色 加NaCl的溶液：淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈無(wú)色 加CuSO4的溶液：淀粉酶活性降低，淀粉被部分水解，加入碘液后呈深藍(lán)色 由此可以看出NaCl是小麥淀粉酶的激活劑；CuSO4小麥淀粉酶的抑制劑 NaCl中Cl離子為淀粉酶激活劑，Cl離子使淀粉酶活性增強(qiáng)；CuSO4中Cu離子為淀粉酶抑制劑，Cu離子使淀粉酶活性減弱，水對(duì)淀粉酶活性幾乎無(wú)

19、影響，酶的抑制劑分類(lèi)大致分為可逆抑制和不可逆抑制，酶的抑制劑的研究對(duì)生物化學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展有著重要意義。 9 4 討論 4.1實(shí)驗(yàn)討論 1、 溫度、環(huán)境PH值、激活劑、抑制劑是影響酶活性的幾個(gè)重要因素，研究其中一個(gè)因素對(duì)酶活性的影響時(shí)，要控制其他因素不變（其他因素盡量控制在使酶活性最高的水平上），從而研究這一單一因素對(duì)酶活性的影響。通過(guò)對(duì)淀粉酶活性初步研究得出結(jié)論如下：溫度、PH、激活劑、抑制劑是影響淀粉酶活性的重要因素。在一定溫度范圍內(nèi)，淀粉酶的活性隨溫度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到某一溫度（40左右）時(shí)，酶的活性達(dá)到最大，當(dāng)超過(guò)這一溫度后，酶的活性隨溫度的升高而減弱;在一定PH范圍內(nèi)，酶的活性隨P

20、H的升高而升高，當(dāng)達(dá)到某一PH（5.6左右）時(shí)，酶的活性達(dá)到最大，當(dāng)超過(guò)這一PH時(shí)，酶的活性隨PH的升高而降低，直到失去活性；Cl-使酶的活性增強(qiáng)Cu2+使酶活性減弱。通過(guò)與他人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，該實(shí)驗(yàn)容易出現(xiàn)個(gè)體偏差。實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)短結(jié)果會(huì)有偏差。 萌發(fā)天數(shù)不同的材料，糖化時(shí)間不同。春季與冬季測(cè)定的結(jié)果有較大差異。估計(jì)酶的性質(zhì)可能受多種因素影響。 2、通過(guò)對(duì)淀粉酶活性初步研究,說(shuō)明溫度、PH、激活劑、抑制劑是影響淀粉酶活性的重要因素。在一定溫度范圍內(nèi)，淀粉酶的活性隨溫度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到某一溫度（40左右）時(shí)，酶的活性達(dá)到最大，當(dāng)超過(guò)這一溫度后，酶的活性隨溫度的升高而減弱;在一定PH范圍內(nèi)，

21、酶的活性隨PH的升高而升高，當(dāng)達(dá)到某一PH（5.6左右）時(shí)，酶的活性達(dá)到最大，當(dāng)超過(guò)這一PH時(shí)，酶的活性隨PH的升高而降低，直到失去活性；Cl-使酶的活性增強(qiáng)Cu2+使酶活性減弱3。 3、研究酶有重要的意義。生物體內(nèi)的各種代謝變化都是由酶驅(qū)動(dòng)的,酶有兩種功能:其一,催化各種生化反應(yīng),是生物催化劑;其二,調(diào)節(jié)和控制代謝的速度、方向和途徑,是新陳代謝的調(diào)節(jié)元件。酶對(duì)細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)主要有兩種方式:一是通過(guò)激活或抑制以改變細(xì)胞內(nèi)已有酶分子的催化活性;另一種是通過(guò)影響酶分子的合成和降解,以改變酶分子的含量。這種酶水平的調(diào)節(jié)機(jī)制是代謝的最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)4 10 ?，F(xiàn)代酶學(xué)正向著兩個(gè)方向發(fā)展：酶的分子生物學(xué)和酶工程學(xué)，它們是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分，應(yīng)用范圍包括醫(yī)藥，食品，化學(xué)工業(yè)，診斷分析和生物傳感器，涉及的品種不少，如淀粉酶，其市場(chǎng)需求生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)值均很樂(lè)觀，并已產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)效益5。 4、對(duì)于酶活力測(cè)定的方法有很多,比如測(cè)定酶活性的凝膠擴(kuò)散法和組織印漬法3,該法建立了改良凝膠擴(kuò)散法和組織印漬法檢測(cè)-淀粉酶活性的方法,此法的實(shí)驗(yàn)條件容易控制