2生物大分子分離純化技術(shù)1

1、1第二章第二章生物大分子分離純化技術(shù)生物大分子分離純化技術(shù)2 生化物質(zhì)分離的特殊性：要求：分離方法簡便，選擇性好，效率高，保持生化物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型，分離方法盡量不影響生化物質(zhì)的生物活性。 由于生化物質(zhì)一般都很脆弱，易受化學(xué)、物理因素影響而變性，因而分離過程常要求在低溫、潔凈、溫和的條件下進行。 本章所提到的生物大分子主要是指蛋白質(zhì)、酶及核酸。3生化及臨床分析樣品的預(yù)處理。生物樣品的常規(guī)分離純化方法，如透析、微過濾、冷凍干燥及離心技術(shù)；生物大分子的電泳分離純化技術(shù)；生物大分子的色譜分離純化技術(shù)；本章主要的內(nèi)容包括：42.1 生化分析樣品的準備與預(yù)處理 生化樣品極其復(fù)雜，首先應(yīng)對所關(guān)心的待測物

2、處于生物體的哪一個部位所獲得原始的樣品，并對實際分析之前應(yīng)進行怎樣的處理必須有所了解。52.1.1 樣品的類型、采集及保存樣品的類型 生化及臨床分析的樣品對象非常廣泛，分布于動物或人體的每一個部位。它們可以是內(nèi)源性的化合物或外源性的化合物。樣品的基質(zhì)可以是簡單的血樣、尿樣，也可以是比較復(fù)雜的糞便以至整個組織。這些基質(zhì)非常復(fù)雜，常常由多相組成，如血漿和血細胞及多種分子量大小不同的化合物。被分析對象的穩(wěn)定性也變化極大，有只能穩(wěn)定存在幾分鐘、對蛋白酶極為敏感的肽類，也有幾乎是完全穩(wěn)定的藥物的代謝物。6樣品的采集 對于給定的樣品。采集處理速度與樣品的代謝活性與它們的化學(xué)和生化穩(wěn)定性密切相關(guān)。 尿液中各

3、種樣品的濃度一般認為可穩(wěn)定幾小時。組織樣品一般需要快速冷凍以防止發(fā)生變化，采樣者應(yīng)該有相應(yīng)的樣品采集及保存的設(shè)備。71. 血樣 成人平均含6l的血液、其中約55的血漿和45的細胞。血樣的采集一般采取清晨空腹采血，以避免飲食、運動、情緒等對血液成分的影響。動物一般采取禁食1216h后采血，一般生化檢驗所需的血液標本采取靜脈抽血。8血樣有全血、血漿和血清之分。92組織樣品 組織樣品通常采自肝、肌肉、肺、骨髓或腸。這類組織是代謝活性的，因此采樣后幾秒之內(nèi)要在液氮中或其它冷卻劑中冷凍。液氮10樣品的保存樣品的保存 一般來說，任何生物樣品采集后都應(yīng)立即進行分析。但由于種種原因，這往往是不可能的。樣品也許

4、需要運送到實驗室，也許完成一個研究需要所有的樣品同時測定。任何在法律上有效的分析必須注明保存日期及保存條件等。11 生物體液中許多成分保存在室溫或4下時，由于沉淀、蒸發(fā)、氧化或細菌的進攻等原因，其濃度會發(fā)生變化。對于血清樣品，若對其中的鈉或血清白蛋白進行分析，當樣品保存在-20時，20天內(nèi)不會發(fā)生明顯的變化。有些成分在保存期間確實可以發(fā)生明顯的變化，如兒茶酚胺，因此必須保存于20或70下，必要時可以加一些抗氧化劑或酶抑制劑。讓血漿或血清與紅血球接觸時，由于酶活性的改變成被分析對象在細胞內(nèi)外分布的變化會使分析結(jié)果發(fā)生變化。所以、一般要快速分離成單一的相。12樣品的初步處理 盡管許多化合物在全血漿

