畢業(yè)設計（論文）人參蛋白及多肽提取工藝及活性研究

1、摘 要 目的：人參蛋白及多肽主要具有抗脂質分解、抗血紅細胞聚積、抗真菌、抗 病毒、精氨酸酶活性等。選擇研究較少但活性多樣的大分子人參蛋白及多肽， 通過現(xiàn)代分離純化技術、活性檢測技術及分析鑒定技術進行生物特性研究。通過 對不同參之間的蛋白成分進行比較和研究，對人參的一些多肽成分的分析和應用 提供依據(jù)。 方法：采用中藥化學及生物化學提取法,結合離子交換、凝膠過濾層析和反相 c18 層析等現(xiàn)代生物分離技術, 利用膜分離技術及柱層析技術對總蛋白進行分離純 化，結合細胞活性實驗進行活性篩選，對人參中的蛋白及多肽進行了分離純化， 采用 hplc、sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sds-page）及凝膠電泳圖

2、像分析軟 件等譜學技術，初步研究了這些蛋白多膚的結構,并從細胞水平進行了體外活性實 驗,探討蛋白與多膚的生物活性。 結果：采用現(xiàn)代生物層析分離技術從人參中分離純化得到 3 個蛋白質單體化 合物,分別為 gsp、gsp及 gsp。經(jīng)基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜人 參蛋白及多肽藥理活性實驗表明, 人參蛋白 gspll 對金黃色葡萄球菌具有抑制作用;對 hep-2 細胞具有抑制作用，對 3t3 細胞具有增殖作用，且活性呈現(xiàn)一定量效關 系。 關鍵詞 人參 多肽 提取工藝 活性研究 abstract objective:ginseng proteins and polypeptide, which

3、have a variety of biological activities but less reasearches, were studied by modern technologies including isolation and purification technology, activity detection technology and analysis - identification technology. providing a basis for identification and quality evaluation among ginseng, wild g

4、inseng and american ginseng by showing a comparative study of their water- soluble protein components. methods: using different buffer, different ratio of solution, different extraction time to extract the ginseng protein, using bradford method, determin the rate of protein extraction for the evalua

5、tion standards, choose the best optimized extraction process. purification was carried by hollow fiber system and column chromatography technology, combined with cell activity to screening activity component. compare the difference of the proteins among ginseng, wild ginseng and american ginsengusin

6、g sds- polyacrylamide gel electrophoresis (sds-page) and image analysis software. results: three proteins were obtained from ginseng：gsp、gspand gsp。activity experiments show that it have inhibitory effect on 3t3 cells proliferation and have inhibitory effect on hep-2 cells proliferation, key words g

7、inseng polypeptide extraction processpropert 目目 錄錄 第一章 文獻綜述.1 1.1 人參的發(fā)展趨勢及待解決問題.1 1.2 人參蛋白的研究現(xiàn)狀.2 1.3 蛋白質及多肽在中藥鑒別中的重要地位.4 1.4 本課題研究的內(nèi)容及意義.4 第二章材料與儀器.6 2.1 材料與試劑.6 2.1.1 原料.6 2.1.2 其它材料與試劑.6 2.2 儀器.7 第三章實驗方法.8 3.1 人參多肽的分離純化.8 3.1.1 人參多肽的提取制備.8 3.1.2 人參多肽的純化.8 3.1.3 高效凝膠過濾色譜（hpgfc）檢測 .8 3.1.4 基質輔助激光解析

8、電離飛行時間質譜(maldi-tof-ms)檢測 .8 3.2 人參多肽的活性研究.9 3.2.1 細胞系 .9 3.2.2 試劑配制 .9 3.2.3 傳代細胞培養(yǎng) .10 3.2.4 樣品配制 .10 3.2.5 mtt 法檢測人參多肽對細胞增殖的影響.10 第四章 實驗結果.12 4.1. 人參多肽的分離純化 .12 4.1.1 人參多肽的提取制備 .12 4.1.2 人參多肽的 sephadex g-75 層析圖譜.12 4.1.3 sds 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 .13 4.1.4 高效凝膠過濾色譜檢測 .13 4.1.5 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(maldi-tof-ms)

9、檢測 .14 4.2 人參多肽的活性研究 .15 4.2.1 人參多肽對 3t3 細胞增殖影響 .15 4.2.2 人參多肽對 2bs 細胞增殖影響 .16 4.2.3 對 hep-2 細胞增殖影響.17 第五章 討 論.18 5.1 人參多肽的分離純化.18 5.2 人參多肽的活性研究.19 致 謝.21 參 考 文 獻.22 第一章 文獻綜述 人參在我國醫(yī)藥史上具有極其特殊的地位，被譽為“百草之王” ，是吉林省 乃至全國的標志性中藥材。人參在我國中藥中用途非常廣泛，在中國藥典、中國 國家部頒標準中出現(xiàn)的次數(shù)均排在第一位?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證明，人參對中樞神經(jīng) 系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液及

