雙酶切連接反應(yīng)常見(jiàn)問(wèn)題分析

1、.前一陣子一直在做雙酶切質(zhì)粒重組，失敗了很多次，不過(guò)很快改善了實(shí)驗(yàn)方法，用2周重組了14個(gè)質(zhì)粒?，F(xiàn)就自己的體會(huì)，談一下質(zhì)粒重組的一些個(gè)人經(jīng)驗(yàn)。1. 回收PCR產(chǎn)物：在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)候，給引物兩端設(shè)計(jì)好酶切位點(diǎn)，一般說(shuō)來(lái)，限制酶的選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。選好酶切位點(diǎn)后，在各個(gè)酶的兩邊加上保護(hù)堿基。雙酶切時(shí)間及其體系：需要強(qiáng)調(diào)的是很多人建議酶切過(guò)夜，其實(shí)完全沒(méi)有必要，我一般酶切3個(gè)小時(shí)，其實(shí)1個(gè)小時(shí)已經(jīng)足夠。應(yīng)用大體系，如100微升。2. 純化問(wèn)題：純化PCR產(chǎn)物割膠還是柱式，我推薦柱式，因?yàn)楦钅z手法不準(zhǔn)，很容易割下大塊的膠，影響純化效率?，F(xiàn)在的柱式純化號(hào)稱(chēng)可以祛

2、除引物，既然如此，酶切掉的幾個(gè)堿基肯定也會(huì)被純化掉了。所以，PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物的純化均可應(yīng)用柱式純化。3. 酶量的問(wèn)題：對(duì)1單位酶的定義如下：在50l 反應(yīng)液中，30溫度下反應(yīng)1小時(shí)，將1g 的DNA完全分解的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。 而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的因素外，該酶可分解15g的DNA，而一般從1-4ml菌液提出的DNA約為3g，而PCR純化后的產(chǎn)物（50體系）約為3g，所以即便全部加進(jìn)去，只要純化的質(zhì)量好，酶切完全切得動(dòng)。4. 酶切、回收后的PCR產(chǎn)物與載體的連接：摩爾比的計(jì)算，很多人憑經(jīng)驗(yàn)也可以。但對(duì)于初學(xué)者從頭認(rèn)真計(jì)算則非常有必要。回收的載體片段：回收

3、的PCR產(chǎn)物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol為單位的DNA轉(zhuǎn)換為為g單位的DNA：（X pmoles長(zhǎng)度bp650）/ 1,000,000（注：長(zhǎng)度bp650是該雙鏈DNA的分子量）所得數(shù)值即為g，也可以直接用這個(gè)公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66g，如載體是5380bp，則0.03pmol為0.035.380.66=0.106524g。5. 測(cè)DNA濃度：測(cè)DNA濃度可以在專(zhuān)用機(jī)子上測(cè) ，注意OD值，一般約1.8-2.0.另外，如果嫌麻煩，也可用MARKER進(jìn)行估測(cè)，如MARKER2000，5微升的 MARKER每個(gè)條帶約50ng。6

4、. 連接反應(yīng)：TAKARA的 連接酶上的 說(shuō)明寫(xiě)的過(guò)夜，而其對(duì)連接酶單位的定義為：在20 l的連接反應(yīng)體系中，6 g的DNA-Hind III的分解物在16下反應(yīng)30分鐘時(shí)，有90%以上的DNa段被連接所需要的酶量定義為1個(gè)活性單位（U）。而它的濃度為350 U/l ，所以完全夠用。連接酶容易失活，注意低溫操作，最好在冰上。時(shí)間3個(gè)小時(shí)足已。7.轉(zhuǎn)化： 全量（10 l）加入至100l JM109感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。 42加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。 加入890 l AMP陰性培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)60分鐘。取100l鋪板。也可離心后余100l幾個(gè)非常重要的問(wèn)題：1 做轉(zhuǎn)化的時(shí)

