(完整word版)菌種篩選方法

1、菌種篩選方法在實(shí)際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行。初篩的目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株， 把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來， 使優(yōu)良菌種不致于漏網(wǎng)。因此， 初篩工作以量為主， 測(cè)定的精確性還在其次。 初篩的手段應(yīng)盡可能快速、簡(jiǎn)單。復(fù)篩的目的是確認(rèn)符合生產(chǎn)要求的菌株，所以，復(fù)篩步驟以質(zhì)為主，應(yīng)精確測(cè)定每個(gè)菌株的生產(chǎn)指標(biāo),測(cè)得的數(shù)據(jù)要能夠反映將來的生產(chǎn)水平。1 從菌體形態(tài)變異分析有時(shí)，有些菌體的形態(tài)變異與產(chǎn)量的變異存在著一定的相關(guān)性，這就能很容易地將變異菌株篩選出來。盡管相當(dāng)多的突變菌株并不存在這種相關(guān)性，但是在篩選工作中應(yīng)盡可能捕捉、利用這些直接的形態(tài)特征性

2、變化。當(dāng)然，這種鑒別方法只能用于初篩。有人曾統(tǒng)計(jì)過3,484 個(gè)產(chǎn)維生素B2 的阿舒假囊酵母(Eremotheciumashbyii) 的變異菌落，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)菌株的菌落形態(tài)有以下特點(diǎn)：菌落直徑呈中等大?。?-10 毫米），凡過大或過小者均為低產(chǎn)菌株；色澤深黃色，凡淺黃或白色者皆屬低產(chǎn)菌株。又如，在灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉 (Penicilliumurticae) 的育種中，曾發(fā)現(xiàn)菌落的棕紅色變深者往往產(chǎn)量有所提高，而在赤霉素生產(chǎn)菌藤倉赤霉（Gibberellafujikuroi ）中，卻發(fā)現(xiàn)菌落的紫色加深者產(chǎn)量反而下降。2 平皿快速檢測(cè)法平皿快速檢測(cè)法是利用菌體在特定固體培養(yǎng)基平板上的生理生化反應(yīng)

3、，將肉眼觀察不到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成可見的 形態(tài) 變化。具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等，見圖5.6.1 。這些方法較粗放，一般只能定性或半定量用， 常只用于初篩， 但它們可以大大提高篩選的效率。它的缺點(diǎn)是由于培養(yǎng)平皿上種種條件與搖瓶培養(yǎng)，尤其是發(fā)酵罐深層液體培養(yǎng)時(shí)的條件有很大的差別，有時(shí)會(huì)造成兩者的結(jié)果不一致。圖 5.6.1平皿快速檢測(cè)法示意圖平皿快速檢測(cè)法操作時(shí)應(yīng)將培養(yǎng)的菌體充分分散，形成單菌落，以避免多菌落混雜一起，引起形態(tài) 大小測(cè)定的偏差。1) 紙片培養(yǎng)顯色法 將飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片擱于培養(yǎng)皿中，用牛津杯架空， 下放小團(tuán)浸有 3% 甘油的脫脂

4、棉以保濕， 將待篩選的菌懸液稀釋后接種到濾紙上，保溫培養(yǎng)形成分散的單菌落， 菌落周圍將會(huì)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的顏色變化。 從指示劑變色圈與菌落直徑之比可以了解菌株的相對(duì)產(chǎn)量性狀。 指示劑可以是酸堿指示劑也可以是能與特定產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)生顏色的化合物。2) 變色圈法 將指示劑直接摻入固體培養(yǎng)基中，進(jìn)行待篩選菌懸液的單菌落培養(yǎng)，或噴灑在已培養(yǎng)成分散單菌落的固體培養(yǎng)基表面，在菌落周圍形成變色圈。 如在含淀粉的平皿中涂布一定濃度的產(chǎn)淀粉酶菌株的菌懸液，使其呈單菌落， 然后噴上稀碘液， 發(fā)生顯色反應(yīng)。變色圈越大，說明菌落產(chǎn)酶的能力越強(qiáng)。而從變色圈的顏色又可粗略判斷水解產(chǎn)物的情況。3) 透明圈法 在固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差

5、、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分，造成渾濁、不透明的培養(yǎng)基背景。 將待篩選在菌落周圍就會(huì)形成透明圈， 透明圈的大小反映了菌落利用此物質(zhì)的能力。 在培養(yǎng)基中摻入可溶性淀粉、 酪素或 CaCO3 可以分別用于檢測(cè)菌株產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)蛋白酶或產(chǎn)酸能力的大小。4) 生長圈法 利用一些有特別營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，若待分離的菌在缺乏上述營養(yǎng)物的條件下，能合成該營養(yǎng)物，或能分泌酶將該營養(yǎng)物的前體轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物，那么，在這些菌的周圍就會(huì)有工具菌生長， 形成環(huán)繞菌落生長的生長圈。 該法常用來選育氨基酸、核苷酸和維生素的生產(chǎn)菌。工具菌往往都是對(duì)應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株。5) 抑制圈法 待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生