10、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)都具 有良好的保護作用。另外，研究證明，人參還具有明顯的抗腫瘤、抗輻射、抗衰 老和解毒功能。由于人參的卓越滋補強壯作用和獨特的醫(yī)療功效，因此吸引了許 多化學家致力于有效成分之分離和鑒定。由于化學分析方法的進步，近三十余年 來，人參成分的分離、提純和結構鑒定得到了重大的進展，迄今已知人參根中含 有人參皂苷、多糖、揮發(fā)油、脂肪酸、甾醇、維生素、蛋白質、多肽等多種有效 成分1,2。但目前人們的研究主要集中于人參皂苷及揮發(fā)性成分研究，蛋白質及多 肽的研究相對較少。 中藥所含化學成分非常復雜。目前，對這些成分的研究往往集中于糖、生物 堿、苷類、揮發(fā)油等。而另一些在中藥里普遍

11、存在的成分，尤其是蛋白質等生物 大分子研究相對薄弱。蛋白質作為一類重要的高分子化合物，存在于所有動物和 植物的各種組織、細胞中，是生命存在的主要物質基礎。中藥蛋白質不僅與中藥 的醫(yī)療作用有著密切的關系，而且對于鑒定中藥的品種、質量以及加工炮制等都 有重要意義。 1.1 人參的發(fā)展趨勢及待解決問題 目前人參的加工產(chǎn)品主要為紅參,其加工方法為人參先蒸至熟,再加熱烘干制 成紅參,外觀上參體變得致密、角質、透明,顏色也由鮮參的黃白色變成棕褐色。 據(jù)報道在紅參的加工過程中人參總皂普含量損失近 32%,而生物大分子如蛋白質及 多肽在加工過程中是否變性,結構如何變化,沒有類似這些問題的研究報道。生物 大分子

12、活性變化是人參加工工藝的重要參數(shù),對于闡明人參產(chǎn)品藥用機理具有重要 意義。從上述文獻可以看出,人參在藥用研究方面多從皂普考慮,生物大分子特別 是多肽是作用及機理涉及太少,雖然近年從人參中分離蛋白質及多肽的工作正在興 起,但對于人參中所含的 300 種多肽與蛋白來說,這只是一個開始。因此,運用現(xiàn)代 生物技術從人參中分離出具有生物活性的多肽及蛋白質,并利用活性和結構兩種方 法研究其活性及結構變化規(guī)律,通過這些數(shù)據(jù)利用生物工程技術,為開發(fā)出高活性 的生物藥奠定基礎。 長期以來，人們對人參皂甙和揮發(fā)油的研究較多。而對于一些水溶性活性成 分如人參蛋白及多肽的研究卻較少。目前的研究表明，人參蛋白及多肽主要

13、具有 抗脂質分解、抗血紅細胞聚積、抗真菌、抗病毒、精氨酸酶活性等。此外，在人 參蛋白研究中，也存在一些問題。一方面，偏重小分子蛋白即多肽的研究，對含 量較高的大分子蛋白重視不夠，對人參多肽的報道要遠遠多于人參大分子量蛋白。 其原因之一，就是許多研究人員認為多肽是藥材的活性成分或有效成分，而大分 子量蛋白應是結構蛋白或儲存蛋白，并沒有與藥材相應的顯著的臨床療效。這就 造成了研究大多以開發(fā)新藥為目的，偏重藥效或活性研究，對大分子蛋白在中藥 炮制加工和質量控制方面的作用重視不夠。另一方面，技術水平較低，研究不能 深入。關于人參蛋白的研究工作許多為 1020 年前報道的，由于技術水平的限制， 導致產(chǎn)品

14、收率較低、純度不高以及耗時較長，沒有形成一個同時純化多種蛋白的 快速、高效純化工藝路線，并且沒有關于人參蛋白及多肽庫這一領域的理論研究。 1.2 人參蛋白的研究現(xiàn)狀 人參蛋白及多肽的研究始于六十年代, 主要集中于人參多肽的提取方法。 1963 年，德國的 f.gstirnor 等人首次從人參根中檢測出氨基酸：谷氨酸、半胱 氨酸、酪氨酸3。1966 年他們又采用電泳的方法從高麗白參的甲醇水提取液中得 到 5 個小肽， 未確定出一級結構4。1980 年，日本人 ando 與 okada 等發(fā)現(xiàn)人參 水提取液中有一種強烈抑制腎上腺素誘導的脂肪分解的物質5，此物質能被鏈霉 蛋白酶（pronase）破壞

15、,估計為蛋白或肽類化合物。經(jīng) deae- cellulose,sephadexg-10,avicel-cellulose,phosphoriccellulose 等色譜手段 分得一個 14 肽，氨基酸組成為 2asp，thr，ser，3glu，3gly，ala，val，leu, il,未測出一級結構,之后也未查到繼續(xù)研究此肽的報道。 1990 年 takaku 和 okada 等又報道從高麗紅參中得到一種酸性物質6，可以抑制腎上腺素誘導的脂肪 分解并能刺激胰島素參與的脂肪合成，并確定該酸性物質為焦谷氨酸。同時他們 還指出紅參中可能有一種非肽物質也有此活性。在此期間，韓國的 kim 等報道從 人

