微生物中的代謝足跡方法及在功能基因組和生物技術(shù)中的應(yīng)用

1、微生物中的代謝足跡：方法及在功能基因組和生物技術(shù)中的應(yīng)用 陳崇波 10808077 2009.05.13 valeria mapelli, lisbeth olsson and jens nielsenl 代謝足跡給我們提供了功能基因組學(xué)和菌株特性的一些重要信息 l 代謝足跡為科學(xué)家對(duì)細(xì)胞通訊，代謝工程和生物技術(shù)工藝的認(rèn)識(shí)提供重要的方法 l 代謝足跡能夠給我們提供一些關(guān)于胞內(nèi)代謝情況的重要信息 l 從代謝足跡中得到的重要信息給能夠幫助我們進(jìn)一步破譯代謝網(wǎng)絡(luò) 在代謝組分析中提到的一些概念 代謝組：由細(xì)胞合成的，與代謝作用有關(guān)的一整套代謝物。代謝組由胞內(nèi)代謝組和胞外代謝組構(gòu)成。 代謝指紋：由核磁共

2、振或質(zhì)譜分析獲得的光譜圖，提供由胞內(nèi)代謝物得到的“印記”。一般地，代謝指紋并不提供對(duì)特定代謝物的定性或定量的檢測(cè)。 代謝足跡：由核磁共振或質(zhì)譜分析得到的光譜圖，提供由胞外代謝物得到的“印記”。一般地，代謝足跡并不提供特定代謝物的定性檢測(cè)，相反，它依賴于描述數(shù)據(jù)趨勢(shì)的規(guī)律的發(fā)展，這些數(shù)據(jù)涉及到的只是少數(shù)的變量。對(duì)代謝指紋和代謝足跡的平行分析，能夠顯示胞內(nèi)代謝物與胞外代謝物可能的相互聯(lián)系，因此能幫助我們鑒定可能的新的代謝物功能。在代謝組分析中提到的一些概念 代謝物譜型：對(duì)一組特定的具有相似物理化學(xué)性質(zhì)或代謝途徑的代謝物進(jìn)行定性和定量檢測(cè)后的分析結(jié)果。 代謝物靶向分析：對(duì)感興趣的一種或幾種代謝物進(jìn)行

3、定量的分析，忽略樣本中出現(xiàn)的非靶向峰圖。代謝足跡的分析工具直接噴射法質(zhì)譜： 代謝樣本直接噴射到離子源前，因此可以繞開色譜的分離。電噴射離子化質(zhì)譜通常用于極性代謝物的檢測(cè)，而大氣壓化學(xué)電離用于低極性和非極性代謝物的分析，其靈敏度還有待提高。直接噴射法質(zhì)譜允許對(duì)原樣品或樣品的粗提物進(jìn)行高通量的分析，一般每個(gè)樣品需要1到3分鐘。直接噴射法質(zhì)譜的主要缺點(diǎn)是所謂的“基質(zhì)效應(yīng)”，它使得檢測(cè)不同基質(zhì)的樣本在靈敏度和定量的準(zhǔn)確度方面均有所下降 代謝足跡的分析工具質(zhì)譜偶聯(lián)： 它包含所有的這些分析技術(shù)，先對(duì)代謝物進(jìn)行色譜分離再進(jìn)行質(zhì)譜分析，因此能對(duì)代謝物進(jìn)行定性和定量的分析。在代謝組中，最常用的色譜分析技術(shù)是氣相

4、色譜（氣相色譜-質(zhì)譜），還有經(jīng)常用于靶向分析的高效液相色譜（高效液相色譜-質(zhì)譜），另外還有毛細(xì)管電泳（毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜）。目前，飛行時(shí)間質(zhì)譜分析器是代謝組分析的首選儀器，因?yàn)樗哂腥|(zhì)量掃描能力和提供全部的質(zhì)譜圖，所以使得它對(duì)代謝物的檢測(cè)具有很好的靈敏度。代謝足跡的分析工具 核磁共振法：核磁共振大量地應(yīng)用于代謝組學(xué)的研究，得益于它的特異性和非選擇性。這就意味著，我們觀察到的每個(gè)共振對(duì)應(yīng)于特異的化合物，它可提供一個(gè)樣品中關(guān)于結(jié)構(gòu)的豐富信息。核磁共振不需要分析的預(yù)篩條件，比如色譜分析的離子源或色譜分析的運(yùn)行條件。 振動(dòng)光譜法：傅里葉轉(zhuǎn)換紅外儀，是當(dāng)前比較廣泛應(yīng)用的技術(shù)，可以獲得生物樣本的光譜指紋。

