乙型肝炎病毒在肝外組織中復制并影響血糖調節(jié)

1、乙型肝炎病毒在肝外組織中復制并影響血糖調節(jié) 摘要 目的: 研究肝外組織是否支持乙型肝炎病毒復制以及乙型肝炎的泛嗜性對血糖調節(jié)的影響。方法: 利用PCR法檢測麻鴨血清中的鴨乙型肝炎病毒以篩選攜帶鴨乙型肝炎病毒的麻鴨，分組后進行靜脈葡萄糖耐量實驗。分別提取攜帶鴨乙型肝炎病毒麻鴨的肝、胰、腎和肌肉組織總DNA，利用滾環(huán)擴增法檢測肝、胰、腎和肌肉中是否存在鴨乙型肝炎病毒復制的標志分子共價閉合環(huán)狀DNA。用SPSS中的ANOVA分析麻鴨血糖與攜帶鴨乙型肝炎病毒的關系，以及血糖與鴨乙型肝炎病毒在胰、腎和肌肉中復制的關系。結果: 利用PCR篩選出36只攜帶鴨乙型肝炎病毒麻鴨及60只陰性麻鴨，陽性率為37.5

2、%。攜帶DHBV麻鴨的肝、胰、腎和肌肉其復制標志物共價閉合環(huán)狀DNA的檢出率分別為100%、55.6%、66.7%、44.4%。攜帶鴨乙型肝炎病毒的麻鴨其空腹、0.5小時、1小時及2小時血糖濃度平均值均高于末攜帶鴨乙型肝炎病毒的麻鴨，腎和肌肉被感染的麻鴨其血糖平均值略高于末感染的麻鴨，但均無統(tǒng)計學意義。胰腺被感染的麻鴨其空腹、0.5小時、1小時及2小時血糖濃度平均值高于末感染的麻鴨，且具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。結論: 乙型肝炎病毒肝外組織可支持乙型肝炎病毒復制，乙型肝炎病毒感染胰腺可能是誘發(fā)糖耐量異常的原因之一。關鍵詞 乙型肝炎病毒； 泛嗜性； 血糖調節(jié) HBV Replication i

3、n Extrahepatic Tissues and Impactin the Blood Glucose RegulationAbstract Object This study attempts to investigage whether the extrahepatic suports the replication of hronic hepatitis B virus (HBV), and whether HBV replication in extrahepatic infuences blood glucose regulation. Methods The duck wth

4、duck hronic hepatitis B virus (DHBV) were screened by amplified the DHBV DNA from the serum of duck, the blood glucose regulation were evaluated by intravenous glucose tolerance test. The total DNA of hepatic tissues, pancreas, kidney and muscle of duck with DHBV were extracted, then using rolling c

5、ircle of amplification to exame the the cccDNA of DHBV. The relation between the blood glucose regulation and the DHBV replication in hepatic, pancreas, kidney and muscle was evaluated by the ANOVA. 推薦精選Results Total 36 ducks were screened the positive for DHBV and 60 ducks were negative, the positi

6、ve rate of ducks with DHBV were 37.5%. The detection rate of hepatic tissues, pancreas, kidney and muscle of DHBV cccDNA were 100%, 55.6%, 66.7%, 44.4% respectively. The averages of blood glucose concentration of duck with DHBV were higher than the duck without DHBV, includinf the blood glucose conc

7、entration of empty stomach, half an hour, 1 hour and 2 hour after injected sugar of blood glucose concentration of duck, but there were no statistically significant, the same results were observed in duck which cccDNA screened was positive in kidney and muscle. The averages of blood glucose concentr

8、ation of duck which cccDNA screened was positive in pancreas was higer than that cccDNA screened was negative, and there were statistically significant (P0.05). Conclusions HBV can replicated in extrahepatic tissues and HBV infection pancreas are attributable to the impaired glucose tolerance.Key wo

9、rds hepatitis B virus, extrahepatic tissues, blood glucose regulation 世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計全世界有3.5億慢性乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者，而我國屬HBV感染高流行區(qū)，有1.3億人HBV表面抗原陽性，每年因肝病死亡人數(shù)約30萬1-3。慢性活動性肝炎可引發(fā)多種并發(fā)癥，如肝源性糖尿病、腎炎、消化系統(tǒng)病變等4，5，其中肝源性糖尿病是乙肝患者常見的并發(fā)癥，據(jù)研究報道乙肝患者并發(fā)糖尿病的幾率為9%-16%6。但其發(fā)病機制并不清楚。 現(xiàn)有大量的科學研究證實在肝外組織可檢測到HBV，但由于乙肝病毒存在于血液當中