5、中更為穩(wěn)定，但另一些，如氨基酸則應(yīng)保存在不含蛋白質(zhì)的溶液中。許多樣品分析之前都要求除去蛋白質(zhì)，用于去除蛋白質(zhì)的各種沉淀方法的比較見表：13常用蛋白質(zhì)沉淀方法的比較常用蛋白質(zhì)沉淀方法的比較142.1.2 2.1.2 酶樣品的準備酶樣品的準備 酶是一種具有催化活性的蛋白質(zhì)，它的催化活性是其特征參數(shù)。任何分離純化步驟都應(yīng)考慮酶的生物活性的保持問題。 生理樣品中酶的絕對濃度的測定從原理上講是很簡單的，分析時的主要問題是純的酶標樣的獲得。15 酶在天然界中總是存在于很復(fù)雜的混合物中，通常一種細胞中可能含有成百上千種酶，為了了解和分析一個復(fù)雜生理樣品，如亞細胞器、細胞或整個組織中的酶，就必須將酶放在一個盡

6、可能簡單的體系中進行研究。通過對單一酶的研究可以獲得酶對哪些底物具有特異性、反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)及酶作用方式。所有這些數(shù)據(jù)對于研究酶在復(fù)雜體系中的功能是非常重要的。在許多醫(yī)學(xué)及工業(yè)應(yīng)用方面是否具有純的酶制劑非常關(guān)鍵。16酶活性的保持 要獲得生理樣品酶功能研究的可靠數(shù)據(jù)必須對酶進行純化。在整個純化過程中如何保持酶的活性是最關(guān)鍵的，細胞內(nèi)酶在分離純化過程中能抗各種環(huán)境對酶活性的影響。但當酶從天然的保護環(huán)境中釋放出來后，它對每一步純化步驟都很敏感，細胞膜酶對溶解尤其敏感。17 可溶性蛋白質(zhì)不論是存在于細胞質(zhì)的還是細胞器內(nèi)的，其蛋白質(zhì)濃度從100 mg/ml 到高達400 mg/ml (線粒體基質(zhì)內(nèi))。體

7、系中存在各種天然的還原劑(如谷胱甘肽)使蛋白質(zhì)保持高的還原電位。其它穩(wěn)定劑也存在，如不同的底物及產(chǎn)物。在蛋白質(zhì)純化過程中組織被破壞，蛋白質(zhì)從它們的保護環(huán)境中釋放出來被限制在不同部位的蛋白水解酶也同時被釋放出來。所以要對所關(guān)心的酶進行保護，以防止其被氧化、水解或不可逆變性。18 通過控制純化過程中的ph、溫度及有機溶劑的使用可以防止酶的變性。所使用緩沖溶液的ph應(yīng)控制在6-8之間，并保持合適的離子強度使其可以防止酶變性。將純化過程的溫度降低至15-25可以使許多降解過程減慢3-5倍。19 酶在稀溶液中由于對器皿壁或色譜填料的吸附會引起變性。吸附使酶的四級結(jié)構(gòu)解離而失去活性，這種變性可以通過加入載

8、體蛋白來阻止。比較常用的載體蛋白有牛血清白蛋白，或商品化的結(jié)構(gòu)簡單、分子量已知的合成蛋白。載體蛋白選擇條件：1. 與酶之間無相互作用；2.分子量與酶的分子量差至少12倍，以便必要時可以很方便地用排阻色譜將二者分離。20 一些特殊的反應(yīng)會使催化活性部位的活性喪失一些。在純化過程中一些輔助因子的失去會使酶的活性喪失，為此可以在純化緩沖液中加入輔助因子。 催化活性部位氨基酸殘基的共價化學(xué)修飾很常見，最易被修飾的氨基酸為半胱氨酸。r-sh+r-shr-s-s-r21 對巰基氧化的防止：1. edta絡(luò)合金屬離子(非金屬酶)2. 加入含巰基試劑，如巰基乙醇、2,3-二巰基丙醇、巰基葡萄糖酸、谷胱甘肽、半

9、胱氨酸等22對蛋白質(zhì)酶解的防止： 蛋白水解酶來自活細胞的內(nèi)部，哺乳動物將其包裝在溶酶體中，而在微生物中它們則存在于質(zhì)膜和細胞壁之間。在用細胞勻漿法制備酶提取物時會發(fā)生蛋白水解酶的釋放，所以對其活性要進行抑制。根據(jù)蛋白水解酶的類型可以選用不同的抑制劑。23常用蛋白酶抑制劑1. 氟代磷酸二異丙酯(dep)：可抑制絲氨酸蛋白酶，但在使用上dep比較危險，因為它具有揮發(fā)性，并能進攻人的乙酰膽堿酯酶而影響人的神經(jīng)傳導(dǎo)。2. 苯基甲基磺酰氟(pmsf)：非揮發(fā)性絲氨酸酶的抑制劑，而且不與人的乙酰膽堿酶作用。它還可以抑制一些巰基蛋白酶及羧酸肽酶。3. 胃蛋白酶抑制素和甲(乙)酰-亮-亮-精三肽是酸性蛋白水解

