造血干細胞捐獻者的HLA基因分型

1、 造血干細胞捐獻者血樣的造血干細胞捐獻者血樣的 hlahla基因定型及資料錄入基因定型及資料錄入 鄧志輝鄧志輝 深圳市輸血醫(yī)學研究所深圳市輸血醫(yī)學研究所 2005年年5月月16日日主要工作流程主要工作流程一、各一、各“工作站工作站”將審核、遴選合格的造血干細胞將審核、遴選合格的造血干細胞捐獻者血樣（貼有骨髓條碼），以及捐獻者樣本捐獻者血樣（貼有骨髓條碼），以及捐獻者樣本清單（捐獻者姓名及骨髓編號），一并送達我研清單（捐獻者姓名及骨髓編號），一并送達我研究所免疫遺傳實驗室；究所免疫遺傳實驗室；二、免疫遺傳實驗室對捐獻者血樣進行二、免疫遺傳實驗室對捐獻者血樣進行hla-ahla-a、b b和和dr

2、b1drb1基因定型，對送檢血樣的基因定型，對送檢血樣的hlahla基因定型結果負基因定型結果負責；責； 三、出具三、出具“捐獻者捐獻者hlahla基因分型檢測結果基因分型檢測結果”報告。報告。主要內容主要內容 （1 1）捐獻者）捐獻者hlahla基因定型血樣的運輸基因定型血樣的運輸 （2 2）hlahla相關基本概念相關基本概念 （3 3）hlahla分型（定型）技術分型（定型）技術 hlahla血清學分型技術血清學分型技術 hlahla基因分型技術基因分型技術捐獻者捐獻者hlahla基因定型血樣的運輸基因定型血樣的運輸注意事項：注意事項：1 1、因、因“登記表登記表”中填寫的內容審核不合格

3、血中填寫的內容審核不合格血樣、以及經(jīng)樣、以及經(jīng)hbvhbv等化驗檢查健康不合格的血樣，等化驗檢查健康不合格的血樣，予以剔除；予以剔除；2 2、檢查血樣管有無破管；、檢查血樣管有無破管；3 3、路途遠、條件許可，可放置適量干冰；、路途遠、條件許可，可放置適量干冰；4 4、由專人運送，防震、防顛覆；、由專人運送，防震、防顛覆；5 5、合格的、合格的hlahla基因定型血樣與捐獻者樣本清單基因定型血樣與捐獻者樣本清單一并送往組織配型實驗室。一并送往組織配型實驗室。人類白細胞抗原人類白細胞抗原(human leucocyte antigen, hla)(human leucocyte antigen,

4、 hla)v1958年，年，dausset采用白細胞凝集實驗，檢測出第一個人類采用白細胞凝集實驗，檢測出第一個人類白細胞白細胞 抗原抗原mac（a2）。）。v為高度復雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，每個人的為高度復雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，每個人的hlahla千差萬別，即人千差萬別，即人體生物學的體生物學的“身份證身份證” ” ， v不同的民族、同一民族不同的地域，不同的民族、同一民族不同的地域，hlahla基因及單倍型分布有基因及單倍型分布有其特點，其特點，vhlahla為人類主要組織相容性系統(tǒng)（為人類主要組織相容性系統(tǒng)（mhcmhc），與移植排斥反應密），與移植排斥反應密切相關，又稱移植抗原。切相關，又稱移

5、植抗原。v是機體是機體“識別自身識別自身”、“排除異已排除異已”的主要遺傳標記，參與的主要遺傳標記，參與免疫應答反應。免疫應答反應。 vhlahla基因家族位于人類第基因家族位于人類第6 6號染色體短臂，全長號染色體短臂，全長3.6 mb3.6 mb，hlahla基基因家族是迄今為止最復雜、多態(tài)性最豐富、免疫功能相關基因家族是迄今為止最復雜、多態(tài)性最豐富、免疫功能相關基因最集中、與疾病關聯(lián)最密切的一個區(qū)域。因最集中、與疾病關聯(lián)最密切的一個區(qū)域。hlahla抗原的分類抗原的分類vhla-ihla-i類：由一條具有多態(tài)性的類：由一條具有多態(tài)性的多肽鏈和一條沒有多態(tài)性多肽鏈和一條沒有多態(tài)性的的 2