6、長的物質(zhì)，或能分泌某種酶并將無毒的物質(zhì)水解成對(duì)工具菌有毒的物質(zhì)， 從而在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈。例如：將培養(yǎng)后的單菌落連同周圍的小塊瓊脂用穿孔器取出，以避免其它因素干擾，移入無培養(yǎng)基平皿，繼續(xù)培養(yǎng)4-5 天，使抑制物積累，此時(shí)的抑制物難以滲透到其它地方，再將其移入涂布有工具菌的平板，每個(gè)瓊脂塊中心間隔距離為2 厘米， 培養(yǎng)過夜后， 即會(huì)出現(xiàn)抑菌圈。 抑菌圈的大小反映了瓊脂塊中積累的抑制物的濃度高低。該法常用于抗生素產(chǎn)生菌的篩選， 工具菌常是抗生素敏感菌。由于抗生素分泌處于微生物生長后期，取出瓊脂塊可以避免各菌落所產(chǎn)生抗生素的相互干擾。典型的例子是春雷霉素生產(chǎn)菌的篩選，見圖 5.6

7、.2 。3 搖瓶培養(yǎng)法 搖瓶培養(yǎng)法是將待測(cè)菌株的單菌落分別接種到三角瓶培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，然后， 再對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行分析測(cè)定。搖瓶與發(fā)酵罐的條件較為接近，所測(cè)得的數(shù)據(jù)就更有實(shí)際意義。但是搖瓶培養(yǎng)法需要較多的勞力、設(shè)備和時(shí)間，所以，搖瓶培養(yǎng)法常用于復(fù)篩。但若某些突變性狀無法用簡(jiǎn)便的形態(tài)觀察或平皿快速檢測(cè)法等方法檢測(cè)時(shí)，搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。 初篩的搖瓶培養(yǎng)一般是一個(gè)菌株只做一次發(fā)酵測(cè)定，從大量菌株中選出10-20%較好的菌株，淘汰 80-90% 的菌株；而復(fù)篩中搖瓶培養(yǎng)一般是一個(gè)菌株培養(yǎng)3 瓶，選出 3-5個(gè)較好的菌株，再做進(jìn)一步比較，選出最佳的菌株。4 特殊變異菌的篩選方法上述一般的篩選菌株方法

8、的處理量仍是很大的，為了從存活的每毫升 106 左右細(xì)胞的菌懸液中篩選出幾株高產(chǎn)菌株，要進(jìn)行大量的稀釋分離、搖瓶和測(cè)定工作。 雖然平皿快速檢測(cè)法作為初篩手段可減少搖瓶和測(cè)定的工作量，但稀釋分離的工作仍然非常繁重。 而且有些高產(chǎn)變異的頻率很低，在幾百個(gè)單細(xì)胞中并不一定能篩選到，所以，建立特殊的篩選方法是極其重要的。例如營養(yǎng)缺陷型和抗性突變菌株的篩選有它們的特殊性，營養(yǎng)缺陷型或抗性突變的性狀就象一個(gè)高效分離的篩子 ，以它為篩選的條件，可以大大加快篩選的進(jìn)程并有效地防止漏篩。在現(xiàn)代的育種中， 常有意以它們作為遺傳標(biāo)記選擇親本或在 DNA 中設(shè)置含這些遺傳標(biāo)記的片段，使菌種篩選工作更具方向性和預(yù)見性。

9、本節(jié)還將簡(jiǎn)單介紹其它一些特殊變異株的篩選方法。4.1 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 經(jīng)誘變處理后的菌懸液在篩選前一般應(yīng)先進(jìn)行誘變后培養(yǎng)， 以促使變異細(xì)胞發(fā)生分離，防止出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，篩選出不純的菌株。營養(yǎng)缺陷型的篩選一般包括濃縮、進(jìn)一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。1) 濃縮營養(yǎng)缺陷型菌株誘變后的細(xì)胞群體中大部分存活菌是野生型，而營養(yǎng)缺陷型占的比例相當(dāng)小，這對(duì)分離是很不利的，所以，應(yīng)該淘汰大量的野生型，以達(dá)到濃縮營養(yǎng)缺陷型的目的。常用的濃縮方法有抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法等。2) 進(jìn)一步檢出所需缺陷型濃縮后的菌液中營養(yǎng)缺陷型的比例較大，但并非全部都是。并且營養(yǎng)缺陷型中也有不同的類型，還

