食品酶學綜合性實驗

1、食品酶學綜合性實驗實驗1 菠蘿蛋白酶的提取、初步分離純化及活性測定【目的和要求】1. 了解酶分離純化的一般程序；2. 掌握硫酸銨沉淀法、透析法分離提取菠蘿蛋白酶的基本原理和方法；3. 熟悉蛋白質(zhì)含量測定、菠蘿蛋白酶活力測定等實驗原理和方法?！緦嶒炘怼?. 建立有效的酶純化程序應考慮的原則（1）利用酶在分離純化上最有利的特性；（2）盡早使用一種選擇性好的方法；（3）選擇交換能力高的層析技術(shù)作為第一步層析；（4）不要連續(xù)使用相同的純化方法；（5）將各層析步驟連接起來，使前一步得到的樣品適用于下一步層析；（6）在造成酶被稀釋的步驟后來要用濃縮酶的方法；（7）要使每步過程的分辨能力呈遞增趨勢；（8）

2、每步純化過程后，通過量體積，酶活力和蛋白質(zhì)濃度測定，監(jiān)測純化的進程。2. 菠蘿蛋白酶簡介菠蘿蛋白酶（bromelain，ec 3.4.22.3）簡稱菠蘿酶，是從鳳梨屬植物菠蘿中提取的一組復合的半胱氨酸巰基蛋白水解酶。在食品工業(yè)中菠蘿蛋白酶作為一種食品添加劑，能分解蛋白質(zhì)、肽、酯和酰胺等，可用于肉質(zhì)嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生產(chǎn)等。在醫(yī)藥上它可以治療水腫及多種炎癥。1891年mercaro于菠蘿的汁中首先發(fā)現(xiàn)。菠蘿蛋白酶屬于糖蛋白，是由巰基蛋白酶和非蛋白酶組分構(gòu)成的復雜復合物，因含有一個不穩(wěn)定的游離巰基，所以菠蘿蛋白酶極易被氧化而使其酶活下降。菠蘿蛋白酶的相對分子質(zhì)量大約為33 000dw，

3、等電點 9.55，最適ph在7.1左右，在偏酸環(huán)境下酶活下降較快，堿性環(huán)境能延緩失活。菠蘿蛋白酶的溫度的最穩(wěn)定范圍是5565。金屬鹽離子中nacl、kcl對酶活的影響不是很大，維生素c、半胱氨酸、硫代硫酸鈉、2-巰基乙醇是菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定劑，edta能通過螯合對酶活有影響的金屬離子而保護菠蘿蛋白酶，有機溶劑中甲醇、乙醇、乙二醇對酶活損失較大。3. 菠蘿蛋白酶的粗分離（1）鹽析分離鹽析法是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一。在稀鹽溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的增加而升高，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。但當鹽濃度增加到一定量時，其溶解度又逐漸下降，直到某一濃度時便從溶液中沉淀出來，這種現(xiàn)象即為鹽析。利用鹽析作用可使

4、不同蛋白質(zhì)從溶液中析出從而實現(xiàn)分離。這是因為蛋白質(zhì)是親水膠體，在高濃度的中性鹽影響下脫去水化層，同時，蛋白質(zhì)分子所帶的電荷被中和，結(jié)果蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性遭到破壞而沉淀析出。經(jīng)透析或用水稀釋時又可溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程。鹽析不同的蛋白質(zhì)所需中性鹽濃度與蛋白質(zhì)種類及ph有關(guān)。分子量大的蛋白質(zhì)（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白）易于析出。改變鹽濃度，使得不同分子量的蛋白質(zhì)分別析出。用于鹽析的中性鹽通常有硫酸銨、硫酸鈉和硫酸鎂等。由于硫酸銨的溶解度大而溫度系數(shù)?。ㄔ?5時，溶解度為767g/l；在0時，溶解度為697g/l），分離效果好，能保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，且價廉易得，以硫酸銨最為常用