6、2微球蛋白通過非共價鍵組成異二聚體。微球蛋白通過非共價鍵組成異二聚體。 經(jīng)典經(jīng)典hla-ihla-i類抗原：包括類抗原：包括hla-ahla-a、b b、c c位點抗原，分布于幾乎位點抗原，分布于幾乎所有有核細胞表面上。如所有有核細胞表面上。如t t淋巴細胞、淋巴細胞、b b淋巴細胞等，血小板淋巴細胞等，血小板上吸附上吸附hla-ahla-a、b b抗原?？乖?。 非經(jīng)典非經(jīng)典hla-ihla-i類抗原：包括類抗原：包括hla-ehla-e、g g 、f f位點抗原，抗原在位點抗原，抗原在特定時間選擇性分布。特定時間選擇性分布。vhla-iihla-ii類：由類：由34kd34kd的的 鏈和鏈和

7、29kd29kd的的鏈以非共價鍵連接而成，鏈以非共價鍵連接而成，包括包括hla-drhla-dr、dpdp、dqdq抗原；抗原； 僅分布于僅分布于b b淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞等少數(shù)細胞表面。淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞等少數(shù)細胞表面。vhla-hla-類：主要包括補體分子類：主要包括補體分子c2c2、c4c4及及bfbf等。等。hlahla抗原結構抗原結構hlahla的免疫原性及骨髓庫建庫工作中的免疫原性及骨髓庫建庫工作中常規(guī)檢測的常規(guī)檢測的hlahla位點位點vhlahla是一個高度復雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，如：是一個高度復雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，如： 經(jīng)典經(jīng)典hla-ihla-i類抗原：類抗

8、原：hla-ahla-a、b b、c c位點抗原；位點抗原； 非經(jīng)典非經(jīng)典hla-ihla-i類抗原：類抗原：hla-ehla-e、g g 、f f位點抗原位點抗原 hla-iihla-ii類：類：hla-drhla-dr、dpdp、dqdq位點抗原位點抗原vhlahla的免疫原性，主要以的免疫原性，主要以hla-ahla-a、b b和和drb1drb1的免疫原性較強，的免疫原性較強，因此，骨髓庫建庫工作中，通常僅對因此，骨髓庫建庫工作中，通常僅對hla-ahla-a、b b和和drb1drb1位點進位點進行定型。行定型。v無關供者骨髓移植中，無關供者骨髓移植中，nmdpnmdp、jmdpjm

9、dp有研究資料表明，供有研究資料表明，供/ /受受者對者對hla-chla-cw w基因的匹配程度，與基因的匹配程度，與gvhdgvhd、移植成活率相關。、移植成活率相關。hlahla基因基因v定位于人類第定位于人類第6 6號染色體短臂（號染色體短臂（6p21.316p21.31），全長），全長3.6 mb3.6 mb，占，占人類基因組堿基數(shù)的人類基因組堿基數(shù)的0.1%0.1%。vhla-ihla-i類基因：有類基因：有1010個遺傳座位，靠近染色體頂端，個遺傳座位，靠近染色體頂端，hla-ahla-a、b b、c c、e e、g g、 f f為表達基因，為表達基因，h h、j j、k k、l