10、需要進(jìn)一步檢出所需要的營養(yǎng)缺陷型。這樣就需要采用逐個(gè)檢出法、夾層培養(yǎng)法和限量補(bǔ)給法等方法進(jìn)一步檢出所需要的營養(yǎng)缺陷型。3) 營養(yǎng)缺陷型的鑒定少時(shí)，可用生長譜法，獲得的營養(yǎng)缺陷型菌株還應(yīng)進(jìn)一步確認(rèn)其生長的所需物。若菌株較多時(shí)，常采用組合補(bǔ)充培養(yǎng)基法菌株較4.2 抗性突變菌株的篩選抗性突變株的篩選相對(duì)比較容易，只要有10-6 頻率的突變體存在， 就容易篩選出來。 抗性突變株的篩選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段。1) 一次性篩選法 一次性篩選法就是指在對(duì)出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株。 噬菌體抗性菌株常用此方法篩選。將對(duì)噬菌體敏感的出發(fā)菌株經(jīng)變異處理后的菌懸液大量接

11、入含有噬菌體的培養(yǎng)液中，為了保證敏感菌不能存活， 可使噬菌體數(shù)大于菌體細(xì)胞數(shù)。 此時(shí)出發(fā)菌株全部死亡，只有變異產(chǎn)生的抗噬菌體突變株能在這樣的環(huán)境中不被裂解而繼續(xù)生長繁殖。通過平板分離即可得到純的抗性變異株。耐高溫菌株在工業(yè)發(fā)酵中的應(yīng)用意義在于它可以節(jié)約冷卻水的用量，尤其是在夏季， 并能減少染菌的機(jī)會(huì)。耐高溫菌株所產(chǎn)生酶的熱穩(wěn)定性較高，適用于一些特殊的工藝過程。耐高溫菌株也常采用此法篩選。將處理過的菌懸液在一定高溫下處理一段時(shí)間后再分離。對(duì)此溫度敏感的細(xì)胞被大量殺死，殘存的細(xì)胞則對(duì)高溫有較好的耐受性。耐高濃度酒精的酵母菌的酒精發(fā)酵能力較高，也適宜提高發(fā)酵醪濃度，提高醪液酒精濃度。 而耐高滲透壓的

12、酵母菌株具有積累甘油的性能，可用于甘油發(fā)酵。 耐高酒精度、 高滲透壓的菌株也可分別在高濃度酒精或加蔗糖等造成的高滲環(huán)境下一次性篩選獲得。2) 階梯性篩選法 藥物抗性即抗藥性突變株可在培養(yǎng)基中加入一定量的藥物或?qū)w生長有抑制作用的代謝物結(jié)構(gòu)類似物來一次性篩選， 大量細(xì)胞中少數(shù)抗性菌在這種培養(yǎng)基平板上能長出菌落。但是在相當(dāng)多的情況下，無法知道微生物究竟能耐受多少高濃度的藥物，這時(shí)，藥物抗性突變株的篩選需要應(yīng)用階梯性篩選法。因?yàn)樗幬锟剐猿Ｊ芏辔稽c(diǎn)基因的控制，所以藥物的抗性變異也是逐步發(fā)展的，時(shí)間上是漸進(jìn)的，先是可以抗較低濃度的藥物，而對(duì)高濃度藥物敏感，經(jīng) 馴化 或誘變處理后，可能成為抗較高濃度藥物

13、的突變株。階梯篩選法由梯度平板或紙片擴(kuò)散在培養(yǎng)皿的空間中造成藥物的濃度梯度，可以篩選到耐藥濃度不等的抗性變異菌株， 使暫時(shí)耐藥性不高，但有發(fā)展前途的菌株不致于被遺漏，所以說，階梯性篩選法較適合于藥物抗性菌株的篩選，特別是在暫時(shí)無法確定微生物可以接受的藥物濃度情況下4.3 組成酶變異株的篩選許多水解酶是誘導(dǎo)酶，只有在含有底物或底物類似物的培養(yǎng)環(huán)境中，微生物才會(huì)合成這些酶類， 所以，誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)不僅需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物的種類、 數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。 能迅速利用的碳源（如葡萄糖）往往會(huì)引起酶合成的減少，誘導(dǎo)物有時(shí)又比較昂貴。這些都可能造成這些水解酶工業(yè)生產(chǎn)的波動(dòng)以及生產(chǎn)成本提高。如果控制這

