實(shí)用HPLC方法的建立(施超歐)

1、實(shí)用HPLC方法的建立目錄1 前言2 HPLC方法建立的步驟3 選擇儀器類(lèi)型，確定檢測(cè)器及其參數(shù)2 是否需要樣品預(yù)處理，是否有特殊的步驟1 了解樣品的有關(guān)情況，明確分析目的7a 回 收 純 化 物 質(zhì)8 方 法 論 證 進(jìn) 入 常 規(guī) 實(shí) 驗(yàn) 室7b 定 量 校 正7c 定 性 方 法6 檢 查 出 現(xiàn) 的 各 種 現(xiàn) 象 和 問(wèn) 題 (包 括 儀 器 、 樣 品 穩(wěn) 定 性 等 ） 選 擇 解 決 辦 法 和 特 殊 步 驟5 優(yōu) 化 分 離 條 件 ， 選 擇 最 佳 檢 測(cè) 器 參 數(shù) 、 色 譜 柱 、 流 動(dòng) 相 比 例 等4 選 擇 液 相 色 譜 分 離 類(lèi) 型 ， 色 譜 柱

2、， 流 動(dòng) 相 ， 其 他 相 關(guān) 條 件 （ 如 波 長(zhǎng) 等 ） ， 進(jìn) 行 預(yù) 實(shí) 驗(yàn) ， 估 計(jì) 最 佳 條 件2.1 了解樣品的有關(guān)情況2.2 明確分析目的2.3 樣品的預(yù)處理與檢測(cè)2.4 HPLC分析模式2.5 色譜條件2.6 方法的優(yōu)化，及色譜現(xiàn)象的解析和處理2.7 定性和定量方法的建立及論證3 色譜條件的選擇3.2 檢測(cè)器的選擇3.3 樣品的溶解及預(yù)處理3.4 樣品的進(jìn)樣量3.5色譜柱的選擇及保護(hù)與再生3.6 泵的選擇3.7 色譜工作站4 分析方法建立的實(shí)例改變?nèi)萘恳蜃?K60/4050/5040/60改變選擇性a62:38/42:58/72:28/2322，OHCNCHOHMe

3、OHOHTHF4.2 梯度方法的建立梯度的洗脫方式溶劑 A溶劑 B泵 A泵 B混合器A 高壓梯度溶劑 A泵溶劑 B比例閥（溶劑混合點(diǎn)）混合器B 低壓梯度（溶劑混合點(diǎn)）梯度洗脫的可變參數(shù)124356789 10 11如不用梯度：分離不理想梯度條件的優(yōu)化梯度曲線(xiàn)的變化 凹線(xiàn)梯度曲線(xiàn)的變化 凸線(xiàn)梯度平衡時(shí)間的影響（一）10分鐘的梯度，6分鐘的平衡時(shí)間色譜圖不重復(fù)梯度平衡時(shí)間的影響（二）平衡時(shí)間6分鐘平衡時(shí)間7分鐘平衡時(shí)間8分鐘平衡時(shí)間9分鐘平衡時(shí)間從6到7分鐘，第一個(gè)峰的保留時(shí)間有明顯的變化，說(shuō)明6到7分鐘的平衡時(shí)間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個(gè)時(shí)間時(shí)，平衡充足。有機(jī)污染物的影響（一）50m

4、l超純水的有機(jī)物污染狀態(tài)有機(jī)污染物的影響（二）“三蒸水”有大量的有機(jī)污染物不適合梯度分析有機(jī)污染物的影響（三）典型的“實(shí)驗(yàn)室水”有大量的有機(jī)污染物不適合高靈敏度梯度分析梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第一步梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第二步為使色譜峰前移，提高起始時(shí)乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分離得到改善。但是9個(gè)化合物出了10個(gè)色譜峰，說(shuō)明有雜質(zhì)存在，很可能是流動(dòng)相水中的。梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第三步 從空白梯度圖顯示，在同樣的色譜條件，同樣的檢測(cè)靈敏度下，共有兩個(gè)雜質(zhì)峰。說(shuō)明流動(dòng)相水中的雜質(zhì)在此條件下可能會(huì)對(duì)檢測(cè)有影響。梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第四步 空白梯度圖同樣品的色譜圖進(jìn)行對(duì)照后，我們看到

5、雜質(zhì)（共兩個(gè)峰）中的第一個(gè)小峰對(duì)第8個(gè)色譜峰有干擾，會(huì)使其定量分析結(jié)果不準(zhǔn)確。梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第五步梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第六步 根據(jù)“梯度曲線(xiàn)下的面積越大，洗脫能力越強(qiáng)”的規(guī)律，試用#5曲線(xiàn)使3-9號(hào)峰提前，改用50-95%B見(jiàn)到好的現(xiàn)象。梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第七步最后用50-90%B，曲線(xiàn)4，得到好的結(jié)果。4.3 色譜柱及pH的影響NHNHOONOHOOHNOOOOHOHNH2尿嘧啶尿嘧啶3-3-丁基丁基吡啶吡啶4-4-苯基苯基丁胺丁胺4 4- -苯基丁酸苯基丁酸苯酚苯酚丙丙基苯基苯1,4-1,4-二羥基蒽醌二羥基蒽醌N,N-N,N-二二乙基間甲苯酰胺乙基間甲苯酰胺丁基丁基苯苯*

6、4-Phenylbutylamine was not used for testing at pH 2.5* 4-Phenylbutyric acid was not used for testing at pH 7苯苯基基aa芘芘1,2:3,4:5,6:7,81,2:3,4:5,6:7,8- -四四苯基萘苯基萘菲菲3,4-c3,4-c并并菲菲HPLC 條件條件 試驗(yàn)試驗(yàn)3Column: Alltima C18, 5m, 150 x 4.6mm1a堿堿滅活滅活1b非非堿滅活堿滅活1. 尿嘧啶2. 3-丁基吡啶3. 苯酚4. 4-苯基丁酸5. N,N-二乙基間甲苯酰胺 (DEET)6. 1,4二

7、羥基蒽醌7. 丙基苯8. 丁基苯Column: Adsorbosphere C18, 5m, 150 x 4.6mm pH 2.5 的色譜圖2a堿堿滅活滅活2b非非堿滅活堿滅活pH 7 的色譜圖Column: Alltima C18, 5m, 150 x 4.6mmColumn: Adsorbosphere C18, 5m, 150 x 4.6mm1. 尿嘧啶2. 苯酚3. 4-苯基丁胺4. N,N-二乙基間甲苯酰胺5. 3-丁基吡啶6. 1,4二羥基蒽醌7. 丙基苯8. 丁基苯pH2.5pH7.01.1. 丙酮2.2. 苯a芘 3.3. 菲3,4-c并菲 4.4. 1,2:3,4:5,6:7,8-四苯基萘3 3a aPlatinumPlatinum C18, C18, 5m, 150 x 4.6mm5m, 150 x 4.6mm3 3b bNucleosilNucleosil C18 AB, C18 AB, 5m, 150 x 4.6mm5m, 150 x 4.6mm3 3c cInertsilInertsil ODS-2, ODS-2, 5m, 150 x 4.5mm5m, 150 x 4.5mm5 5 色譜分析中各種圖譜現(xiàn)象的判斷色譜分析中各種圖譜現(xiàn)象的