5、。不同蛋白質(zhì)鹽析時所需鹽濃度不同，調(diào)節(jié)鹽濃度可適當?shù)貙⒉煌牡鞍踪|(zhì)分開。如雞蛋清中的球蛋白在50%飽和度硫酸銨溶液中沉淀，清蛋白100%飽和硫酸銨中沉淀。硫酸銨的飽和度可從附錄的“硫酸銨飽和度計算表”中查找，計算所需添加的硫酸銨量。（2） 透析和超濾 透析和超濾是利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜，而小分子可以自由透過的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)分開。透析是將待提純的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里，扎緊袋口放在蒸餾水或緩沖溶液中進行。透析時，需不斷更換透析外液，直到透析袋內(nèi)小分子物質(zhì)降低至內(nèi)外平衡為止。超濾是利用壓力或離心力，借助超濾膜將不同分子質(zhì)量物質(zhì)分離的技術(shù)。超濾膜是由丙烯晴、醋酸纖維、硝酸纖

6、維、尼龍等高分子聚合物制成的多空薄膜，截留的顆粒直徑為220nm，相當于相對分子質(zhì)量1 0005105.超濾技術(shù)不僅使蛋白質(zhì)得以分離純化，還可以達到濃縮的目的。 4. 菠蘿蛋白酶活性測定酪蛋白是一種蛋白質(zhì)，它被菠蘿蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光區(qū)280nm處有最大吸收，且光吸收值與含量成正比，符合beer定律。根據(jù)測定的280nm處的吸收值，可判定菠蘿蛋白酶的酶活性?！緦嶒瀮x器和用品】1. 實驗儀器 電子天平、恒溫水浴鍋、電磁攪拌器、酸度計、可見紫外分光光度計（配石英比色杯和玻璃比色杯）、冰箱、高速離心機、臺式天平（離心平衡用）。2. 實驗用品（1） 以組為單位的用品 大試管18mm200 m

7、m（10支）、試管架（2個）、燒杯（50ml1，100ml2， 200ml1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5ml1，1ml2，0.1ml1，0.2 ml1）、漏斗（3個）、量筒 （100ml1）、研缽、白瓷板、紗布、濾紙、蒸餾水瓶、洗耳球、標簽紙、橡皮筋。（2）全班共用的用品試劑瓶（1000ml7，250ml3，60ml20）、燒杯（1000ml4）、塑料燒杯（2000ml2）、量筒 （500ml2，1000ml2）、廣泛ph試紙、剪刀、電爐和鍋、蒸餾水容器、透析袋（截留相對分子質(zhì)量8 00014 000）?！緦嶒灢牧霞霸噭?. 實驗材料 新鮮菠蘿（3個）。2.試劑配制（1）鹽析

8、粗提液 0.1mo1/l ph 7.8磷酸緩沖液配制（pbs）（配4 000ml）：稱取65.166g na2hpo4 2h2o（或131.108g na2hpo412 h2o）5.305g nah2po4 2h2o，加蒸餾水溶解，定容至4000ml。 0.01mo1/l ph 7.8磷酸緩沖液配制（pbs）（配4 000ml）：稱取6.517g na2hpo4 2h2o（或13.111g na2hpo412 h2o）0.531g nah2po4 2h2o，加蒸餾水溶解，定容至4000ml。（2）酶活力測定試劑1酪蛋白（進口分裝）（配100ml）:稱1g酪蛋白，溶于100ml0.1mol/l

9、pbs（ph7.8），于40-50oc水浴溶解，不停攪拌，約需1-2 h才能完全溶解。激活劑含20mmo1l半胱氨酸-鹽酸鹽、1mmo1/l edta-na2 (乙二胺四乙酸二鈉)：用0.1mo1/l ph 7.8磷酸緩沖液配制，配制100ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。10三氯乙酸(tca)：稱20g三氯乙酸，用蒸餾水溶解并定容至200ml。（3）透析袋的處理 新買的透析袋，裁剪成所需大小，在蒸餾水中煮沸30min，取出用蒸餾水漂洗干凈，即可使用?！緦嶒灢襟E】1. 菠蘿蛋白酶的粗酶提取稱取菠蘿皮材料30g，將菠蘿皮在清水中洗凈，瀝干，切成小段后置于超高速攪拌機中，加入約60ml預冷的0.1mo1/l ph

