顯微技術(shù)作業(yè)課后作業(yè)C

1、生物電子顯微技術(shù)作業(yè) 課后作業(yè)c1. 簡述超高壓電子顯微鏡的優(yōu)點，以及切片與普通超薄切片的不同 。答：超高壓電鏡不但分辨率高、單色性好，而且電子穿透力強，對材料的損傷較小，可以觀察較厚的材料(0.5-10m)，場深大，成像有立體感，而且不會影響分辨率 。主要用于觀測材料、礦物、生物樣品、器件透射電子顯微象及電子衍射圖，對樣品微觀組織、結(jié)構(gòu)、缺陷等定性、定量分析。 可對樣品在加熱、拉伸、電子輻照等條件下微觀組織的變化過程進(jìn)行動態(tài)觀測。一般透射電鏡觀察樣品時，電子束無法穿過 0.1 m m 以上的切片，所以需將樣品切成 5070nm 的薄片才能觀察。與光鏡觀察的 37 m m 切片對比而言，常將透

2、射電鏡的切片稱為超薄切片。用于超高壓電鏡的厚切片制備與普通超薄切片相似，只是有一些特殊要求:其切片材料的制備與普通電鏡有所不同。樣品塊要相對軟一些，以保護刀口和便于制作連續(xù)切片。覆蓋的支持膜要厚，并噴碳加固，以抗高壓電子轟擊。選用折疊式載網(wǎng)或單縫載網(wǎng)，以防切片脫落和阻擋視野。采用浸沒法染色，并適當(dāng)延長染色時間。包埋前可先進(jìn)行整體染色。 2.比較透射電鏡與掃描電鏡在觀察效果和研究用途上的不同？它們各自的優(yōu)缺點是什么？透射電鏡掃描電鏡觀察效果電子顯微鏡是使用電子來展示物件的內(nèi)部或表面的顯微鏡。高速的電子的波長比可見光的波長短（波粒二象性），而顯微鏡的分辨率受其使用的波長的限制，因此電子顯微鏡的理論

3、分辨率（約0.1納米）遠(yuǎn)高于光學(xué)顯微鏡的分辨率（約200納米）。分辨率為0.10.2nm，放大倍數(shù)為幾萬幾十萬倍它能夠直接觀察直徑100mm，高50mm，或更大尺寸的試樣，對試樣的形狀沒有任何限制，粗糙表面也能觀察，這便免除了制備樣品的麻煩，而且能真實觀察試樣本身物質(zhì)成分不同的襯度（背反射電子象）。分辨率可達(dá)3-10nm,放大倍數(shù)可達(dá)10萬倍研究用途用以觀察為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。觀察樣品形貌、原位分析樣品的晶體結(jié)構(gòu)主要是用來觀察物體表面超微形態(tài),適合觀察固態(tài)的生物材料,也可以觀察生物材料斷面或剝蝕面的結(jié)構(gòu)（亞細(xì)胞形態(tài)），不過需要預(yù)先進(jìn)行切割或蝕刻處理。有時甚至也可進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記物的形態(tài)觀察

4、。由于具有很高的分辨率，多以被廣泛用于觀察納米材料。優(yōu)點1.制樣過程對芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響較小2.透射電子穿過樣品內(nèi)部，同樣品內(nèi)部的所有東西發(fā)生相互作用，從而直接獲得內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，因此得到綜合的高分辨率結(jié)果3.易于調(diào)整，通過改變線圈中流過電流的強度，可以改變磁場強度，達(dá)到變化折 射率和焦距的目的4.像差較小，且較為容易消除或校正5.對電子束流的能量損耗小 1.具有很高的分辨率2.制樣方便，制樣周期短，有時可以作非破壞性的分析3.觀察范圍大，倍率變化大，立體感強，景深大，觀察效果好缺點1. 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對制作材料的純度、元件幾何形狀尺寸的加工精密度等都要 求極高2. 制樣的技術(shù)難度大，觀察點的定位難，

5、有時需借用聚焦離子束刻蝕才能完成3.分析周期長4.成本較高1.只能在樣品表面掃描，信號來自樣品表面，不能獲得樣品內(nèi)比較深的部位的情況2.顯微像一般不包含結(jié)構(gòu)信號，不能區(qū)分單晶、多晶、非晶，不能區(qū)分位錯、層錯、晶界等3.不適合厚度在微米以下的薄膜的分析需求3.采用低溫處理制作電鏡樣品的優(yōu)缺點是什么？優(yōu)點缺點1.固定形態(tài)和結(jié)構(gòu)，且固化結(jié)構(gòu)使之易于進(jìn)一步處理2.在保存生物活性的基礎(chǔ)上儲存生物材料3.在制作冷凍超薄切片時，不需經(jīng)化學(xué)藥劑固定、脫水、過渡、聚合等，減少了處理過程造成的閻像低溫處理依舊不能解決永久活體，并且制作過程容易產(chǎn)生冷凍損傷和干燥損傷。并且切片太厚，不能做連續(xù)切片，并且容易破碎。4.