16、參中分離純化到有抗脂肪分解活性的寡肽7，但未給出一級結構。yagi 等人 1994 年從人參中提取到一種四肽成分:val -d-glu-d-arg-gly。并證明一些非蛋 白氨基酸對其調節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)活性至關重要。魏俊杰等人8從生曬參中分離出兩種 人參多肽，分別是分子量為 1000da 的 11 肽和分子量為 1300da 的 12 肽，它們具 有降低 2bs 細胞內(nèi)多糖含量和增強 2bs 細胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶活力的作用。chen 等9人利用水醇提取法,結合離子交換、凝膠過濾和 rp-hplc 從人參中分離出六種 含 a 氨基酸的小肽,并通過氨基酸序列分析已測定其結構為氧化性的谷胱甘肽及 其類似物,

17、實驗證明,它具有調節(jié)動物睡眠的作用。另外，一種結構為:glu-thr- val -glu-ile-ile-asp-ser-glu-gly-gly-gly-asp-ala 的 14 肽也是從人參中提 取出來,它具有強烈的抗脂解活性10。吉林大學的張今等，1985 年報道用 717 型 和 732 型離子交換樹脂柱從人參花蕾中分得兩個酸性肽11，氨基酸組成分別為 ：asp-thr-ser-glu-gly-ala-val -mat-leu-phe-arg 分子量大于； ：asp-thr-ser-glu-gly-ala-val -ile-leu-lys，分子量大于 1200。1988 年， 他們又按照

18、日本人 ando 的分離程序及改進的分離程序（用 sephadex g-25 凝 膠過濾）12,13從人參中分離出一個具有胰島素作用的 14 肽,認為是 ando 得到的 14 肽，但存在一個氨基酸的差異,并用 dabitc/pictc 雙偶合法測定了序列為 glu-thr-val -glu-ile-ile-asp-ser-glu-gly-gly-gly-asp-ala。其后，又用 cd 譜研究了該肽的研究二級結構14；生理活性研究表明有抗脂肪分解及降低血糖和 肝糖作用15, 16；對該肽的基因進行了化學合成和克隆17。白求恩醫(yī)科大學的徐景 達等也從事了這方面的工作，1990 年報道從人參中用

19、 deae-cellulose 和 hplc 純化了兩個肽8，氨基酸組成分別為： 2asp,2ser ,3glu,3gly,ala,lys， 分 子量 1300 左右；： 2asp,2ser,3glu,2gly,ala,pro，分子量 1000 左右。1991 年又報道從紅參中經(jīng) deae-cellulose，sephadex g-10 和 rp-hplc 純化得到兩 個肽18,其一為 13 肽，3gly,2ser,2glu,ala,2asp,thr,leu,val；另一為 15 肽， 4gly,3ser,2glu,2ala,asp,thr,leu,ile。測出了 15 肽的 n 末端為 as

20、p，各肽均 未給出一級結構。 進入 90 年代中期，由于現(xiàn)代生物技術在中藥領域的廣泛應用，對于人參蛋 白的研究才日益增多。應用二維電泳技術現(xiàn)已表明人參中共有人參蛋白 300 多種， 其中已被報道的僅有 40 多種19,20，主要包括：（1）類 rna 酶蛋白：類 rna 酶蛋 白是人參的主要蛋白（ginseng major protein，gmp） ，分子量為 28kda，其氨 基酸序列與植物的 rna 酶具有高度同源性。二維電泳分析顯示 gmp 的含量隨季節(jié) 的變化而變化，因此這一蛋白也被認為是人參的儲存蛋白。 （2）核糖核酸酶：lam 和 ng 從人參根中分離得到一種由 27kda 和 2

21、9kda 兩個亞基組成的非耐熱核糖核 酸酶，其具有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性。隨后他們又從人參花蕾中分離 得到一分子量 23kda 的核糖核酸酶，但卻沒有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性。 gennady 也從人參愈傷組織中分離得到兩種分子量都為 18kda 的核糖核酸酶21。 （3）幾丁質樣蛋白：分子量 15kda，具有抗真菌功能25。 （4）木聚糖酶：從人 參根部提取的木聚糖酶，分子量只有 15kda，明顯低于從其他藥用植物分離得到 木聚糖酶，最適酶活溫度為 50，具有人 i 型免疫缺陷病毒轉錄抑制的活性。 （5）皂苷 -葡萄糖苷酶：從人參中分離的皂苷 -葡萄糖苷酶能水解人參皂苷 rg3