10、 l為假基因，無基因為假基因，無基因產(chǎn)物。產(chǎn)物。v hla-hla-類基因：靠近染色體著絲粒端，主要包括類基因：靠近染色體著絲粒端，主要包括hla-drhla-dr、dpdp、dqdq基因座?；蜃?。hlahla基因結構基因結構v體細胞為二倍體，同源體細胞為二倍體，同源染色體之間相互配對，染色體之間相互配對，v每一每一hlahla位點有位點有2 2個等位個等位基因，一個來自于母親，基因，一個來自于母親，另一個來自于父親。另一個來自于父親。v檢測檢測hla-ahla-a、b b和和drb1drb1三三個位點，有個位點，有6 6個等位基因，個等位基因，即即6 6個個hlahla分型數(shù)據(jù)。分型數(shù)據(jù)。

11、檢出的檢出的hlahla抗原及等位基因抗原及等位基因v2003年世界衛(wèi)生組織（年世界衛(wèi)生組織（who）hla因子命名委員會命名的因子命名委員會命名的hla等位基等位基因：因： hla座位座位 等位基因等位基因 特異性特異性 hla-a 250 24 hla-b 490 49 hla-cw 119 13 hla-drb1 315 17 hla-dpb1 99 6 hla-dqb1 53 7vhla 系統(tǒng)等位基因豐富，每個人的等位基因型千差萬別，可以說在隨機系統(tǒng)等位基因豐富，每個人的等位基因型千差萬別，可以說在隨機人群中，難以有完全相同的。人群中，難以有完全相同的。 hlahla的命名的命名1、血

12、清學命名：遺傳位點后用數(shù)字表示，如血清學命名：遺傳位點后用數(shù)字表示，如a1a1、a2a2、a3a3、b5b5等。等。 以大寫字母以大寫字母a a、b b、c c表示表示hlahla的遺傳座位；的遺傳座位；hlahla特異性以數(shù)字表示；除特異性以數(shù)字表示；除hla-ahla-a、b b位點抗原的特異性的命名數(shù)字不重復外，其它位點抗原連續(xù)獨位點抗原的特異性的命名數(shù)字不重復外，其它位點抗原連續(xù)獨立命名；立命名；c c位點抗原以位點抗原以c cw w為字首命名，以和補體系統(tǒng)區(qū)別。為字首命名，以和補體系統(tǒng)區(qū)別。2 2、hlahla等位基因命名原則：位點后加等位基因命名原則：位點后加“* *”，再加數(shù)字表

13、示。，再加數(shù)字表示。如如drb4drb4* *01 03 1 02 n01 03 1 02 n 第第1 1、2 2位數(shù)表示位數(shù)表示hlahla抗原的特異性，第抗原的特異性，第3 3、4 4位數(shù)表示等位基因（亞位數(shù)表示等位基因（亞型），結尾加型），結尾加n n表示無效等位基因或不表達基因。表示無效等位基因或不表達基因。v hlahla等位基因所對應的血清學特異性，可查閱過等位基因所對應的血清學特異性，可查閱過whowho公布的公布的hlahla字典。字典。v hlahla低分辨水平基因定型：確定低分辨水平基因定型：確定hlahla基因前基因前2 2位數(shù)。位數(shù)。vhlahla高分辨水平基因定型：確

14、定高分辨水平基因定型：確定hlahla基因第基因第4 4位以后的數(shù)字。位以后的數(shù)字。hla的生物學功能的生物學功能vhlahla參與免疫應答反應，與抗原肽結合形成參與免疫應答反應，與抗原肽結合形成hla-hla-抗原肽復合物，抗原提呈細胞將此復合抗原肽復合物，抗原提呈細胞將此復合物交由物交由t t淋巴細胞處理，淋巴細胞處理，t t細胞上的細胞上的t t細胞受體細胞受體（tcrtcr）能夠對抗原提呈細胞上的）能夠對抗原提呈細胞上的hla-hla-抗原肽抗原肽復合物產(chǎn)生雙識別，從而介導免疫反應。復合物產(chǎn)生雙識別，從而介導免疫反應。t t細胞受體對細胞受體對hla-hla-抗原肽復合物的抗原肽復合物

