實(shí)驗(yàn)一——雞胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

1、第一講第一講 雞胚成纖維單層細(xì)胞的制備雞胚成纖維單層細(xì)胞的制備與培養(yǎng)與培養(yǎng)預(yù)防獸醫(yī)微生物組預(yù)防獸醫(yī)微生物組實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1.掌握無(wú)菌操作技術(shù)掌握無(wú)菌操作技術(shù)2.2.掌握細(xì)胞培養(yǎng)所需的儀器、設(shè)備掌握細(xì)胞培養(yǎng)所需的儀器、設(shè)備 3.3.了解細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)理論了解細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)理論4.4.掌握雞胚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)技術(shù)掌握雞胚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)背景實(shí)驗(yàn)背景 原代細(xì)胞培養(yǎng)因具有細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，具備二倍體的遺傳性、來(lái)源方便等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)、細(xì)胞分化、藥物測(cè)試等試驗(yàn)。在禽類原代細(xì)胞培養(yǎng)中，雞胚成纖維細(xì)胞(chickenembryo fibroblast，CEF)得到

2、普遍應(yīng)用。CEF的培養(yǎng)是在一定的條件下，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，使從體內(nèi)取出的成纖維組織細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和傳代，并維持原有組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特性。與其他細(xì)胞相比，CEF相對(duì)容易獲得，而且增殖能力強(qiáng)，適應(yīng)性強(qiáng)，具有良好的耐受性，性狀比較穩(wěn)定，不易發(fā)生轉(zhuǎn)化，所以被廣泛地應(yīng)用于分子和細(xì)胞生物學(xué)研究，以及疫苗的生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)材料l預(yù)加預(yù)加10%FCS和雙抗的和雙抗的1640培養(yǎng)液；培養(yǎng)液；消化液消化液(0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶- 0.02%EDTA溶液溶液)；D-Hanks平衡鹽溶液；平衡鹽溶液；l滅菌培養(yǎng)皿、青瓶、細(xì)胞培養(yǎng)瓶各滅菌培養(yǎng)皿、青瓶、細(xì)胞培養(yǎng)瓶各1個(gè)；個(gè)；l巴氏吸管若干支、紗布若干；眼科鑷巴

3、氏吸管若干支、紗布若干；眼科鑷1把，剪把，剪刀刀1把；把；l碘酒，碘酒，75酒精棉球；酒精燈酒精棉球；酒精燈1臺(tái)；廢液缸。臺(tái)；廢液缸。實(shí)驗(yàn)設(shè)備實(shí)驗(yàn)設(shè)備（1） 37-CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱（2）倒置顯微鏡）倒置顯微鏡（3）超凈臺(tái)）超凈臺(tái)實(shí)驗(yàn)步驟 1.取胚取胚 選擇選擇9-11日齡雞胚日齡雞胚于蛋架上，先后用碘酒和于蛋架上，先后用碘酒和75%酒精消毒酒精消毒氣室部外殼氣室部外殼。用無(wú)菌眼科鑷子擊破該部用無(wú)菌眼科鑷子擊破該部位的蛋殼和卵膜，撕破尿位的蛋殼和卵膜，撕破尿囊膜和羊膜，并輕輕囊膜和羊膜，并輕輕夾住夾住雞胚頸部雞胚頸部取出雞胚，放入取出雞胚，放入無(wú)菌平皿中。無(wú)菌平皿中。 1氣室氣室 2卵殼卵殼

4、3卵黃囊卵黃囊 4卵白卵白 5 尿囊腔尿囊腔 6絨毛尿囊絨毛尿囊 7胚胎胚胎 8羊水腔羊水腔 9胚胎外腔胚胎外腔 2. 剪碎剪碎 用滅菌剪刀剪去雞胚頭部、腿部、翅膀和內(nèi)用滅菌剪刀剪去雞胚頭部、腿部、翅膀和內(nèi)臟，留下軀干組織。用臟，留下軀干組織。用D-HanksD-Hanks液沖洗，除去血液后液沖洗，除去血液后移入滅菌青瓶中，用滅菌剪刀盡量剪碎（移入滅菌青瓶中，用滅菌剪刀盡量剪碎（1mm1mm3 3小塊），小塊），再再用用D-HanksD-Hanks沖洗沖洗2 2次直至組織發(fā)白為止，然后將洗液次直至組織發(fā)白為止，然后將洗液上清吸棄。上清吸棄。 3.酶消化酶消化 根據(jù)雞胚組織塊的多少，加入大約根據(jù)