10、7.8 pbs，持續(xù)攪拌1015min至粉碎，攪拌完成后用4層紗布過濾，得到濾液后，用冷凍離心機于4c 3000rpm離心6min，棄沉淀，即得到菠蘿蛋白酶粗提液，測定粗提液的體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性。2. 鹽析 根據(jù)附錄的“硫酸銨飽和度計算表”，按30%硫酸銨飽和度計算在上述酶提取液中需添加的固體硫酸銨量，稱取固體硫酸銨于研缽中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使溶液最終硫酸銨飽和度為30%，放置于冰水混合物（4）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4c 4000rpm離心10min，收集沉淀， 加入0.1mo1/l ph 7.8 pbs約15ml至完全溶解，測定

11、其體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性。3.透析 將溶解液裝入2.5 cm8cm透析袋（預先將透析袋在蒸餾水中煮沸30min）中，于 500ml 燒杯中，在磁力攪拌器攪拌下用蒸餾水透析，15min換水一次，換水34次后，檢查so42-是否已被除凈（檢查的方法是：取2mlbacl2溶液放入一支試管，滴加23滴透析外液至試管中，若出現(xiàn)白色沉淀，表示so42- 未除凈，若無沉淀出現(xiàn)，表示透析完全）。若透析液有沉淀，將透析液用濾紙過濾，測定過濾液的體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性。4酶活力測定方法取2支試管，設置一支為實驗對照，三支為平行樣品。取0.1ml酶液，加入0.9ml激活劑，加入37預熱的1%酪蛋白溶液1ml，準

12、確反應10min，加入10%三氯乙酸3ml反應終止酶反應。對照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它與測定管相同。離心（3000r/min，5min）或過濾，清液于280nm波長下測定光吸收值。酶活單位定義：在上述條件下 ，每10min增加0.001個光吸收值為1個酶單位（u）。實驗步驟按照表格中完成。試劑(ml)對照組平行樣品1平行樣品2平行樣品3tca3酶液0.10.10.10.1激活劑0.90.90.90.9酪蛋白111137c準確反應10mintca333a280nm od值5.蛋白質(zhì)含量測定方法將酶液稀釋至一定程度，采用考馬斯亮蘭g-250法測定溶液中可溶性蛋白的含量（參照

13、附錄1）?！窘Y(jié)果計算】1.蛋白質(zhì)含量計算 參照附錄1。2.酶活力計算最后酶活結(jié)果取3次重復實驗的平均值。 a280nm0.0010.1酶液活力（u/ml）= 稀釋倍數(shù)3.酶比活的計算酶比活（u/mg 蛋白）=酶活力/酶蛋白質(zhì)含量4.酶純化過程中回收率計算回收率（%）=（純化酶總活力/粗酶液總活力）100= （純化酶活力純化酶液體積）/（粗酶活力粗酶體積）1005.酶純化倍數(shù)的計算純化倍數(shù)=純化酶比活力/粗酶比活力6.分析及討論將測定的數(shù)據(jù)整理計算分別填入下表，并菠蘿蛋白酶的分離純化效果進行分析和討論。 菠蘿蛋白酶分離純化表步驟總體積（ml）總蛋白質(zhì)含量（mg）總活力（u）比活力（u/mg 蛋白

14、）回收率（%）純化倍數(shù)粗提取鹽析透析【注意事項】1.酶活性測定時的反應時間一定要準確，并嚴格控制好反應時的溫度。2.高速離心前一定要平衡好離心管。3.注意透析袋是否破裂，透析時間長時要置于4下進行?！舅伎碱}】1. 如何防止酶在分離純化過程中發(fā)生變性失活。2.常見的酶活性表示方法有那些（如：u/ml酶液；u/mg蛋白質(zhì); u/g干重或鮮重；u/g 酶粉 等）？它們各有什么含義，適用哪些場合？3. 蛋白質(zhì)的沉淀作用還有哪些方法？哪些變性了？哪些沒有變性？ 4.實驗中硫酸銨鹽析為什么要選擇0%30%飽和度？【參考書目】1.李建武，蕭能，余瑞元等，生物化學實驗原理和方法，北京，北京大學出版社，1994

15、2.余冰賓生物化學實驗指導北京：清華大學出版社，20033.趙亞華，高向陽生物化學與分子生物學實驗技術(shù)教程北京：高等教育出版社，2005附錄1 實驗 考馬斯亮藍g250染色法測定蛋白質(zhì)含量【目的和要求】掌握考馬斯亮藍g250法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法?！緦嶒炘怼靠捡R斯亮藍g250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。考馬斯亮藍g250在游離狀態(tài)下呈紅色，當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65nm，后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（01000g/ml），蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在波長595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)和考馬斯亮藍g250結(jié)合在

