埃博拉出血熱病毒的樣本采集、運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測

1、埃博拉出血熱病毒的樣本采集、運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測浙江省CDC盧亦愚2014年8月主要內(nèi)容n 標(biāo)本采集n 標(biāo)本包裝與運(yùn)送n 實(shí)驗(yàn)室檢測（一）標(biāo)本采集標(biāo)本采集人員的防護(hù)按照2014年8月19日發(fā)布的中國疾病預(yù)防控制中心關(guān)于埃博拉出血熱個(gè)人防護(hù)技術(shù)方案指南（第一版）（試行）的要求，采樣人員應(yīng)穿戴防護(hù)用品包括:n 一次性工作帽n 一次性防滲漏防護(hù)服n 防水靴（或者密閉式、防穿刺防水的鞋加穿一次性鞋套）n 防護(hù)眼罩或防護(hù)面屏n 醫(yī)用防護(hù)口罩（N95及以上）或全面型自吸過濾式呼吸器n 雙層一次性乳膠手套標(biāo)本采集人員的防護(hù)穿戴順序：n步驟1：手衛(wèi)生n步驟2：一次性工作帽（如需要）n步驟3：醫(yī)用防護(hù)口罩（N95及

2、以上）或全面型自吸過濾式呼吸器n步驟4：防護(hù)眼罩或防護(hù)面屏，如選擇全面型自吸過濾式呼吸器時(shí)無需佩戴n步驟5：里層一次性乳膠手套n步驟6：一次性防滲漏防護(hù)服（必要時(shí)，可加穿防水圍裙）n步驟7：外層一次性乳膠手套n步驟8：防水靴或防水靴套（或者密閉式、防穿刺防水的鞋加穿一次性鞋套）標(biāo)本采集人員的防護(hù)脫摘順序：n步驟1：外層一次性乳膠手套n步驟2：防水靴或防水靴套（或者密閉式、防穿刺防水的鞋加穿一次性鞋套）n步驟3：內(nèi)層手套消毒n步驟4：一次性防滲漏防護(hù)服（需要時(shí)，先脫防水圍裙）n步驟5：內(nèi)層手套消毒n步驟6：防護(hù)眼罩或防護(hù)面屏n步驟7：醫(yī)用防護(hù)口罩（N95及以上）或全面型自吸過濾式呼吸器n步驟8：

3、一次性工作帽（如需要）n步驟9：里層一次性乳膠手套n步驟10：手衛(wèi)生標(biāo)本采集n 按照埃博拉出血熱防控方案（第二版）規(guī)定，定點(diǎn)醫(yī)院負(fù)責(zé)病例的標(biāo)本采集工作n 根據(jù)流行病學(xué)史、癥狀等判別結(jié)果，采集留觀病例、疑似病例和確診病例的標(biāo)本n 目前僅需采集血液標(biāo)本，大小便、唾液和組織也可用于檢測標(biāo)本采集n 用分離膠無菌真空促凝管采集靜脈血，每管3mL，標(biāo)記后4保存，填寫標(biāo)本采集登記表n 留觀病例、疑似病例采集4管，其中2管盡快送省疾控中心實(shí)驗(yàn)室，2管保存于樣本采集單位，待排除埃博拉病毒感染后用于其它病原體的篩查（二）標(biāo)本包裝與運(yùn)送標(biāo)本包裝、運(yùn)送n 按照可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定

4、要求運(yùn)輸至具有從事埃博拉病毒相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室n 標(biāo)本應(yīng)當(dāng)置于符合國際民航組織規(guī)定的A類包裝運(yùn)輸材料之中n 低溫冷藏運(yùn)輸，避免反復(fù)凍融標(biāo)本包裝、運(yùn)送n A類包裝，符合UN2814要求，按照三重包裝系統(tǒng)包裝：第一層包裝（可密封樣本袋、50mL離心管等）；第二層安全殼容器（防水、防漏）；外層運(yùn)輸包裝組成n 樣本袋放入防水防漏的第二層安全殼容器中，為降低破碎或泄漏的風(fēng)險(xiǎn)，用吸水紙等填充物固定標(biāo)本袋。安全殼容器和外包裝之間放冰袋n 不要打開采集管或分裝樣本n 不要離心分離血清標(biāo)本包裝、運(yùn)送（三）實(shí)驗(yàn)室檢測實(shí)驗(yàn)室檢測的生物安全要求實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)和血清學(xué)檢測相關(guān)活動(dòng)嚴(yán)格按照人間傳染的病原微生物名錄的要

5、求，在相應(yīng)的生物安全級(jí)別實(shí)驗(yàn)室開展。n 病毒培養(yǎng)在BSL-4實(shí)驗(yàn)室n 動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)在ABSL-4實(shí)驗(yàn)室n 未經(jīng)培養(yǎng)的感染材料的操作在BSL-3實(shí)驗(yàn)室n 滅活材料的操作在BSL-2實(shí)驗(yàn)室n 無感染性材料的操作在BSL-1實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)人員個(gè)人防護(hù)n口罩、帽子、防滲漏防護(hù)服、乳膠手套、高筒鞋套、防護(hù)面罩（正壓頭盔）等；注：手套、防護(hù)服大小要合適，檢查有無破漏；手套的量要充足，滿足隨時(shí)更換。n所有涉及感染性材料的操作均應(yīng)在BSL-3實(shí)驗(yàn)室二級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行；n方便取用的消毒劑（0.5%次氯酸鈉溶液、75%酒精等），空間噴霧消毒設(shè)備（使用過氧乙酸，過氧化氫等）。埃博拉出血熱病毒實(shí)驗(yàn)室檢測n 實(shí)驗(yàn)室