22、，得到抗癌物質人參皂苷 rh2，分子量 59 kda，最適酶活溫度為 60。 1.3 蛋白質及多肽在中藥鑒別中的重要地位 一味正品藥材，不但要求基原正確，性狀、顯微特征無誤，還必須對中藥材 所含的有效成分、主成分或特征性成分等指標成分進行定性、定量分析。而這些 指標成分往往集中于糖、生物堿、苷類、揮發(fā)油等。動、植物類中藥細胞中普遍 含有受遺傳基因控制的蛋白質分子，且有種的特異性和穩(wěn)定性，因此，利用蛋白 質種類的不同來鑒別那些親緣關系相近、性狀類同的中藥是有理論依據(jù)的，在實 驗方法上也是有效可行的22 。利用這一規(guī)律，以蛋白質分子為指標進行中藥鑒別， 對于豐富中藥質量標準體系是非常重要的。 sd

23、s-聚丙烯酰胺凝膠電泳作為一種經(jīng)典技術在蛋白質研究中被廣泛應用。 應 用這一技術，可以根據(jù)電泳的蛋白譜帶數(shù)、泳動率、著色深淺、特征蛋白分子量 等來進行中藥鑒定及質量研究。由于傳統(tǒng)的性狀鑒別易受人為因素影響，通常需 要多種方法配合才能準確鑒定。目前，中藥鑒定的發(fā)展方向是中藥鑒別客觀化、 標準化、現(xiàn)代化。凝膠電泳鑒別技術,為中藥鑒別學科開辟了新的領域,并提供了 一項新的檢測手段和生化指標，使中藥鑒別方法更趨合理和完善23 。 1.4 本課題研究的內(nèi)容及意義 蛋白質的復雜結構導致其物理和化學性質的不穩(wěn)定，很多因素都可以導致其 變性失活，因此在蛋白質提取分離過程中，要綜合各影響因素所帶來的不利影響，

24、本文綜合考察了不同 ph 值、不同料液比、不同浸提時間等影響因素對蛋白提取率 的影響,確定了最佳提取工藝。傳統(tǒng)的蛋白質提取方法是：采用中性緩沖液浸提， 硫酸銨沉淀獲得總蛋白。此方法操作繁瑣且收率和純度很低,不利于大規(guī)模生產(chǎn)24- 28。本文通過正交試驗結合膜分離技術，建立了一種獲得高純度、高收率人參蛋 白的提取方法。同時，本文采用等電點分離結合凝膠過濾層析技術，從人參總蛋 白中分離純化出了分子量為 5027da 的人參多肽，并對其理化性質及活性進行研 究，為人參藥材藥用價值的發(fā)揮及有效成分研究奠定了基礎。 第二章第二章材料與儀器材料與儀器 2.1 材料與試劑 2.1.1 原料 鮮參、山參、西洋

25、參購于吉林省撫松縣，采集時間為 2010 年 9 月共 20 批樣品均 屬于五加科植物人參(panax giseng c.a. mey. ) 野山參是指野外自然生長的人 參。西洋參為五加科植物西洋參（panax quinquefolium l.） ，生長年限為 4 年、 5 年。 2.1.2 其它材料與試劑 三羥甲基氨基甲烷（tris 堿） genview 電泳純 磷酸氫二鈉（na2hpo4） 北京化工廠分析純 磷酸二氫鈉（nah2po4） 北京化工廠分析純 甘氨酸 sigma 電泳純 丙烯酰胺 sigma 電泳純 過硫酸銨 sigma 電泳純 十二烷基硫酸鈉（sds） sigma 電泳純 -

26、巰基乙醇 genview 電泳純 n，n，n，n-四甲基乙二胺（temed） amresco 電泳純 考馬斯亮藍 r250 sigma 電泳純 sds 聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子量標準蛋白 上海生物化學研究所 bradford 蛋白含量試劑盒 sigma 公司產(chǎn)品 mtt sigma 公司產(chǎn)品 dmso sigma 公司產(chǎn)品 胰蛋白酶 gibco 公司產(chǎn)品 dmem 培養(yǎng)基 gibco 公司產(chǎn)品 2.2 儀器 名稱 型號 廠家 電子天平 dt100 常熟市雙杰測試儀器廠 電子天平 ta1203n 上海精密科學儀器有限公司 超聲波清洗器 kq-3200b 昆山市超聲儀器有限公司 循環(huán)水式多用真空泵

27、 shb-3 鄭州杜甫儀器廠 微機型酸度計 phs-25cw 上海理達儀器廠 高速組織搗碎機 ds-1 上海標本模型廠 冷凍干燥機 ll3000 德國 heto 公司 磁力攪拌器 jb-1b 上海雷磁新涇儀器有限公司 漩渦混合器 xw-80a.h-1 上海精科實業(yè)有限公司 高效液相色譜儀 1100 美國 angilen 公司 超純水機 wp-ro-20 四川沃特爾儀器有限公司 臺式大容量離心機 tdl-5 上海安亭科學儀器廠 高速離心機 mini eppendorf 公司 垂直板電泳槽 dycz-24d 北京六一儀器廠 電泳儀 dyy-8c 北京六一儀器廠 紫外可見分光光度計 uvmini -