10、酶類很強的抑制劑，被抑制的酶有胃蛋白酶、組織蛋白酶及酵母蛋白酶a。24 由于細胞質(zhì)中含有高達10一15(w/v)的非水成分，處在蛋白質(zhì)周圍的水分子不能自由流動而使蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)加以穩(wěn)定。在酶提取物制備過程中為了模擬這種情況，通常加入非水的親水分子：甘油或糖醇如葡萄糖、果糖、乳糖及山梨糖醇。25 在每步純化之后都要進行酶活性和蛋白質(zhì)量的測定。在純化過程中酶的比活性(u/mg)逐漸增加并最終達到最大。酶的粗提物要用硫酸銨或聚乙二醇(peg)進行分組沉淀加以濃縮，也可以用色譜吸附，然后再迅速從色譜基質(zhì)上解離下來。沉淀的蛋白質(zhì)溶解在小的體積中，這樣可由于濃度高而更穩(wěn)定。離心法(500050000 g

11、)很適合于亞細胞組分及硫酸銨和peg沉淀的酶的分離。26生理樣品中具有生物活性酶的制備生理樣品中具有生物活性酶的制備 1酶活性測定過程 確定生理樣品中酶的活性一般都要經(jīng)過以下幾個步驟： (1)酶及反應(yīng)液的制備，反應(yīng)液通常由一定濃度的底物組成，并有確定的溫度、ph及其它催化反應(yīng)所需要的輔助因子； (2)將酶加入反應(yīng)液或?qū)⒎磻?yīng)液加入到酶制劑中并進行溫育以引發(fā)反應(yīng)，隨后的測定都以引發(fā)反應(yīng)的時間為起點； (3)反應(yīng)可以用不同的方式終止，最常用的方法是使酶失去活性； 27(4)將酶反應(yīng)產(chǎn)物從酶和底物中分離出來；(5)測定和鑒定在特定的時間內(nèi)由酶反應(yīng)所生成的產(chǎn)物；(6)在有些情況下酶的活性可以用反應(yīng)速度法

12、來測定； (7)數(shù)據(jù)分析。28 2樣品的制備方法 對所有的生物樣品(組織、尿液、腦脊髓液及細胞培養(yǎng)液等)在分析之前都要進行下述準備工作； (1)研究對象的準備(如動物)； (2)標本的采集； (3)由標本制備樣品； (4)標本或樣品的形態(tài)； (5)標本或樣品的保存； (6)用于酶法分析樣品的預(yù)處理； (7)標本是來自于研究對象的一部分，并作為研究的 代表。29 從生理樣品制備具有生物活性的酶時，主要應(yīng)考慮兩種因素：1. 選擇什么樣的生物樣品作為進行純化的起始原料。如：含有器官、組織、生物液、微生物細胞及從培養(yǎng)液或發(fā)酵液中獲得的單細胞生物等；分離開的各種細胞混合物，經(jīng)溶解所釋放出來的亞細胞碎片，

13、它們包括像線粒體類的細胞器及膜組分或含可溶性成分。對這類樣品進行處理的第一步是不同細胞器的分離及可溶物與不溶物的分離，然后對膜成分進行溶解，最后將不同種類的分子加以分離。302. 樣品應(yīng)純化到什么程度。 傳統(tǒng)的純化法最終所得到的是均勻的蛋白質(zhì)溶液。樣品純化的主要目的是能夠分析單一的酶活性而不受其它物質(zhì)的干擾。但對有些研究，其它有活性成分的存在則是有利的或必要的。31 (1)從組織或器官制備樣品 組織和器官至少可以分為兩部分，即細胞和細胞內(nèi)成分。所感興趣的成分可能存在于上述兩個部分中的任何一個。將整個未損傷的細胞從穩(wěn)定的小纖維基質(zhì)中分離出來要采用細胞篩選技術(shù)。通常所使用的用于基質(zhì)破碎的方法(如切