15、的雙識別作用雙識別作用人類白細胞抗原（人類白細胞抗原（hla）的應用）的應用vhla分型在骨髓和器官移植組織型分型在骨髓和器官移植組織型v法醫(yī)學親子鑒定和個體識別法醫(yī)學親子鑒定和個體識別v人類種群學人類種群學v安全輸血安全輸血v疾病相關聯(lián)的研究等領域疾病相關聯(lián)的研究等領域（如（如hla-b27）hla分型技術分型技術1、傳統(tǒng)的血清學和細胞學分型方法、傳統(tǒng)的血清學和細胞學分型方法 因需要有活性的細胞、定型血清或分型細胞來源困難、分型準確性較因需要有活性的細胞、定型血清或分型細胞來源困難、分型準確性較差等原因，已逐步被淘汰。差等原因，已逐步被淘汰。 2、pcr為基礎的為基礎的hla基因分型技術基因

16、分型技術 分型所需要的血樣量少，不需要有活性的細胞，實驗重復性好、結果的準分型所需要的血樣量少，不需要有活性的細胞，實驗重復性好、結果的準確性高，易于質控和準標化。確性高，易于質控和準標化。hla基因分型技術取代了血清學方法?；蚍中图夹g取代了血清學方法。 當前的當前的“中國造血干細胞捐獻者資料庫中國造血干細胞捐獻者資料庫”的建庫技術，不同于的建庫技術，不同于以往的以往的“中華骨髓庫中華骨髓庫”。前者采用基因定型技術檢測。前者采用基因定型技術檢測hla-a、b、drb1基因，后者采用血清學方法檢測基因，后者采用血清學方法檢測hla-a、b抗原。抗原。“中國造血干細胞捐獻者資料庫中國造血干細胞捐

17、獻者資料庫”對捐獻對捐獻者血樣者血樣hla基因分型技術的要求基因分型技術的要求v對對hla-ahla-a、b b和和drb1drb1進行基因分型，分辨率達低分辨進行基因分型，分辨率達低分辨水平。水平。v結果既報告每一樣本的基因型，同時報告對應的特結果既報告每一樣本的基因型，同時報告對應的特異性。異性。v通過各省級組織配型實驗室室內質控，以及國家通過各省級組織配型實驗室室內質控，以及國家“hlahla質控實驗室質控實驗室”組織的室間質控對組織的室間質控對hlahla基因分型基因分型的準確性進行質量監(jiān)控。的準確性進行質量監(jiān)控。hla基因分型技術基因分型技術vpcr-序列特異性引物（序列特異性引物（

18、pcr-ssp）vpcr-sso流式磁珠分析流式磁珠分析vhla測序分型（測序分型（sbt）vpcr-序列特異性寡核苷酸探針（序列特異性寡核苷酸探針（pcr-ssop）v基因芯片技術基因芯片技術v參比鏈介導的構象分析參比鏈介導的構象分析(rsca) vhla單倍體基因測序單倍體基因測序hlahla基因分型的步驟基因分型的步驟 1、dna提取提取 2、pcr擴增擴增 3、pcr擴增產(chǎn)物的檢測擴增產(chǎn)物的檢測 4、結果分析（判別受檢者、結果分析（判別受檢者hla基因型）基因型） 5、hla基因定型報告基因定型報告 pcr-pcr-序列特異性引物（序列特異性引物（pcr-ssp）分型技術）分型技術 基