10、，各肝外組織檢測到的HBV DNA是存在于各肝外組織細胞中還是存在于肝外組織的血液中還無法明確界定。 DHBV（duck hepatitis B virus, DHBV）和HBV均為嗜肝DNA 病毒, 它們都有相似的基因組和病毒結構特征以及通過RNA 逆轉錄復制的特性，由于DHBV不受宿主組織細胞來源的限制，因此HBV的復制機制的特點均基于對DHBV復制研究的基礎之上7。本研究擬以攜帶DHBV的麻鴨為實驗動物，研究肝外組織是否支持乙型肝炎病毒復制以及乙型肝炎病毒的泛嗜性對血糖調節(jié)的影響。1 材料與方法1.1 材料 推薦精選1.1.1 主要試劑 QIAamp DNA Micro試劑盒購自德國Qi

11、agen公司；Taq DNA Polymerase、2Taq PCR MasterMix均購自北京天根生化科技公司；葡萄糖試劑盒購自北京北化康泰臨床試劑有限公司；胰RNase A 、牛血清標準蛋白、質粒DNA小量抽提試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒及普通生物化學試劑均購自上海生工生物工程公司，75乙醇、無水乙醇購自于廣東精細化學工程技術研究開發(fā)中心；phi29 DNA Polymerase購自Fermentas公司。克隆載體pGEMTeasy購自美國Promega公司。引物均由上海生工生物工程合成。1.1.2 引物 根據(jù)GenBank公布的DHBV基因全長序列，參考有關文獻設計篩選攜帶DHBV麻

12、鴨的引物Ps1和Ps2，其擴增DHBV 部分S基因；根據(jù)DHBV的高度保守序列設計了4對RCA引物RCA18，分別與DHBV的正負鏈互補；此外，設計了一對跨缺口擴增DHBV的引物PK1和PK2，及設計了一對全長擴增DHBV的引物DP1和DP2。引物序列及位置見表1，均由上海生物工程有限公司合成。表1 DHBV引物序列一覽表引物名稱引物序列位置Ps15- AGCTGGCCTAATCGGATTAC -3nt1319-1338Ps25-TGTCCGTCAGATACAGCAAG-3nt1581-1562RCA15-AATTCTCGAAATA*C*T -3nt1361-1375RCA25-GATCCGA

13、GGGCAG*T*A -3nt1668-1654RCA35-CCAATGGGAGTCG*G*T -3nt1610-1624RCA45-TACACGTGGCAAA*G*G-3nt2164-2150RCA55-CTGTACCTTTGCC*A*C-3nt2145-2159RCA65-CCGCAATTCTTTC*C*A -3nt1912-1898RCA75-TAGAAGAAGAAAA*G*T -3nt267-281RCA85- AGTAAATGGTAAC*A*C-3nt2005-1991PK15- CCAACACATGGCGCAATATC -3nt2180-2199PK25- GCCTAAAGGTAT

14、CTCCTCAG -3nt2958-2939注：*為硫代修飾堿基推薦精選1.2 方法1.2.1 鴨血清中DHBV的提取及檢測翅靜脈采集麻鴨的全血，分離血清。取100 L血清沸水浴10 min后12 000g離心10 min。PCR反應體系為：2Taq PCR MasterMix 12.5 L，10 mM引物Ps1，Ps2各加0.5 L，Taq DNA Polymerase 0.5 L，上述上清液5 L，加無菌雙蒸水至25L。擴增條件為：94 3 min；94 30 s，56 40 s，72 30 s，共35個循環(huán)；72 7 min，68 10 min。以篩選攜帶DHBV的麻鴨。擴增長度為262

15、bp。1%瓊脂糖電泳檢測結果。1.2.2 靜脈葡萄糖耐量實驗 將麻鴨饑餓過夜后，稱量麻鴨重量，計算并準備好需要注射的葡萄糖。翅靜脈采集麻鴨的全血后，注射準備好的葡萄糖，記下時間。之后再在0.5h、1h及2h時采血。4000 rpm離心10 min，取上清液至另一離心管。按照葡萄糖試劑盒（氧化酶法）的說明書測血糖濃度。剩余血清置于20保存?zhèn)溆谩?.2.3 攜帶DHBV麻鴨各組織DHBV DNA的提取 分別解剖每只攜帶DHBV的麻鴨，獲取適量肝、胰腺、腎及肌肉組織，經PBS漂洗后，液氮保存。分別從這四種組織中提取DHBV cccDNA，操作步驟按QIAamp DNA Micro試劑盒說明書進行。置

