細胞生物學實驗方法及時間統(tǒng)籌安排的改進

1、細胞生物學實驗方法及時間統(tǒng)籌安排的改進引 言以細胞生物學實驗為代表的生物學實驗教學中，存在知識點多、技術操作要點多，課時有限等具體問題。如何在有限的課時內，既完成大綱要求的教學任務，又激發(fā)學生的學習熱情、培養(yǎng)學生綜合分析解決實際問題的能力和科學思維，就成為現(xiàn)代生物學實驗教學及教學改革的重要內容及方向。細胞生物學是一門實驗性很強的學科，也是生命科學領域中重要的基礎課程，學生通過細胞生物學課程了解細胞結構及細胞活動的基本規(guī)律，細胞生物學理論課與實驗課密不可分。細胞生物學實驗課既是理論課程的驗證和補充，又是培養(yǎng)學生創(chuàng)新能力、獨立思考能力、分析解決問題能力的重要手段。而細胞生物學實驗專業(yè)性較強，只有在

2、順利完成基礎實驗培訓之后，才有可能作進一步的設計創(chuàng)新實驗及科研性實驗，這就要求我們合理分配基礎性實驗與設計創(chuàng)新實驗、科研性實驗各部分的時間，充分提高時間利用率，使學生得到更多的獨立動手機會，提高其獨立思考、分析解決問題的能力。筆者結合細胞生物學實驗課的教學實踐，對實驗方法及時間統(tǒng)籌安排等方面進行了改進，希望通過本實驗課教學，使學生在相對較短的時間內掌握基本的細胞生物學實驗技術，增強學生對理論課知識的理解，為接下來的設計創(chuàng)新實驗及研究性實驗打下基礎。1 統(tǒng)籌安排實驗時間我院細胞生物學實驗教學任務繁重，每學期 64 學時，參與實驗的本科生人數(shù)近 200 人，分 6 組進行，每組需要做: 培養(yǎng)技術、

3、切片機使用技術; 倒置顯微鏡的使用技術; 植物組織培養(yǎng); 石蠟切片; 細胞內多糖觀察; 細胞內核酸觀察; 雞血紅細胞的融合實驗等多個實驗項目。我們曾經(jīng)將每一部分分開進行( 見圖 1) ，雖然這樣可以避免各實驗項目之間的相互干擾，減少錯誤發(fā)生率，但是會大大延長實驗時間，學生完成實驗需 7 天。由于實驗時間分配不合理，有時學生忙的不可開交，不能很好掌握實驗內容; 有時卻又無事可做，使學生產(chǎn)生厭煩情緒，對實驗效果影響頗大。為此，我們將其中的部分實驗進行整合，將實驗分 3 天進行( 見圖 2) : 第 1 天，進行儀器設備及相關技術培訓，動物處死，組織切取及固定( 過夜) ; 第 2 天，進行植物傷愈

4、組織培養(yǎng)、石蠟切片實驗的脫水、透蠟、包埋( 過夜) 、動物細胞融合; 第 3 天，進行石蠟切片實驗的切片、展片、烘干、復水、HE 染色與福爾根染色、PAS 染色。但是由于實驗時間限制，展片后烘干時間較短( 1 至 2 h) ，為避免在復水、染色步驟組織切片的丟失，學生往往利用酒精燈外焰對載玻片上的蠟帶進行較長時間的展片操作，往往會造成蠟帶熔化和組織破壞，學生很難針對展片程度進行準確判斷，進而影響實驗的成功率和效果。為了避免上述問題，學生通常會反復向教師詢問，是否可以進行下一步操作，不僅大大增加了實驗教師的工作量，而且來自教師多次否定的回答，使學生產(chǎn)生較強的挫敗感，降低了對實驗的興趣。針對以上問

5、題，我們對實驗中的限速步驟進行了改進，縮短了操作時間，進而使展片、烘干操作提至前1 天，然后過夜，充分延長烘干時間，下文將對實驗方法改進進行進一步闡述。另外，原來動物細胞融合實驗安排在石蠟切片之后進行，學生觀察到的細胞融合率非常低，經(jīng)過分析，我們認為細胞融合率低的原因主要是由于融合時間比較短，于是對實驗時間進行調整，將動物細胞融合安排在石蠟切片實驗中間( 從脫水到包埋步驟之間) ，具體時間由學生自主統(tǒng)籌。這樣在石蠟切片實驗過程中，學生可以隨時觀察細胞融合結果，感興趣的學生還可以在實驗教師的引導下，看到動物細胞融合狀態(tài)隨時間的變化，可以自主設計研究動物細胞融合實驗中PEG 添加量、融合溫度對實驗

