食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)GB4789.2-2010菌落總數(shù)測(cè)定

1、一、設(shè)備和材料一、設(shè)備和材料二、培養(yǎng)基和試劑二、培養(yǎng)基和試劑三、檢驗(yàn)程序三、檢驗(yàn)程序四、操作步驟四、操作步驟五、結(jié)果與報(bào)告五、結(jié)果與報(bào)告 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：材料如下：(1) 恒溫培養(yǎng)箱：恒溫培養(yǎng)箱：36 1 ，30 1 。(2) 冰箱：冰箱：2 5 。(3) 恒溫水浴箱：恒溫水浴箱：46 1 。(4) 天平：感量為天平：感量為 0.1 g。(5) 均質(zhì)器。均質(zhì)器。(6) 振蕩器。振蕩器。(7) 無(wú)菌吸管：無(wú)菌吸管：1 mL（具（具 0.01 mL 刻度）、刻度）、10 mL（具（具 0.1 mL 刻度）或微量移

2、液器及吸頭?？潭龋┗蛭⒘恳埔浩骷拔^。(8) 無(wú)菌錐形瓶：容量無(wú)菌錐形瓶：容量 250 mL、500 mL。(9) 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm。(10) pH 計(jì)或計(jì)或 pH 比色管或精密比色管或精密 pH 試紙。試紙。(11) 放大鏡或放大鏡或/和菌落計(jì)數(shù)器。和菌落計(jì)數(shù)器。一、設(shè)備和材料一、設(shè)備和材料二、 培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑1.平板計(jì)數(shù)瓊脂（平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基(1)成分成分: 胰蛋白胨胰蛋白胨 5.0g 酵母浸膏酵母浸膏 2.5g 葡萄糖葡萄糖 1.0g 瓊脂瓊脂 15.0g 蒸餾水蒸餾水 1000ml pH7.00.2(2)制法制法: 將上述成分加

3、于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝試管或錐，分裝試管或錐形瓶，形瓶，121高壓滅菌高壓滅菌15min。2.磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液(1)成分成分: 磷酸二氫鉀（磷酸二氫鉀（KH2PO4） 34.0g 蒸餾水蒸餾水 2500ml pH7.2(2)制法制法: 貯存液：稱取貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀于的磷酸二氫鉀于500ml蒸餾水中，用大約蒸餾水中，用大約175ml的的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至，用蒸餾水稀釋至1000ml后貯存于后貯存于冰箱。冰箱。 稀釋液：取貯存液稀釋液：取貯存液1.25ml，用蒸餾水稀釋至，用

4、蒸餾水稀釋至1000ml，分裝于適，分裝于適宜容器中，宜容器中，121高壓滅菌高壓滅菌15min。3.無(wú)菌生理鹽水無(wú)菌生理鹽水(1)成分成分: 氯化鈉氯化鈉 8.5g 蒸餾水蒸餾水 1000ml(2)制法制法: 稱取稱取8.5g氯化鈉溶于氯化鈉溶于1000ml蒸餾水中，蒸餾水中，121高壓滅菌高壓滅菌15min。三、三、 檢驗(yàn)程序檢驗(yàn)程序 檢檢 樣樣25g(ml)樣品樣品+225ml稀釋液，均質(zhì)稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋倍系列稀釋選擇選擇2個(gè)個(gè)3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，各取各取1ml分別加入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)每個(gè)皿中加入每個(gè)皿中加入15ml20ml平板計(jì)平

5、板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻培養(yǎng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)各平板菌落數(shù)計(jì)數(shù)各平板菌落數(shù) 計(jì)算菌落總數(shù)計(jì)算菌落總數(shù) 報(bào)告報(bào)告四、操作步驟四、操作步驟 1. 樣品的稀釋樣品的稀釋(1) 固體和半固體樣品：固體和半固體樣品：稱取稱取 25 g 樣品置盛有樣品置盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000 r/min10000 r/min 均質(zhì)均質(zhì) 1 min2min，或放入盛有，或放入盛有 225 mL 稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均式均 質(zhì)器拍打質(zhì)器拍打 1 min2 min，制成，制成 1:10 的樣品勻液。的樣