28、1240 日本島津公司 凝膠排阻液相色譜柱 tsk-g2000swxl tosoh 公司 酶標儀 multiskan mk3 thermo 公司 倒置生物生物顯微鏡 xsb-1a 中國廣西梧州市學儀器廠 中空纖維膜過濾系統(tǒng) quixstand ge healthcare 中空纖維過濾柱 0.65m ge healthcare 纖維過濾膜堆 100kd ge healthcare 凝膠電泳圖像分析系統(tǒng) jd801 江蘇省捷達科技有限公司 二氧化碳培養(yǎng)箱 heracell150 thermo 公司 雙人凈化工作臺 sw-cj-2d 蘇州凈化設備有限公司 高壓滅菌器 01j2003oa 上海博迅實業(yè)

29、有限公司 第三章實驗方法 3.1 人參多肽的分離純化 3.1.1 人參多肽的提取制備 取本實驗制備的人參總蛋白樣品 100mg，10mm ph7.4 的 pbs 緩沖溶液溶解， 置于截留分子量為 6000-8000da 的醋酸纖維素透析帶中，對 10mm ph6.5 的醋酸 銨緩沖溶液透析， 6000rpm 離心 15min， 沉淀用含 2m 鹽酸胍的 10mm ph7.4 的 pbs 緩沖溶液溶解，經(jīng)截留分子量為 10kd 的中空纖維超濾柱分離，收集外率液， 再經(jīng)截留分子量為 1kd 的中空纖維超濾柱除鹽并濃縮，真空冷凍干燥機凍干，得 人參多肽粗品。 3.1.2 人參多肽的純化 取人參多肽粗

30、品 10mg，用 10mm ph7.4 的 pbs 緩沖溶液溶解，0.22m 濾膜過 濾，經(jīng) sephadex g-75 凝膠柱層析分離，收集洗脫峰。 聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page）檢測 按 3.1.3 項下步驟進行電泳檢測。 3.1.3 高效凝膠過濾色譜（hpgfc）檢測 排阻極限：5-150kd，流動相：20mm 磷酸鹽緩沖溶液含（10mm 硫酸鈉） ，柱 溫：25，流速：0.5 ml/min，檢測波長：280nm。 3.1.4 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(maldi-tof-ms)檢測 將人參多肽純品用去離子水稀釋至約 110-6mol/l，取 10l 此稀釋液，加 入等體

31、積的芥子酸混勻，再加入 1l 的 0.1% 三氟乙酸水溶液混勻。取 1l 此溶液滴于進樣探頭上抽空除去溶劑，使樣品/基質混合物在探頭上形成均勻的結 晶，直接進樣分析。質譜信號為單次掃描累加 50 次，以正離子譜測定。 3.2 人參多肽的活性研究 3.2.1 細胞系 3t3 細胞株； 2bs 細胞株； hep-2 細胞株。 3.2.2 試劑配制 (1)培養(yǎng)基 將一袋 dmem 培養(yǎng)基全部倒入一容器中， 用少量去離子水將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基 洗下，并入容器。加去離子水（水溫 2030）到 950ml，輕微攪拌溶解后， 加入 2.438g 碳酸氫鈉，輕微攪拌溶解，加去離子水至 1l。用 1mol/l 氫氧

32、化鈉溶 液或 1mol/l 鹽酸溶液調 ph 值為 7.2，用 0.2 m 濾膜過濾除菌，4保存。 (2)青、鏈霉素混合液（簡稱 sp液或雙抗液） 青霉素（40 萬 u）5 支，鏈霉素（200 萬 g）1 支，分別溶于 100ml 滅菌去 離子水中或共同溶于 200ml 滅菌去離子水中，混合后分裝小瓶，置-20冰箱保存 備用（1 萬單位 g/ml） 。臨用時，按 1%的量加入培養(yǎng)液中，最后濃度是青霉素 100u/ml，鏈霉素 100 g/ml。 (3)pbs 緩沖液 稱取 0.20g kcl，8.00g nacl，0.20g kh2po4 ,1.56 g，na2hpo4h2o 加去離 子水至

33、1000ml，高壓蒸汽滅菌（121，20min） ，用無菌 nahco3溶液調節(jié) ph 值至 7.27.4，分裝，4保存。 (4) hanks平衡鹽溶液 取 nacl 8.00g，kcl 0.40g，cacl2 0.14g，mgso4 7h2o 0.20g，na2hpo4h2o 0.06g，kh2po4 0.06g，nahco3 0.35g，葡萄糖 1.00g，酚紅 0.02g，加去離子水至 1000ml，高壓蒸汽滅菌（121，20min） ，用無菌 nahco3 溶液調節(jié) ph 值至 7.27.4，分裝，4保存。 (5)d-hanks液 取 nacl 8.00g，kcl 0.40g，na2h