16、于20保存?zhèn)溆谩?.2.4 滾環(huán)擴增 分別取8.5 L麻鴨血清DHBV DNA，肝組織總DNA及肝組織DHBV DNA為模板，加入29 DNA Polymerase buffer 1 L，4對RCA引物混合液 (10 mol/L) 0.5 L ，混勻后入PCR儀，95 3 min，50 15 s，30 15 s，20 10 min后放置冰上。在上述產物中加入29 DNA Polymerase buffer 1 L，4對RCA引物混合液 (10 mol/L) 0.5 L，BSA (5 mg /mL) 0.2 L，dNTP (2.5 mmol/L) 1.6 L，29 DNA polymerase

17、(10 U/L) 10 U，補足水至總體積為20 L，混勻后放入PCR儀，30 18 h，65 10 min。1%瓊脂糖電泳檢測結果后，置于20保存?zhèn)溆谩?.2.5 跨缺口引物PCR擴增 根據(jù)DHBV的正負鏈缺口設計跨缺口引物，PK1及PK2引物序列如表1。PCR反應體系為：2Taq PCR MasterMix 12.5 L，10 mM引物PK1、PK2各加0.5 L，Taq DNA Polymerase 0.5 L，上述RCA產物1 L，加無菌雙蒸水至25 L。反應條件為：94 預變性3 min；94 40 s，56 30 s，72 1 min，共35個循環(huán)；72 5 min。擴增長度為77

18、9 bp。推薦精選1%瓊脂糖電泳檢測結果。2 結果2.1 鴨血清中DHBV的提取及檢測 以PCR方法篩選96只麻鴨，檢測出36只血清中攜帶DHBV的麻鴨，陽性率為37.5%。部分血清檢測結果如圖1，擴增片段大小約為262bp，陽性血清擴增出正常的陽性條帶，陰性血清無擴增條帶。 圖1 PCR篩選DHBV陽性的麻鴨電泳圖待測為部分待檢測的麻鴨血清的擴增產物，“+”和“-”分別為陽性血清的擴增產物和陰性血清擴增產物。2.2 滾環(huán)擴增 以RCA方法擴增同一只陽性麻鴨的血清DHBV DNA、肝、胰腺、腎和肌肉組織的DNA，部分實驗結果如圖2。血清中DHBV以rcDNA存在，無條帶，而肝細胞中DHBV以c

19、ccDNA存在，有較好的擴增，與預期相符。推薦精選 圖2 血清、肝、胰腺、腎和肌滾環(huán)擴增電泳圖2.3 跨缺口引物PCR擴增分別從同一只麻鴨血清DHBV DNA、肝、胰、腎和肌肉組織的RCA產物中取0.5uL為模板，其中陰性對照以水為模板，用跨缺口引物PCR擴增，部分結果如圖3，擴增片段大小約為790bp。血清及陰性對照無條帶，肝細胞擴增出陽性結果，與預期相符，胰腺、腎及肌肉組織均擴增出陽性結果。經統(tǒng)計，從96只麻鴨中檢測出的36只陽性麻鴨，血清均無跨缺口引物的PCR擴增產物，肝組織擴增出目的片段的概率為100%，與預期相符，胰腺、腎和肌肉中分別檢測出cccDNA，其中胰腺是20只，腎是24只，

20、肌肉16只。胰腺、腎及肌肉檢測到DHBV cccDNA的概率分別為55.6%、66.7%、44.4%。 圖3 血清、肝、胰腺、腎和肌跨缺口引物PCR檢測電泳圖2.4葡萄糖耐量實驗推薦精選 將96只麻鴨分組，以葡萄糖試劑盒測定麻鴨空腹血糖、0.5小時、1小時及2小時血糖濃度。表一：麻鴨的陽性血清與陰性血清血糖檢測 單位mmol/L數(shù)量空腹血糖濃度0.5小時血糖濃度1小時血糖濃度2小時血糖濃度血清檢測陽性36只10.50392.481123.98486.887515.85286.551411.86265.5569血清檢測陰性60只10.31211.346622.43874.106214.65953