14、些酶合成的調(diào)節(jié)基因發(fā)生了變異，誘導(dǎo)酶就可能轉(zhuǎn)變成組成酶，它的合成與細(xì)胞的其它組織蛋白一樣，不再需要誘導(dǎo)物的存在。 由誘導(dǎo)型的出發(fā)菌株誘變篩選出組成型變異株對(duì)于水解酶的工業(yè)生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法。1) 恒化器法 恒化器常被用于微生物的 馴化 。在培養(yǎng)基中添加不能起誘導(dǎo)作用的低濃度底物， 接入處理后的菌懸液進(jìn)行培養(yǎng)， 此時(shí)出發(fā)菌株由于不能被誘導(dǎo)， 無法合成有關(guān)的誘導(dǎo)酶而不能分解該底物， 從而生長速率極慢， 而群體中少數(shù)組成型變異株則可合成有關(guān)的酶，分解利用該底物，生長速率較快。為了提高組成酶變異株的優(yōu)勢(shì)，即它在群體中的比例，可以應(yīng)用恒化器培養(yǎng)技術(shù)

15、。 隨著恒化器培養(yǎng)中不斷加入新鮮基質(zhì)而逐漸增大組成酶變異株的優(yōu)勢(shì)，這樣就能夠比較容易地做進(jìn)一步的純化分離。2) 循環(huán)培養(yǎng)法 利用不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液， 從而使組成酶變異株得到富集。 當(dāng)接種到不含誘導(dǎo)物而含有其它可利用碳源的培養(yǎng)基中時(shí)，兩種類型菌株同樣能較好地生長，但在此環(huán)境中組成型突變株已能合成有關(guān)的水解酶，而誘導(dǎo)型菌株就不能合成。 進(jìn)而將它們轉(zhuǎn)接入含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中時(shí)，變異株能迅速利用誘導(dǎo)底物進(jìn)行生長繁殖，而誘導(dǎo)型出發(fā)菌株需經(jīng)歷一個(gè)誘導(dǎo)合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步了， 隨著循環(huán)交替培養(yǎng)的繼續(xù)， 組成酶變異株所占的比例將逐漸增大。3)

16、 誘導(dǎo)抑制劑法 有些化合物能阻止某些誘導(dǎo)酶的合成，如 -硝基苯基 - -巖藻糖苷對(duì)大腸桿菌的 -半乳糖苷酶的誘導(dǎo)合成有抑制作用，稱為誘導(dǎo)抑制劑。當(dāng)在誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)抑制劑同時(shí)存在的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)待分離菌群時(shí)，誘導(dǎo)型菌株不能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶， 無法正常生長，只有組成型變異株能夠利用底物進(jìn)行生長繁殖。4.4 高分子廢棄物分解菌的篩選隨著石油化工和塑料工業(yè)的發(fā)展，各種高分子包裝廢棄物日益增多， 這些 白色污染 在自然界很難被消化而進(jìn)入物質(zhì)循環(huán)。設(shè)法選育能分解利用這些高分子材料的微生物對(duì)于環(huán)境保護(hù)至關(guān)重要。這些高分子材料大多是不溶于水的，直接分離具有分解功能的微生物很困難。為此， 有人設(shè)計(jì)了階段式篩選法，首先尋

17、找能在與聚乙二醇結(jié)構(gòu)相似的含兩個(gè)醚鍵的三甘醇上生長的微生物，接著，誘變篩選能分解聚乙二醇的變異株； 或者篩選能以乙二醇、 丙二醇為碳源的菌株，繼而誘變篩選出能利用聚乙二醇等物質(zhì)的變異株。這種由簡(jiǎn)單的聚合物單體入手逐級(jí)篩選高分子廢棄物分解菌也許是一條有效的篩選思路。4.5 無泡沫菌株及高凝聚性菌株的篩選有些菌在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量的泡沫，從而造成發(fā)酵液滿溢， 增大了染菌的機(jī)會(huì)，使發(fā)酵體系反應(yīng)不均勻，也有可能引起某些發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性喪失， 如蛋白酶變性失活。為了避免泡沫的產(chǎn)生，常常需通過犧牲發(fā)酵液的裝量或加入大量的消泡劑來消除泡沫的不利影響。發(fā)酵過程產(chǎn)生泡沫是菌體代謝、培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝等方面的原因造成的， 而菌種是產(chǎn)生泡沫的關(guān)鍵，選育無泡沫或少泡沫菌株可以從根本上解決泡沫問題。有人用氣泡上浮法篩選出了無泡沫的酒精酵母。將變異處理后的菌懸液接種入生長培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)器皿的底部放置無菌壓縮空氣噴口，培養(yǎng)過程中不斷通入