34、po412h2o 0.134g，kh2po4 0.06g，nahco3 0.35g，酚紅 0.02g，加去離子水 1000ml，用 1mol/l hcl 或 naoh 調整 ph 值至 7.3，高壓滅菌（121，20min） ，4保存。 (6)胰酶消化液 500mg 胰蛋白酶粉劑加入 d-hanks溶液至 200ml，完全溶解后，用無菌 nahco3溶液調節(jié) ph 值至 8.0 左右，無菌過濾分裝，-20保存。 3.2.3 傳代細胞培養(yǎng) 從液氮灌中取出凍存管，迅速放入 37的水中 1-2min 使之融化。75%酒精 消毒管口后，旋開凍存管蓋，用吸管吸取細胞懸浮液，注入細胞培養(yǎng)瓶中，用含 10%

35、小牛血清、1%雙抗的 dmem 培養(yǎng)液適當稀釋后，放入 5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6h 后換液一次，以后按常規(guī)進行培養(yǎng)。當細胞生長鋪滿瓶壁后進行傳代，其方法如 下：棄掉舊培養(yǎng)液，加入 0.25%胰酶消化液，消化 2min；吸出或倒掉消化液，加 入適量培養(yǎng)液用吸管輕輕吹打，使細胞懸浮；將懸浮液接種到新的細胞培養(yǎng)瓶中 傳代培養(yǎng)。 3.2.4 樣品配制 人參多肽：無菌稱取 100mg 人參多肽凍干樣，加 20ml pbs 緩沖液溶解，無 菌過濾分裝，-20保存。 3.2.5 mtt 法檢測人參多肽對細胞增殖的影響 將長滿小鼠成纖維細胞 3t3、人胚肺二倍體細胞 2bs、及人喉癌細胞 hep-2 的 細

36、胞培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去，加入 2ml hanks 液洗去殘留培養(yǎng)液及部分死細 胞。加入約 3 ml 0.25的胰蛋白酶液（消化液體積以能覆蓋整個瓶底為準） ，靜 置 2-10 min（倒置顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）,隨著時間的推移，原貼壁的細胞逐漸趨 于圓形。吸去胰蛋白酶液，靜置片刻，加入 5 毫升的培養(yǎng)液終止消化，用吸管反 復吹打瓶壁細胞，使形成細胞懸液，之后再加入 15ml 培養(yǎng)液吹打均勻。單細胞懸 液接種于 96 孔細胞培養(yǎng)板，調細胞密度約為 5105/l， 100l/孔。將加入細 胞的 96 孔板置于 37、5co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4-6h，待細胞貼壁后加入藥物 （人 參多肽樣品， 加入 p

37、h7.4 的 pbs 緩沖溶液溶解，無菌過慮得） 。20l/孔，再補 加培養(yǎng)液 80l/孔，使樣品的終濃度分別為 500 g/ml、50 g/ml、5 g/ml 和 1 g/ml。 設置細胞對照及空白對照，每種樣品設 10 個復孔，對照為不含藥物的 dmem 培養(yǎng)液。37培養(yǎng) 48h 后，每孔加入 20l mtt（5mg/ml ,溶于 ph7.4 的 pbs 緩沖溶液） ，輕輕震蕩后，37繼續(xù)培養(yǎng) 4h 后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入 dmso（180l孔） ，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩，使結晶物溶解。于 multiskan mk3 酶標儀，450nm 波長處測各孔的 od 值，檢測樣品的生物活性

38、。結 果以 xs 表示，數(shù)據(jù)采用 t 檢驗。 第四章 實驗結果 4.1. 人參多肽的分離純化 4.1.1 人參多肽的提取制備 人參總蛋白（100mg）經(jīng)等電沉淀、超濾等步驟處理后，得到人參多肽粗品 （3mg） ，電泳結果如下 1 2 圖 1 人參多肽電泳圖 1、 低分子量標準蛋白（自上而下分子量依次為 97kda、66kda、43kda、31kda、20kda、14kda） 2、人參多肽粗品 4.1.2 人參多肽的 sephadex g-75 層析圖譜 圖 2 人參多肽 sephadex g-75 圖 4.1.3 sds 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 1、低分子量標準蛋白（自上而下分子量依次為 97

39、kda、66 kda、43kda、31kda、20kda、14kda） 2-5、sephadex g-75 洗脫峰 1 圖 3 人參多肽 sephadex g-75 洗脫組分電泳圖 由圖 2、3 可知，人參多肽粗品經(jīng) sephadex g-75 柱層析后，獲得了進一步的 純化，電泳結果顯示為單一條帶。 4.1.4 高效凝膠過濾色譜檢測 圖 4 人參多肽 hpgfc 圖 由圖 4 可知，純化后的人參多肽達到高效液相純。 4.1.5 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(maldi-tof-ms)檢測 圖 5 人參多肽 maldi-tof-ms 圖 由圖 5 高效液相色譜圖可知，人參多肽顯示為單一峰，