19、本原理：基本原理： 使用序列特異性引物（使用序列特異性引物（ssp）特異性擴增特異性擴增hla等位基因，電泳等位基因，電泳分離分離pcr擴增產(chǎn)物，根據(jù)是否存擴增產(chǎn)物，根據(jù)是否存在在pcr產(chǎn)物以及片段大小，確定產(chǎn)物以及片段大小，確定相應基因。相應基因。 主要步驟：主要步驟： 1、dna提取提取 2、pcr擴增擴增 3、瓊脂糖凝膠電泳檢測、瓊脂糖凝膠電泳檢測 4、結果分析、結果分析pcr-pcr-序列特異性引物（序列特異性引物（pcr-ssp）分型技術）分型技術pcr-pcr-序列特異性引物序列特異性引物（pcr-ssp）分型技術）分型技術v特點：簡便、快速、直觀等，特別適合于尸特點：簡便、快速、

20、直觀等，特別適合于尸腎移植的組織配型；所需設備簡單，易于開腎移植的組織配型；所需設備簡單，易于開展；為常規(guī)采用的經(jīng)典展；為常規(guī)采用的經(jīng)典hla基因分型技術?；蚍中图夹g。v應用：適合于經(jīng)典應用：適合于經(jīng)典hla-、類分子的基類分子的基因分型因分型v分辨率：低分辯、高分辯基因分型水平。分辨率：低分辯、高分辯基因分型水平。pcr-sso流式磁珠分析技術流式磁珠分析技術 v基本原理：基本原理：以反向核酸雜交為基礎，雜交產(chǎn)物以反向核酸雜交為基礎，雜交產(chǎn)物采用流式磁珠儀進行自動檢測，為高通量采用流式磁珠儀進行自動檢測，為高通量hlahla基因定型技術?；蚨ㄐ图夹g。pcr-sso流式磁珠分析技術的特點（

21、一）流式磁珠分析技術的特點（一）v實驗原理、引物設計、擴增產(chǎn)物的檢測等，與實驗原理、引物設計、擴增產(chǎn)物的檢測等，與sspssp分分型技術不同。型技術不同。vpcr擴增反應結束后，將標記探針的磁珠直接加入擴增反應結束后，將標記探針的磁珠直接加入pcrpcr產(chǎn)物中，微量離心管（反應板）置于產(chǎn)物中，微量離心管（反應板）置于pcr擴增儀擴增儀上進行分子雜交；上進行分子雜交；v雜交產(chǎn)物用流式磁珠儀進行自動進樣檢測，用雜交產(chǎn)物用流式磁珠儀進行自動進樣檢測，用hlahla分分析軟件確定析軟件確定hla基因型。基因型。 流式磁珠分析技術的特點（二）流式磁珠分析技術的特點（二）v配合配合dnadna全自動全自動

22、dnadna提取儀及多個提取儀及多個pcrpcr基因擴增儀，具基因擴增儀，具有高通量、操作簡便、快速特點。適合骨髓庫、臍有高通量、操作簡便、快速特點。適合骨髓庫、臍血庫大批量樣本的血庫大批量樣本的hla基因分型工作。基因分型工作。v基于流式磁珠分析技術，已有多家商品化、低分辯基于流式磁珠分析技術，已有多家商品化、低分辯水平的水平的hlahla基因分型試劑盒?；蚍中驮噭┖小可用于可用于hla-ahla-a、b b、c c、drb1drb1和和dqb1dqb1座位的基因分型。座位的基因分型。hlahla測序分型（測序分型（sbtsbt）技術）技術 hla-座位座位 檢測對象檢測對象 hla-a第第2，3，4 外顯子的正、反向序列外顯子的正、反向序列 hla-b第第2，3，4 外顯子的正、反向序列外顯子的正、反向序列 hla-cw第第2，3外顯子正、反向序列外顯子正、反向序列 hla-drb1第第2外顯子正、反向序列，外顯子正、反向序列，condon 86反反向序列。向序列。 hla-dqb1第第2外顯子正、反向序列，第外顯子正、反向序列，第3外顯子的外顯子的反向測序。若存在反向測序。若存在dqb1*0201/0202 或或 0301/0309，分析第，分析第3外顯子的測序結果。外顯子的測序結果。hlahla測序分型（測序分型（sbtsbt）技術）技術v國際公認