6、結果的影響，可以進行融合率與時間關系的研究，在不增加實驗投入前提下，使學生能夠得到在同一實驗進程中從多角度多層次進行分析的訓練，提高了學生的實驗興趣與科研能力。2 改進實驗方法石蠟切片實驗是細胞生物學實驗的重要部分，迄今為止石蠟切片仍然是疾病診斷，尤其是病變性質判斷的重要手段。實驗中涉及到斷頭處死小鼠，剖開腹腔，取出組織，沖洗，修切成小塊，加入固定液進行固定，各級乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，染色，顯微鏡下觀察等多個操作步驟，每一步操作都會對結果造成至關重要的影響，要求操作者具有很好的實驗技巧，對于某些步驟( 如包埋) ，不得不由實驗教師進行演示實驗，而學生不能參與，造成學生動手能力

7、得不到提高，因此我們把其中某些步驟操作進行改進，使其更適宜學生操作，讓學生更多的參與到實驗中，動手動腦，不僅提高學生實驗技能，而且使他們具有分析問題、解決問題的意識，提高其獨立研究能力。石蠟切片過程中，最易受操作人員實驗技術影響的步驟是浸蠟、包埋，而且包埋效果直接影響到實驗結果的好壞。原來本科學生浸蠟、包埋部分操作成功率僅為 10% 16%，甚至更低，不僅大大降低整體實驗的速度、延長實驗時間，而且由于大量重復操作，很容易造成學生產(chǎn)生厭煩情緒，對實驗失去信心。已經(jīng)有相關研究人員對常規(guī)石蠟切片方法進行了研究，并取得了較好的效果。中國科學技術大學的楊捷頻提到在夏季、冬季分別選擇高熔點( 58 60

8、) 高硬度的蠟和選擇低熔點( 54 56 ) 低硬度的蠟，并且不同組織采用硬度不同的蠟。但是在本科教學實驗中我們試用之后效果并不明顯，這可能與本科生實驗操作技術的熟練程度有關，所以進一步發(fā)掘新的實驗技術改進，降低這一操作的技術門檻，除了對相關研究人員具有一定的輔助意義外，對本科生石蠟切片實驗教學就顯得尤為重要; 彎雪燕等自制鐵皮包埋盒，利用這一改進實驗設備，取得了較好的效果，但是該設備改造僅適用于小規(guī)模應用，不適于 40 人甚至更多人同時參與的本科生實驗，而如果擴大設備規(guī)模，則會增加實驗成本。經(jīng)過了多次實驗改進探索，試圖降低這一實驗步驟的技術門檻，提高操作的成功率，先后進行了下面 4個實驗:

9、烘箱或培養(yǎng)箱輔助蠟盒包埋，我們分別采用電烘箱和培養(yǎng)箱，保證石蠟的溫度，這樣做雖然保證了操作的成功率，但是由于參與實驗學生較多，頻繁開關設備的門，對這類儀器設備損耗較大; eppendorf 管直接包埋，我們用水浴鍋在 4 5 mL eppendorf 管中直接進行浸蠟、包埋，待蠟凝固后，破壞 eppendorf 管，取出管內的蠟塊，但是這樣得到的蠟塊是圓柱形，不僅給修蠟造成麻煩，而且由于修蠟除去的部分較多，組織也易丟失; 水浴鍋邊緣熱臺蠟盒包埋，在恒溫水浴中化蠟，把蠟盒放在水浴鍋邊沿，以提高包埋盒內外溫度，盡量縮短浸蠟、包埋之間的時間間隔，保證溫度變化較小，但是由于實驗中操作人員較多，水浴鍋邊

10、沿較窄，容易因操作人員間的相互擁擠，使包埋盒落水，造成實驗的頻繁失誤和失敗; 浮漂熱臺蠟盒包埋，經(jīng)過多次探索，我們采用在 4 5 mL eppendorf 管中裝入 2至3 mL 石蠟對樣品進行最后一步浸蠟，利用浮漂使其漂浮在恒溫水浴鍋中，同時在裝載了樣品的 eppendorf管上部配以較重的器物，保證裝載樣品的 eppendorf 管全部浸入并漂浮在60 水浴鍋中，同時另取一個浮漂放在此水浴鍋中，把容積為2 至3 mL 的包埋盒放在浮漂上，待浸蠟結束后，馬上將樣品管中的樣品和熔蠟倒于包埋盒中，此時樣品在包埋盒內部處于接近凝固的固液混合態(tài)，可以利用浸泡在同溫度下的蠟缸內取出的牙簽對目的樣品組織