40、由圖 5 質譜圖可知， 人參多肽的分子量為 5027da。 4.2 人參多肽的活性研究 4.2.1 人參多肽對 3t3 細胞增殖影響 圖 6 人參多肽對3t3 細胞增殖影響 表 1 mtt 法檢測人參多肽對 3t3 細胞增殖的影響（n =10） 由圖 6 及表 1 可以看出，人參多肽對 3t3 細胞增殖有明顯的促進作用。 組別樣品濃度（gml） 光密度 od（xs） 陰性對照組 0 0.4000.015 實驗組 20 0.4510.011 40 0.5080.009 60 0.5740.014 80 0.6420.012 4.2.2 人參多肽對 2bs 細胞增殖影響 圖 7 人參多肽對 2bs

41、 細胞增殖影響 表 2 mtt 法檢測人參多肽對 2bs 細胞增殖的影響（n =10） 組別 樣品濃度（gml） 光密度 od（xs） 陰性對照組 0 0.2240.015 實驗組 20 0.2270.011 40 0.2420.009 60 0.2330.014 80 0.2180.012 由圖 7 及表 2 可以看出，人參多肽對 2bs 細胞增殖無明顯影響。 4.2.3 對 hep-2 細胞增殖影響 圖 8 人參多肽對 hep-2 細胞增殖的影響 表 3 mtt 法檢測人參多肽對 hep-2 細胞增長的影響（n =10） 由圖 8 表 3 以看出，人參多肽對 hep-2 細胞增殖具有明顯抑

42、制作用。 組別樣品濃度（gml） 光密度 od（xs） 陰性對照組 0 0.5210.012 實驗組 20 0.4720.016 40 0.4380.015 60 0.3820.011 80 0.3310.013 第五章 討 論 5.1 人參多肽的分離純化 蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有 上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（separation） 、提純（purification） 和鑒定（characterization）是生物化學中重要的一部分，至今還沒有單獨或一 套現(xiàn)成的方法能把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，通常采取幾 種方法聯(lián)合使用。

43、 蛋白質的性質與它們的結構密切相關。某些物理或化學因素，能夠破壞蛋白 質的結構狀態(tài)， 引起蛋白質理化性質改變并導致其生理活性喪失。 這種現(xiàn)象稱 為蛋白質的變性。在一定的環(huán)境條件下，蛋白質的一級結構能夠決定二、三、四 級結構。變性蛋白質的二、三、四級結構雖然遭到破壞，但是一級結構仍然保持 不變，因此除去變性劑后，在適當?shù)沫h(huán)境條件下，蛋白質能卷曲折疊成為能量最 低的構象，一般天然蛋白質正是具有這種能量最低的構象，這個過程稱為復性。 蛋白質變性劑的作用是破壞蛋白質的次級鍵，如氫鍵、鹽鍵和疏水力，引起 天然構象的解體；它們并不破壞共價鍵，如肽鍵(注：蛋白質變性過程中二硫鍵也 被破壞，二硫鍵屬于共價鍵)

44、故不涉及一級結構（一般認為，蛋白質的一級結構即 該蛋白質的氨基酸序列）的改變。 變性劑有溶解型和沉淀型兩類，sds、尿素和 胍鹽是有效的溶解型變性劑，而三氯乙酸、甲醇、和氯仿 /異戊醇是有效的沉淀 變性劑。 超濾技術是通過膜表面的微孔結構對物質進行選擇性分離。當液體混合物在 一定壓力下流經(jīng)膜表面時，小分子溶質透過膜（稱為超濾液） ，而大分子物質則被 截留，使原液中大分子濃度逐漸提高（稱為濃縮液） ，從而實現(xiàn)大、小分子的分離、 濃縮、凈化的目的。實際應用中，可選擇不同孔徑的濾膜截留不同分子量的蛋白 質。 在我們的試驗中，選擇了相對分子量為 10kda 的超濾膜。結果表明，大分子 蛋白與小分子蛋白

45、基本可以完全分開。 凝膠過濾是根據(jù)蛋白質分子大小不同而達到分離效果的，凝膠過濾填料中含 有大量微孔，只允許緩沖液以及小分子量蛋白質通過，而大分子蛋白質以及一些 蛋白質復合物被阻擋在外。因此，高分子量的蛋白質在填料顆粒間隙中流動，比 小分子量蛋白更早的被洗脫下來。 最大的蛋白質分子最早流出柱子， 因為它們 在到達柱底前經(jīng)過的體積最??；中等的蛋白質可以進入填料分子中較大的孔內(nèi)， 有最大的通過體積，故最后到達柱底。不同型號的凝膠介質的有效分離范圍是不 一樣的， 我們試驗中選擇的凝膠介質 sephadex g-75 適合于小分子蛋白的分離。 5.2 人參多肽的活性研究 對人參蛋白的研究開始于上世紀 8