6、為什么要采用臨界點干燥來處理掃描電鏡樣品？哪些材料不用臨界點干燥來處理也能獲得滿意的圖像？答：臨界點干燥就是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)下，液體表面張力消除的特性，克服樣品干燥過程中所發(fā)生的變形，保持樣品原狀，達(dá)到干燥的目的。其原理是在一定的溫度和壓力下，物質(zhì)的液態(tài)和氣態(tài)界面將會消失，液態(tài)瞬間轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，形成非液非固的狀態(tài)，即達(dá)到臨界點（c.p）狀態(tài)。在臨界點時，表面張力消失，分子間的內(nèi)聚力等于零，因此，利用臨界點狀態(tài)對材料進(jìn)行干燥，材料理論上不會產(chǎn)生收縮和形變，對于質(zhì)地較軟的材料這種方法是最好的干燥方法。所以說，對于比較堅硬的材料，及時不使用臨界點干燥法也可以實現(xiàn)較好的圖像觀察。5. 查找采用了低溫制

7、樣技術(shù)的研究文獻(xiàn)，搜集精美圖片，分析這些工作的技術(shù)難點和發(fā)表圖片的質(zhì)量。 答：技術(shù)難點：1、冰晶 冰晶是組織在冷凍固化過程中, 由于冷凍緩慢, 冷凍時間過長, 使細(xì)胞質(zhì)和組織間隙內(nèi)未結(jié)合的水逐漸析出形成解決辦法: 取材大小、厚薄要適宜, 過大過厚影響冷凍速度。 2、組織擠壓、皺縮。常見于組織結(jié)構(gòu)軟硬不同的組織，如皮膚。解決方法：將表皮面放在標(biāo)本的上端, 先切較軟的皮下組織, 依次切真皮、表皮, 同時用毛筆輕輕展開, 或用抗卷板才能切出完整的切片3、冷凍切片一般不會脫片, 偶見于壞死組織或含水量大的組織, 如子宮肌瘤黏液變性時。解決方法: 首先切片不能太厚, 其次切片固定后用吹風(fēng)機吹干再染色。4

8、、 甲狀腺等有腔洞的組織，組織冷凍過頭, 使之發(fā)脆就會破碎形成空洞, 這時可用手貼在組織上或用嘴向組織哈氣稍加溫使其軟化即可切出完整的切片。5、組織貼附不平或者有皺褶 切片切好后用載玻片貼片時手不能顫抖, 而且在貼附組織時手要有一個向下伸展的動作。 文獻(xiàn)一 密方元,李鳳山,馬邦磊,錢寧.冷凍切片5m in快速制片染色法. 臨床與實驗病理學(xué)雜志，2009，oct25. 圖 1 a進(jìn)口oct包埋的腮腺混合瘤冷凍切片 b 膠片包埋的腮腺混合瘤冷凍切片圖2 腎粗針穿刺小標(biāo)本, 先制成冷凍 圖3 脂肪組織冷凍切片, 脂肪細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)平后做冷凍切片, 保持了組織保持完整，細(xì)胞邊界清晰，染色鮮艷 圖4 甲狀

9、腺組織, he 染色前未經(jīng)二 圖 5甲狀腺組織, h e 染色前經(jīng)二甲苯脫脂甲苯脫脂處理, 胞核較模糊 處理后，胞核、質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰、透明 我認(rèn)為這幾張圖片比較好，清晰，甲狀腺組織切片中破碎形成空洞，染色很均勻。 文獻(xiàn)二 胥維勇，楊紅，李科，楊群.介紹一種faapt冷凍切片快速固定液.臨床與實驗病理學(xué)雜志.2002apr;18摘要手術(shù)中冷凍切片的病理診斷是根據(jù)冷凍切片組織學(xué)形態(tài)來進(jìn)行,以確定病變組織的良惡性為目的。制作冷凍切片包括制片、固定、染色三個環(huán)節(jié),在冷凍切片中固定液的選擇是不可忽視的一個因素。我們在工作中經(jīng)反復(fù)試驗在眾多固定液中選擇faa液( 福爾馬林- 醋酸- 乙醇), 經(jīng)改良配成一種適合于冷凍切片