14、、剪、粉碎)會造成一些細胞的破碎，而利用純化的酶可以對基質(zhì)進行特殊方式的破碎，如膠原酶可用來破碎哺乳動物組織。使用胰蛋白酶及其它蛋白水解酶也取得了一定的成功，這樣的方法所得到的是細胞的混合物，細胞內(nèi)成分中也包括了一些不溶性的碎片及加入的酶和試劑。32(2)從組織或器官培養(yǎng)液中制備樣品 經(jīng)培養(yǎng)的樣品通常可按類似于上面的方法進行。值得注意的是要避免由于外加的細胞內(nèi)成分及培養(yǎng)介質(zhì)所產(chǎn)生的影響。因為它們中可能含有來自于介質(zhì)本身或在樣品培養(yǎng)過程中所產(chǎn)生的具有酶活性的物質(zhì)。33 (3)從細胞培養(yǎng)液制備樣品 對在培養(yǎng)液中生長的哺乳動物細胞或細菌等樣品，在分析之前要將非細胞成分與細胞成分分開，細胞與培養(yǎng)液的分

15、離采用低速離心就可以實現(xiàn)，上清液要進行酶活性分析，濾餅留下來用于溶解和分析。 總之，酶樣品的制備區(qū)別于其它的生物大分子，其預(yù)處理過程相對較復(fù)雜，應(yīng)根據(jù)實驗的要求嚴格進行每步操作。342.2 生物樣品的常規(guī)分離純化方法2.2.1 透析(dialysis) 透析是用于生物大分子分離和純化的一種簡單而古老的方法，它是在滲透中既有溶劑流動又有溶質(zhì)流動的過程。操作：把待分離或純化的樣品封入由半透膜組成的透析袋內(nèi)，然后將袋子放入低離子強度的透析液中進行透析。根據(jù)半透膜規(guī)格的不同，只有膜內(nèi)分子量小于分子量阻截范圍的分子才可以透過膜進入透析液中，從而實現(xiàn)大分子與小分子的分離或生物大分子的純化35 操作要點：

16、為了加速透析的進程，一般在透析的過程中要進行連續(xù)攪拌，同時在透析袋內(nèi)留下大約透析袋總體積10的空隙，以便使得透析膜界面兩側(cè)能透過膜的分子濃度梯度加大。透析平衡的時間一般為46小時，進一步透析需要換液?？紤]到被透析的生物分子較高溫度下易變性，透析一般在34c下進行。36透析膜 常用的透析膜材料有火棉膠、玻璃紙以及纖維素等。膜孔徑的大小可以有不同的規(guī)格，在醫(yī)藥工業(yè)中常使用纖維素透析管，其分子量阻截范圍為1.0 x1035.0 x104。37透析管的選擇：主要考慮分子量阻截范圍其次考慮管的尺寸38透析管的預(yù)處理 透析管使用之前一般要進行適當?shù)奶幚?，以除去諸如甘油、重金屬離子、含硫污染物及可能存在的蛋

17、白或核酸水解酶類。1%乙酸浸泡1h水洗堿性edta煮1h水洗浸泡水中保存39透析液 最常用的透析液是水，一定ph和離子強度的緩沖液或高分子惰性物質(zhì)的濃溶液。在純的水中透析一般速度比較快但有造成生物物質(zhì)活性喪失的危險。所以，通常選擇具有一定ph和離子強度的緩沖液作為透析液有時也可以選擇高分子惰性物質(zhì)的濃溶液，因為高分子不會進入膜內(nèi)而水分子可以自由出入膜孔。在這種情況下，除了正常的透析之外，由于膜內(nèi)外滲透壓差的存在，膜內(nèi)更多的水會透析到膜外，直到內(nèi)外滲透壓達到平衡為止，因而，也具有濃縮樣品的功能，40透析的主要用途是從生物大分子樣品中除去鹽類或其它小分子物質(zhì)。透析的應(yīng)用透析的應(yīng)用1. 在分離及純化蛋白質(zhì)及菌時經(jīng)常要加入有機溶劑或無機鹽類，如硫酸銨或硫酸鈉以沉淀蛋白質(zhì)類生物大分于，由于生物大分子在沉淀的同時會不可避免地混雜有這些小分子，從而干擾生物大分子的進一步純化或性質(zhì)鑒定。透析法是除去這些小分子的簡便而有效的方法。412. 用來除去與生物大分子結(jié)合較弱的小分子或離子，如金屬離子及酶的輔助因子nad，fad等。當透析要除去金屬離