6、檢測（1）病毒抗原陽性（2）血清特異性IgM抗體陽性（3）恢復(fù)期血清特異性IgG抗體滴度比急性期有4倍以上升高（4）從患者標(biāo)本中檢出埃博拉病毒RNA（5）從患者標(biāo)本中分離到埃博拉病毒n 診斷 疑似病例基礎(chǔ)上具備診斷依據(jù)中實(shí)驗(yàn)室檢查任一項(xiàng)檢測陽性者檢測內(nèi)容目前省疾控中心實(shí)驗(yàn)室報(bào)送審批的檢測項(xiàng)目包括：n 埃博拉病毒核酸檢測n 抗埃博拉病毒IgM、IgG抗體檢測標(biāo)本處理與保存n 省疾控中心在BSL-3實(shí)驗(yàn)室盡快分離血清，離心時(shí)使用有密封蓋的離心桶或轉(zhuǎn)頭進(jìn)行標(biāo)本離心，應(yīng)在生物安全柜內(nèi)打開離心轉(zhuǎn)頭放入或取出裝有標(biāo)本的離心管n 分離的血清標(biāo)本長期保存應(yīng)置于-70以下，保存不超過1周可置-20實(shí)驗(yàn)操作的生物

7、安全要求n核酸提取時(shí)，加入核酸提取裂解液后，可在加入核酸提取裂解液后，可在BSL-2BSL-2及及以上實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行以上實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。血清學(xué)檢測時(shí)，應(yīng)先601小時(shí)滅活，滅活材料免疫學(xué)檢測應(yīng)在生物安全3級(jí)（BSL-3）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行n在進(jìn)行感染性材料操作時(shí)，每次標(biāo)本份數(shù)不宜過多，每份標(biāo)本量不宜過大 核酸檢測n 是目前早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)埃博拉出血熱病例的主要檢測方法n 采用熒光定量 PCR 進(jìn)行病毒核酸檢測，患者標(biāo)本中擴(kuò)增到特異性核酸，可確診埃博拉病毒感染n 傳統(tǒng)RT-PCR因易出現(xiàn)污染使用受限，但可以獲得病毒基因序列核酸檢測n 發(fā)病后3天內(nèi)，血標(biāo)本中埃博拉病毒核酸檢出率低，檢測陰性不能排除埃博拉病毒感染

8、，應(yīng)結(jié)合病例的流行病學(xué)史和臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合判斷n 發(fā)病后310天血標(biāo)本病毒核酸檢出率高，檢測陰性可排除埃博拉病毒感染。酶標(biāo)檢測n 病毒抗原檢測：用酶聯(lián)免疫法檢測埃博拉病毒核蛋白抗原。病毒抗原檢測陽性可確診。n 血清特異性IgM抗體：采用捕獲法ELISA方法檢測。疑似病例具有疫區(qū)旅行史或患者接觸史，IgM抗體陽性，可確診，陰性不排除埃博拉病毒感染。n 血清特異性IgG抗體：目前主要采用間接法ELISA或免疫熒光方法檢測IgG抗體。單份血清埃博拉病毒IgG抗體陽性為曾感染埃博拉病毒，雙份血清埃博拉病毒IgG抗體陽轉(zhuǎn)或恢復(fù)期滴度較急性期4倍或者以上增高者，可確診，陰性不排除埃博拉病毒感染。核酸檢測流

9、程圖反應(yīng)體系混合物正、反向引物混合物特異性熒光探針1) 核酸分離，BSL-3BSL-32) Real-time PCR 檢測20 l5 l反應(yīng)條件取決于病原體特異性PCR儀合適的PCR管引物/探針序列引物探針1ZEBOV-FCGCCGAGTCTCACTGAATCTGZEBOV-RAGTTGGCAAATTTCTTCAAGATTGTZEBOV-PFAM-CGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTATCAAGTAA-BHQ1引物探針2EBOGP1D-fwdTGGGCTGAAAAYTGCTACAATC EBOGP1D-revCTTTGTGMACATASCGGCAC EBOGP1DZ-PrbFAM-C

10、TACCAGCAGCGCCAGACGG-BHQ1RNA模板5l，酶（25x）1l，緩沖液12.5l，引物（10uM）各1l，探針（10uM）0.5l，加水至總體積25l。推薦反應(yīng)條件為5030min，9510min，9515s、6045s反應(yīng)40個(gè)循環(huán) 。結(jié)果判斷：以定量熒光PCR反應(yīng)的前315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為本底信號(hào)，以本底信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍作為熒光閾值，標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號(hào)達(dá)到熒光閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值（Ct值），以Ct35熒光信號(hào)數(shù)據(jù)線性化處理后對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)生成的曲線圖成“S”形的標(biāo)本，可判斷為相應(yīng)的埃博拉病毒核酸檢測陽性。實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法ZEBOV y=-3.469

11、x+39.75 R2=0.999SEBOV y=-3.533x+38.41 R2=1.000CEBOV y=-3.478x+38.87 R2=0.999 ZEBOV y=-3.540 x+39.69 R2=1.000REBOV y=- 3.509x+38.54 R2=0.999BEBOV y =-3.470 x+38.75 R2=1.0002套實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法檢出限50100拷貝體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品1套引物探針序列與目前西非流行株一致；1套采用兼并引物，與目前西非流行株差別2個(gè)堿基，但理論上不影響檢測。引物引物 序列序列 大小大小 方法1EBVGP451-472 F5-TGGGCTGAAAACTGCTACAATC-3EBVGP 1024-1003R5-TTTTAGTTTCCCAGAAGGCCCA-3570bp方法2Filo-A1ATCGGAATTTTTCTT