21、.062811.04552.1579表二：攜帶DHBV的麻鴨的胰腺cccDNA檢測陽性與陰性的血糖檢測 單位mmol/L 數(shù)量空腹血糖濃度0.5小時血糖濃度1小時血糖濃度2小時血糖濃度胰腺cccDNA檢測陽性19只10.94102.636628.42897.7936 20.034010.7755 15.653310.7225 胰腺cccDNA檢測陰性17只9.28471.4027 23.32412.5132 12.68022.3207 10.41851.7842 表三：攜帶DHBV的麻鴨的腎臟cccDNA檢測陽性與陰性的血糖檢測 單位mmol/L數(shù)量空腹血糖濃度0.5小時血糖濃度1小時血糖濃度

22、2小時血糖濃度腎臟cccDNA檢測陽性24只9.81562.449627.05727.814017.658410.7398 14.81439.9016腎臟1210.98351.8808 24.36600.1463 14.98012.2040 10.35150.3828 推薦精選cccDNA檢測陰性只表四：攜帶DHBV的麻鴨的肌肉cccDNA檢測陽性與陰性的血糖檢測 單位mmol/L數(shù)量空腹血糖濃度0.5小時血糖濃度1小時血糖濃度2小時血糖濃度肌肉cccDNA檢測陽性12只9.87672.8901 22.83902.8102 12.81943.3682 9.72491.0986 肌肉cccDNA

23、檢測陰性24只10.36902.1267 27.82077.1329 18.738810.0798 15.12779.6906 3 討論 目前對乙肝并發(fā)糖尿病發(fā)病機制主要有三方面的解釋：外周組織產生胰島素抵抗、肝細胞損害造成肝功能障礙導致糖代謝異常及肝病病毒對胰腺的直接侵犯或免疫損害8，9。但其具體的分子機制并不清楚。時德仁等10，11報道HBV可影響胰島，細胞超微結構，并認為HBV可直接侵害胰島細胞，是引起乙肝并發(fā)糖尿病發(fā)病機制之一。共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的形成是乙型肝炎病毒侵入細胞后在細胞內進行復制的起始步驟，也是前

24、基因組RNA復制的原始模板，是建立病毒感染狀態(tài)的最重要標志，故cccDNA可作為HBV復制的重要指標12。因HBV在血液中以rcDNA的形式存在，如在肝外組織中檢測到cccDNA標志著此HBV DNA必然在肝外組織細胞中復制而不是存在于肝外組織的血液中。我們建立了滾環(huán)式擴增法（rolling circle amplification，RCA）13檢測HBV共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的方法14，15，并以此方法對攜帶DHBV麻鴨的肝、胰、腎和肌肉進行cccDNA檢測，結果發(fā)現(xiàn)除肝組織外，發(fā)現(xiàn)胰、腎和肌肉組織中存在DHBV的cc

25、cDNA，證實了乙型肝炎病毒確實具泛嗜性，可在肝外組織中復制。推薦精選我們的實驗證實胰腺被感染的麻鴨其空腹、0.5小時、1小時及2小時血糖濃度平均值高于末感染的麻鴨，且具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。但DHBV是否由于感染了胰腺并在胰腺中復制表達其蛋白，影響胰島素的分泌進而引起血糖調節(jié)受損還有待研究。參考文獻1 Akbar DH, Siddique AM, Ahmed MM. Prevalence of Type-2 diabetes in patients with hepatitis C and B virus infection in Jeddah, Saudi Arabia. Med P

26、rinc Pract, 2002, 11: 82-85.2 趙英杰, 熊良仲, 高志文. 對慢性乙型肝炎發(fā)病機制的再認識J . 華西醫(yī)學, 2004, 19( 2) : 345.3 沈松林. 病毒性肝炎的肝外表現(xiàn)J . 山東醫(yī)藥, 1998, 38( 8) : 42-43.4 Lin CY. Hepat it is B virus deoxyribonucl eic acid in kidney cells probablyleading to viralpathogensis among hepat it is B virus associated membranousnephropathy

27、 patientsJ .Nephron, 1993, 63( 1) : 58-64.5 Canem D,Prince AM.Hepatitis B virus infection-Natural history and clinical consequencesJ. N Engl J Med, 2004, 11:121336.6 Wright T L.Introduction to chronic hepatitis B infectionJ. Am J Gastroenterol, 2006, 101(Suppl1): 1-6.7 Technology Planning and Management Corporation Canterbury Hall. Report on Carcinogens Background Document for Hepatitis B Virus.20038 Takumi K, Eitaro T, Minoru I, et al. Insulin resistance and chronic liver disease, World