6、品勻液。(2) 液體樣品：液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取以無(wú)菌吸管吸取 25 mL 樣品置盛有樣品置盛有 225 mL 磷酸鹽緩磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶 （瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成中，充分混勻，制成 1:10 的樣品勻液。的樣品勻液。 (3) 用用 1 mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取無(wú)菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液樣品勻液 1 mL，沿管，沿管壁緩慢注于盛有壁緩慢注于盛有 9 mL 稀釋液的稀釋液的 無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用端不要

7、觸及稀釋液面），振搖試管或換用 1 支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混使其混 合均勻，制成合均勻，制成 1:100 的樣品勻液。的樣品勻液。(4) 按按 (3) 操作程序，制備操作程序，制備 10 倍系列稀釋樣品勻倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用液。每遞增稀釋一次，換用 1 次次 1 mL 無(wú)菌吸管無(wú)菌吸管 或吸頭?；蛭^。(5) 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇 2 個(gè)個(gè)3 個(gè)個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行在進(jìn)行 10 倍遞增稀釋時(shí)，吸取倍遞增稀釋時(shí)，吸取 1 mL 樣品勻液樣品勻液

8、于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸分別吸 取取 1 mL 空白稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)空白稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。作空白對(duì)照。(6) 及時(shí)將及時(shí)將 15 mL20 mL 冷卻至冷卻至 46 的平板的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于 46 1 恒溫水恒溫水浴箱中浴箱中 保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。勻。2. 培養(yǎng)培養(yǎng)(1) 待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 1 培養(yǎng)培養(yǎng) 48 h2 h。水產(chǎn)品。水產(chǎn)品 30 1 培養(yǎng)培養(yǎng) 72 h3 h。(

9、2) 如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層表面覆蓋一薄層 瓊脂培養(yǎng)基（約瓊脂培養(yǎng)基（約 4 mL），），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按 36 1 培養(yǎng)培養(yǎng) 48 h2 h（水產(chǎn)品（水產(chǎn)品 30 1 培養(yǎng)培養(yǎng) 72 h3 h）條件進(jìn)行培養(yǎng)。）條件進(jìn)行培養(yǎng)。 3. 菌落計(jì)數(shù)菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colon

10、y-forming units，CFU）表示。）表示。(1) 選取菌落數(shù)在選取菌落數(shù)在 30 CFU300 CFU 之間、無(wú)蔓延菌落生之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于 30 CFU 的的 平板記錄具體菌落平板記錄具體菌落數(shù)，大于數(shù)，大于 300 CFU 的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。(2) 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋 度的菌落數(shù)

11、；若片狀度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以可計(jì)算半個(gè)平板后乘以 2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。(3) 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。 五、五、 結(jié)果與報(bào)告結(jié)果與報(bào)告1.菌落總數(shù)的計(jì)算方法菌落總數(shù)的計(jì)算方法(1) 若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相

12、應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每 g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。(2) 若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（1）計(jì)算計(jì)算:式中：式中：N樣品中菌落數(shù)樣品中菌落數(shù)C平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n 1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n 2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d稀釋因子（第一稀釋度）。稀釋因子（第一稀釋度）。(3) 若所有稀釋

13、度的平板上菌落數(shù)均大于若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。計(jì)算。(4) 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于 30 CFU，則，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。(5) 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于菌落生長(zhǎng)，則以小于 1 乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。乘以最低稀釋倍

14、數(shù)計(jì)算。(6) 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在 30 CFU300 CFU 之間，其中一部分小于之間，其中一部分小于 30 CFU 或大于或大于 300 CFU 時(shí)，則以最接近時(shí)，則以最接近 30 CFU 或或 300 CFU 的的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。2. 菌落總數(shù)的報(bào)告菌落總數(shù)的報(bào)告(1) 菌落數(shù)小于菌落數(shù)小于 100 CFU 時(shí)，按時(shí)，按四舍五入四舍五入原則修原則修約，以整數(shù)報(bào)告。約，以整數(shù)報(bào)告。(2) 菌落數(shù)大于或等于菌落數(shù)大于或等于 100 CFU 時(shí)，第時(shí)，第 3 位數(shù)字采位數(shù)字采用用四舍五入四舍五入原則修約后，取前原則修約后，取前 2 位數(shù)字，后面用位數(shù)字，后面用 0 代替位數(shù)；也可用代替位數(shù)；也可用 10 的指數(shù)形式來表示，按的指數(shù)形式來表示，按四四舍五入舍五入原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。(3) 若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。落蔓延。(4) 若