16、2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應非常靈敏，可測微克級蛋白質(zhì)含量。大量的去污劑對測定有嚴重的干擾，少量可通過對照消除。由于此法簡便迅速、干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于蛋白質(zhì)含量的測定?！緦嶒炂鞑摹糠止夤舛扔?、離心機、分析天平（萬分之一）、藥物天平、研缽、燒杯、量筒（10ml1）、容量瓶（100ml1）、刻度吸管（lml1，0.lml1）、具塞刻度試管（10ml1）、漏斗、漏斗架、剪刀?！緦嶒灢牧霞霸噭浚?）樣品溶液。（2）標準溶液：準確稱取100mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸餾水中，即為1000g/ml的原液。（3）染液：稱取0.1

17、g考馬斯亮藍g250溶于50ml90乙醇溶液中，再加入100ml 85的磷酸，最后用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在室溫下可放置一個月?！緦嶒灢襟E】1.標準曲線的繪制 (1) 01000g/ml標準曲線的繪制：另取6支試管編號，按下表加入試劑。管號1234 5 6 1000g/ml牛血清白蛋白（ml）蒸餾水（ml）蛋白質(zhì)濃度（g/ml）01.000. 20. 82000. 40. 64000. 6 0. 8 1.00. 4 0. 2 0 600 800 1000得到從1到6號管的牛血清白蛋白溶液濃度分別為0、200、400、600、800、1000g/ml，準確吸取各管溶液0.lml，加入5

18、ml考馬斯亮藍溶液，搖勻，靜置2min，測定595nm吸光值，繪制0-1000g/ml標準曲線。2.樣品的測定準確吸取樣品溶液0.1ml放入具塞刻度試管中，與步驟（1）操作相同，測得樣品的光吸收值a595nm?！窘Y(jié)果計算】由標準曲線可查出相應的蛋白濃度（g/ml），可按如下公式計算出樣品中蛋白含量。查出的蛋白提取液濃度（g/ml）定容體積(ml)樣品蛋白含量(g g鮮重) 樣品重量(g)【注意事項】1. 比色應在出現(xiàn)藍色2min1h內(nèi)完成。2. 測定中，蛋白染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完后可用乙醇浸泡將比色杯上的藍色清洗干凈?！舅伎碱}】1.考馬斯亮藍g-250法測定蛋白質(zhì)含量的原

19、理是什么？ 2.比較雙縮脲法、folin-酚法、紫外吸收法、考馬斯亮藍g-250法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)缺點?！緟⒖紩俊?.bradford，m.m.，anal. biochem：1976，248-2542.李建武，蕭能，余瑞元等. 生物化學實驗原理和方法. 北京：北京大學出版社，1994附錄2 硫酸銨飽和度計算表（1） 調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表（25c）硫 酸 銨 終 濃 度， % 飽 和 度10202530333540455055606570758090100硫 酸 銨 初 濃 度， % 飽 和 度每 1l 溶 液 加 固 體 硫 酸 銨 的 g 數(shù)*0561141141761962092

20、432773133513904304725165616627671057861181371501832162512883263654064494945926942029597891123155189225262300340382424520619253049619312515819323026730734839048558330193062941271621982352733143564495463312437410714217721425229233342652235316394129164200238278319411506403163971321682052452853754694532

21、6599134171210250339431503366101137176214302392553367103141179264353603469105143227314653470107190275703572153237753611519880771579079* 在25c下，硫酸氨溶液由粗濃度調(diào)到終濃度時，每l溶液所加固體硫酸銨的g數(shù)（2） 調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表（0c）在 0c 硫 酸 銨 終 濃 度， % 飽 和 度20253035404550556065707580859095100硫 酸 銨 初 濃 度， % 飽 和 度每 100ml 溶 液 加 固 體 硫 酸 銨 的 g 數(shù)*010.613.416.419.422.625.829.132.636.139.843.647.651.655.960.365.069.757.910.813.716.619.722.926.229.633.136.840.544.448.452.657.061.566.2105.38.110.913