46、0 年代末 90 年代初，主要集中于人參蛋白 的提取方法，進入 90 年代中期，由于現(xiàn)代生物技術在中藥領域的廣泛應用，人參 蛋白的活性研究才日益增多。對人參蛋白及多肽的藥理研究表明其在人參的生長、 發(fā)育及生物功能表達等方面都起著重要的作用，主要具有抗脂質分解、抗血紅細 胞聚積、抗真菌、抗病毒、精氨酸酶活性等22-27。但在這些研究中都沒有涉及 人參蛋白對細胞增殖影響及抗衰老活性，因此，我們的研究結果對揭示人參蛋白 的生物功能具有重要意義。 細胞活性檢測是研究蛋白質生物功能的重要手段。細胞活性檢測的方法很多， mtt（噻唑藍）法因其簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫 瘤放射敏感

47、性實驗等69,70。mtt 在琥珀酸脫氫酶和細胞色素 c 的作用下，生成 藍色的甲簪結晶，結晶的生成量僅與活細胞數(shù)目成正比而與死細胞無關。還原生 成的結晶用 dmso 溶解，利用酶標儀測定光密度 od 值。其吸光度值的大小可以反 映活細胞的數(shù)量及代謝活性，因此應用 mtt 比色法可定量測定藥物對細胞的生長 抑制或增殖情況。 hep-2 為人喉癌上皮細胞。人參多肽對 hep-2 增殖具有抑制作用，且呈現(xiàn)一 定量效關系，說明人參多肽可能具有抑制上皮細胞癌生長作用，這進一步表明了 人參具有抗腫瘤作用。3t3 為正常小鼠成纖維細胞，人參多肽對其增殖具有一定 的促進作用，表明人參多肽可能具有促進成纖維細

48、胞生長作用。研究表明，人參 中的皂苷類成分也具有促進成纖維細胞生長的作用。這提示我們，人參皂甙和人 參多肽聯(lián)合使用，應可以更好的發(fā)揮人參抗衰老、增強機體免疫力等藥效作用。 2bs 為人胚肺二倍體細胞，研究中未見人參多肽對其增殖有較明顯的影響。 綜合人參多肽對三種細胞生長的影響，可以看到人參多肽對不同的細胞具有 不同的作用。我們推測，這可能是由于人參多肽首先需要與細胞膜上的不同受體 結合，進而發(fā)揮不同的生理功能。正是由于不同細胞的受體類型不同，造成了人 參多肽對不同細胞作用的不同。本實驗僅是對人參多肽生物功能的初步研究，對 于其抑制或促進細胞增殖的機理尚不很清楚，還有待于進一步研究。 致致 謝謝

49、 經(jīng)過一個多月的忙碌和工作，本次畢業(yè)設計已經(jīng)順利完成，作為一個本科生 的畢業(yè)設計，由于經(jīng)驗的匱乏，難免有許多考慮不周全的地方，如果沒有老師的 督促指導，以及一起工作的同學們的支持，想要完成這個設計是難以想象的。 本文是在陳曉光主任的悉心指導下完成的。承蒙陳主任的親切關懷和精心指 導，雖然有繁忙的工作，但仍抽出時間給予我學術上的指導和幫助，特別是給我 提供了良好的實驗環(huán)境，使我從中受益匪淺。陳主任對學生認真負責的態(tài)度、嚴 謹?shù)目茖W研究方法、敏銳的學術洞察力、勤勉的工作作風以及勇于創(chuàng)新、勇于開 拓的精神是我永遠學習的榜樣。在此，謹向陳主任致以深深的敬意和由衷的感謝。 其次，還要感謝大學四年來所有指

50、導過,教育過我的老師，正是你們不倦的教 誨,使我打下了扎實的專業(yè)基礎；同時還要感謝所有的同學們，正是因為有了你們 的支持和鼓勵，此次畢業(yè)設計才會順利完成。 最后感謝長春工業(yè)大學人文信息學院制藥工程系四年來對我的大力栽培。在 這里，我僅用一句話來表明我無法言語的心情：感謝你！ 由于本人學識能力有限,定有許多不足之處,懇請答辯場各位老師多多指正.同 時,感謝你們?yōu)槲腋冻龅男难?參 考 文 獻 1 竇德強，靳玲，陳英杰.人參的化學成分及藥理活性的研究進展與展望j. 沈陽藥科大學學報，1999,16（2）: 151-156. 2 王紅艷，徐綏緒，陳英杰，等.人參單體成分藥理活性研究的新進展j. 中國

51、藥物化學雜志，1992,2（3）: 73-78. 3 salisa c, westrick, jeanine k. effects of repeated callbacks on response rate andnonresponse biasj.arch pharm,2008,4(1):46-58. 4 gstirnor f and vogt h j. poptidos in white koroan ginsengj. archpharm,1966,299(11):934-940. 5 ando t, muraoka t and yamasaki n. preparation of anti-lopolytic substance from panaxginsengj.planta medic