5、雞胚組織塊的多少，加入大約4 4倍量的倍量的胰酶胰酶(5-6mL)(5-6mL)，于，于3737溫箱內(nèi)消化溫箱內(nèi)消化15-20min15-20min，視其組，視其組織碎塊變松散（織碎塊變松散（聚合成一團(tuán)、邊緣毛樣模糊聚合成一團(tuán)、邊緣毛樣模糊）即可）即可。輕輕吸出消化液，用輕輕吸出消化液，用D-HanksD-Hanks洗洗1-31-3次。次。 4.吹打吹打 加適量加適量16401640營(yíng)養(yǎng)液，用巴氏吸管反復(fù)吹吸數(shù)次，營(yíng)養(yǎng)液，用巴氏吸管反復(fù)吹吸數(shù)次，使細(xì)胞分散，制成細(xì)胞懸液。靜置使細(xì)胞分散，制成細(xì)胞懸液。靜置1 1分鐘，使未沖散分鐘，使未沖散的組織塊沉淀，吸出細(xì)胞懸液于的組織塊沉淀，吸出細(xì)胞懸液于

6、20mL 20mL 營(yíng)養(yǎng)液中。重營(yíng)養(yǎng)液中。重復(fù)復(fù)3 3次收集細(xì)胞懸液，直至雞胚發(fā)白為止。次收集細(xì)胞懸液，直至雞胚發(fā)白為止。 將紗布置于細(xì)胞瓶口，用吸管吸取細(xì)胞懸液濾過(guò)至細(xì)將紗布置于細(xì)胞瓶口，用吸管吸取細(xì)胞懸液濾過(guò)至細(xì)胞瓶中（注意不要將懸液溢出）。胞瓶中（注意不要將懸液溢出）。 5.培養(yǎng)培養(yǎng) 于于37-CO37-CO2 2溫箱內(nèi)培養(yǎng)。溫箱內(nèi)培養(yǎng)。24-48h24-48h后可長(zhǎng)成單層后可長(zhǎng)成單層細(xì)胞。細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、觀察原代細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀況；、觀察原代細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀況；2、如出現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液渾濁情況，請(qǐng)鑒別是否細(xì)、如出現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液渾濁情況，請(qǐng)鑒別是否細(xì)菌污染。菌污染。注意事項(xiàng)注意事

7、項(xiàng) 1. 切割組織塊時(shí)務(wù)必要切成小塊切割組織塊時(shí)務(wù)必要切成小塊2. 整個(gè)操作過(guò)程要嚴(yán)格保持無(wú)菌整個(gè)操作過(guò)程要嚴(yán)格保持無(wú)菌3.嚴(yán)格控制胰酶消化時(shí)間嚴(yán)格控制胰酶消化時(shí)間 4. 放入孵箱前應(yīng)在培養(yǎng)瓶表面標(biāo)明細(xì)胞名稱、日期和放入孵箱前應(yīng)在培養(yǎng)瓶表面標(biāo)明細(xì)胞名稱、日期和組別組別 5. 實(shí)驗(yàn)用品放回原處，擺放整齊實(shí)驗(yàn)用品放回原處，擺放整齊無(wú)菌操作的一般要求l用用75酒精擦拭消毒雙手。酒精擦拭消毒雙手。l超凈臺(tái)臺(tái)面應(yīng)整潔，用超凈臺(tái)臺(tái)面應(yīng)整潔，用0.1新潔爾滅擦凈。新潔爾滅擦凈。l打開(kāi)超凈臺(tái)的紫外燈照射臺(tái)面打開(kāi)超凈臺(tái)的紫外燈照射臺(tái)面30min左右。使用左右。使用超凈臺(tái)時(shí)，打開(kāi)風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。超凈臺(tái)時(shí)，打開(kāi)風(fēng)

8、機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。l嚴(yán)格在酒精燈無(wú)菌范圍之內(nèi)操作。嚴(yán)格在酒精燈無(wú)菌范圍之內(nèi)操作。l使用巴氏吸管以及其他吸管時(shí)，取出后要手拿末使用巴氏吸管以及其他吸管時(shí)，取出后要手拿末端安上橡皮頭后，過(guò)酒精燈火焰略燒后插在無(wú)菌端安上橡皮頭后，過(guò)酒精燈火焰略燒后插在無(wú)菌鹽水瓶或試管內(nèi)。鹽水瓶或試管內(nèi)。l操作時(shí)，嚴(yán)禁說(shuō)話，盡量不用手直接拿無(wú)菌的物操作時(shí)，嚴(yán)禁說(shuō)話，盡量不用手直接拿無(wú)菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如鑷子等去拿。品，如瓶塞等，而要用器械，如鑷子等去拿。 l不能用手接觸瓶口、吸管口以及鑷子和剪刀的頭不能用手接觸瓶口、吸管口以及鑷子和剪刀的頭部。部。l拔出瓶塞、塞上瓶塞時(shí)瓶口和塞子要灼燒；傾拔出瓶塞、塞上瓶塞時(shí)瓶口和塞子要灼燒；傾倒液體前后都要灼燒瓶口，并且瓶口向下，低倒液體前后都要灼燒