11、進行位置調整，最后從浮漂上取出蠟盒，將蠟盒置室溫、冷卻，整個過程一氣呵成，有效避免了浸蠟、包埋過程中的溫度變化，提高了操作成功率，而且可以手動調整樣品組織的位置，避免了組織位置不適對下一步的修蠟造成的影響，保證了切片質量。經(jīng)過對 197 名本科學生的教學實踐證明，實驗方法改進后學生操作成功率由原來的 10 16%，提高到83 91% ，實驗操作時間由原來的 4 至 5 h 縮短為 1至2 h，此方法具有操作簡單、經(jīng)濟實用、節(jié)能低耗等優(yōu)點，又能充分保證和改善包埋質量，提高工作效率，大幅度縮短實驗時間，在后續(xù)的切片及染色實驗中證明新方法制得的組織包埋蠟塊具有與傳統(tǒng)方法相同或者相近的實驗效果，更為重

12、要的是，新方法的使用避免了樣品組織沉浸在蠟塊底部、樣品組織在蠟塊中排布取向不合理、樣品組織周圍存在空洞等常見問題的出現(xiàn)。另外在實驗時間由 4 至 5 h 縮短為 1 至 2 h 的基礎上，我們將實驗時間進行進一步調整( 見圖 3) ，將原來第 3 天實驗內容中的切片、展片、烘干操作調整至第2 天實驗內容中，新的第 2 天實驗內容為: 植物傷愈組織培養(yǎng)、動物細胞融合、石蠟切片實驗的固定、脫水、透蠟、包埋、切片、展片、烘干( 過夜) 。這一調整的意義在于可以提高蠟帶在載玻片上的固定程度，避免在復水、HE 染色與福爾根染色、PAS 染色等實驗步驟中組織切片的丟失。我們改造了包埋技術后，調整實驗時間，

13、使得烘干時間由過去的 1 至 2 h 延長為 10 h 以上( 過夜) ，這將極大地提高蠟帶的固著程度，降低外焰展片操作對學生帶來的實驗失敗、技術困窘與厭煩情緒，實驗成功率提高和實驗效果改善也極大地激發(fā)了學生的學習和獨立操作興趣。3 結 語筆者針對石蠟切片實驗教學過程中存在的問題，對包埋方法進行改進，在不增加實驗成本基礎上，使實驗成功率大幅度增加、縮短實驗時間、提高工作效率、保證包埋質量、獲得質量較好的切片。在此基礎上，統(tǒng)籌安排細胞生物學實驗教學時間，使得學生通過自主時間統(tǒng)籌，將動物細胞融合實驗和石蠟組織切片實驗的實驗時間有機的穿插起來，使整個細胞生物學實驗教學時間安排更加合理，有效減少學生重

14、復操作次數(shù)，提高實驗成功率。在不增加實驗投入的前提下，使得學生能夠在有限的時間內獲得對同一實驗進程從多角度多層次進行分析的訓練，使得學生嘗試并掌握了自主統(tǒng)籌安排實驗時間的實驗技巧，提高了學生的實驗興趣與科研能力，為發(fā)展學生創(chuàng)新思維能力，進一步獲取和創(chuàng)造新知識打下基礎。參考文獻( References) :1 吳 瑩 細胞生物學實驗教學改革J 實驗室研究與探索，2010，29( 7) : 262-263WU Ying Teaching reform on experiments of the cytobiology courseJ Research and Exploration in Labo

15、ratory，2010，29( 7) : 262-2632 閆曉梅 細胞生物學實驗教學改革中的一些探索J 實驗室研究與探索，2012，31( 10) : 352-355YAN Xiao-mei Reform of cell biology experimental teachingJResearch and Exploration in Laboratory，2012，31( 10) : 352-3553 張盛周 細胞生物學實驗教學的改革J 實驗室研究與探索，2009，28( 5) : 107-108ZHANG Sheng-zhou Discussion on the reform of th

16、e experimentalteaching of cell biology under the new situationJ Research andExploration in Laboratory，2009，28( 5) : 107-1084 滕利榮 生物學基礎實驗教程M 3 版 北京: 科學出版社，20085 滕利榮 生命科學儀器使用技術教程M 北京: 科學出版社，20086 滕利榮 生物學基礎實驗教程M 吉林: 吉林科學技術出版社，19997 滕利榮 生命科學基礎實驗教程M 吉林: 吉林科學技術出版社，20018 莫晚莉 手術中快速石蠟切片病理診斷的臨床意義J 實用醫(yī)技雜志，2012，19( 4) : 421-4229 方捷迪 改良術中快速石蠟切片技術的應用J 實用醫(yī)技雜志，2011，18( 11) : 1205-120610 彎雪燕 常規(guī)石蠟切片中浸