5、候，進(jìn)行酶連接反應(yīng)時(shí)，注意保持低溫狀態(tài)，因?yàn)長(zhǎng)IGASE酶很容易降解。為保險(xiǎn)起見(jiàn)，一般連接3小時(shí)，16度。2 對(duì)含有AMP-RESISTENCE的質(zhì)粒鋪板時(shí)，注意加AMP時(shí)的溫度，溫度過(guò)高，會(huì)使克隆株無(wú)法篩選出來(lái)。我的方法是培基高溫消毒后放在烤箱里，烤箱一般溫度為55-60度，然后做的時(shí)候拿出來(lái)，這樣好掌握溫度。鋪板前后注意用吹風(fēng)機(jī)吹干。3對(duì)照的設(shè)立：為驗(yàn)證雙酶切是否成功，可做如下對(duì)照：A 酶切反應(yīng)時(shí)加各單酶分別切，兩管，用同一種BUFFER，跑膠，看單切的兩管是否成線(xiàn)性。如兩管均成線(xiàn)性可初步判斷雙酶切成功。做轉(zhuǎn)化時(shí)，也要進(jìn)行對(duì)照。設(shè)4個(gè)： 即拿雙酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物也進(jìn)行連接反應(yīng)，這個(gè)對(duì)照可進(jìn)一步

6、看雙酶切是否成功，如果長(zhǎng)出克隆，說(shuō)明很有可能只進(jìn)行了單酶切，如沒(méi)長(zhǎng)出克隆，則證明雙酶切成功，當(dāng)然要保證感受態(tài)，培基，連接酶都正常的情況下。 酶切過(guò)的未進(jìn)行連接反應(yīng)的雙酶切產(chǎn)物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質(zhì)粒。 設(shè)原始質(zhì)粒為對(duì)照，意為檢測(cè)整個(gè)操作過(guò)程中是否有誤。 AMP陰性板上用同一批感受態(tài)細(xì)胞鋪板20微升足夠，檢測(cè)感受態(tài)狀況。4. 所有的試劑切記低溫保存。注意設(shè)立對(duì)照。經(jīng)PCR鑒定，克隆90%-100%的陽(yáng)性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑選4個(gè)就足夠了。然后雙酶切鑒定，測(cè)序。同步雙酶切是一種省時(shí)省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同時(shí)作用的最佳緩沖液是非常重要的一步。

7、NEB每一種酶都隨酶提供相應(yīng)的最佳NEBuffer，以保證100%的酶活性。NEBuffer的組成及內(nèi)切酶在不同緩沖液中的活性見(jiàn)內(nèi)切酶在不同緩沖液里的活性表及每支酶的說(shuō)明書(shū)。能在最大程度上保證兩種酶活性的緩沖液即可用于雙酶切。由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液條件下的切割速率會(huì)減緩，因此使用時(shí)可根據(jù)每種酶在非最優(yōu)緩沖液中的具體活性相應(yīng)調(diào)整酶量和反應(yīng)時(shí)間。如果找不到一種可以同時(shí)適合兩種酶的緩沖液，就只能采用分步酶切。分步酶切應(yīng)從反應(yīng)要求鹽濃度低的酶開(kāi)始，酶切完畢后再調(diào)整鹽濃度直至滿(mǎn)足第二種酶的要求，然后加入第二種酶完成雙酶切反應(yīng)。使用配有特殊緩沖液的酶進(jìn)行雙酶切也不復(fù)雜。在大多數(shù)情況下，采用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的酶也能在這些特殊緩沖液中進(jìn)行酶切。這保證了對(duì)緩沖液有特殊要求的酶也能良好工作。由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液中進(jìn)行酶切反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)速度會(huì)減緩，因此需要增加酶量或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。通過(guò)內(nèi)切酶在不同緩沖液里的活性表可查看第二種酶在特殊緩沖液相應(yīng)鹽濃度下的作用活性。雙酶切建議緩沖液注：只要其中一種酶需要添加BSA，則應(yīng)在雙酶切反應(yīng)體系中加入BSA。BSA