5、傅里葉轉(zhuǎn)換紅外儀具有快速、無需反應(yīng)試劑，對(duì)復(fù)雜生物樣本的非破壞分析等優(yōu)點(diǎn)，因此，便于高通量篩選和無偏性的測(cè)定。該技術(shù)的主要缺點(diǎn)是靈敏度相對(duì)較低，這使得我們很難將得到的信心整合到生物信息當(dāng)中去。胞外代謝物的自然角色l 在胞外微環(huán)境中，胞外代謝物水平的任何改變都會(huì)直接反映由體系中微生物活動(dòng)而引起的環(huán)境的變化。 舉個(gè)例子，營養(yǎng)會(huì)被消耗，許多胞外代謝物作為代謝活動(dòng)的副產(chǎn)物會(huì)形成。此外，微生物所接觸的環(huán)境的真實(shí)狀況，會(huì)影響微生物的代謝狀況，進(jìn)而影響到釋放到微環(huán)境中的代謝物。l 微生物能根據(jù)微環(huán)境進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控以最大化地利用自然資源。 舉個(gè)例子，在厭氧條件下或在有氧條件，但存在氧化抑制劑情況下，啤酒酵母產(chǎn)

6、生乙醇，以維持合適的氧化還原的平衡。在厭氧條件下，啤酒酵母不能消耗它產(chǎn)生并釋放到環(huán)境中的乙醇，但在有氧條件下，酵母能利用乙醇作為碳源，從而導(dǎo)致堿性厭氧代謝到有氧呼吸代謝的轉(zhuǎn)換。 l 那些不是由細(xì)胞分泌或排出的代謝物（比如磷酸烯醇式丙酮酸，）在胞外的存在，可作為細(xì)胞溶解的一個(gè)標(biāo)記，因此能夠向我們提供細(xì)胞特定生長條件下的一些信息，比如ph，滲透壓，它們能指示細(xì)胞內(nèi)壓力胞外代謝物的自然角色 此外，代謝物還具有重要的作用，這就是所說的細(xì)菌群感效應(yīng)（qs），它依靠細(xì)胞感應(yīng)胞外的代謝物。 細(xì)胞的群感效應(yīng)是調(diào)控生物膜形成和其它生物學(xué)功能的機(jī)制。細(xì)菌能夠分析特定的信號(hào)分子并感應(yīng)它的濃度，當(dāng)信號(hào)分子濃度達(dá)到閾值

7、是，細(xì)菌就能夠引發(fā)包括致病基因在內(nèi)的相關(guān)基因的表達(dá)，以適應(yīng)環(huán)境的變化。胞外代謝組與胞內(nèi)代謝組的偶聯(lián)代謝足跡能帶來的重要生物的信息代謝足跡的應(yīng)用和可能的成果 通過代謝足跡進(jìn)行細(xì)菌群感效應(yīng)的研究 很多病原菌利用細(xì)菌群感效應(yīng)（qs）機(jī)制來進(jìn)行增值和攻擊它們的宿主。 慢性疾病的感染主要原因是具有在生物膜系統(tǒng)中持續(xù)存在的能力，而這些生物膜系統(tǒng)通常是攻不破的，即使在抗生素的壓力下，比如由菌綠假單胞菌引起的肺腑感染。在這些條件下，特異性地靶向靶向能誘導(dǎo)生物膜形成的qs分子，將是一種消滅微生物毒力的很有前景的方法，由于沒有威脅到微生物的生存，因此降低了導(dǎo)致耐藥性突變的選擇壓力的發(fā)生。然而，由于qs分子的性質(zhì)和

8、作用方式的多樣性，這些因素能改變依靠qs分子的濃度和感染情況，因此，qs分子拮抗物的設(shè)計(jì)可能不是很容易完成的工作。 代謝足跡的分析可提供一種從微生物群落胞外代謝物中，鑒定出潛在qs代謝物的有效方法 代謝足跡的應(yīng)用和可能的成果 功能基因組學(xué)和菌株的鑒定 由于光譜技術(shù)在高通量應(yīng)用方面的不斷發(fā)展，還有與代謝指紋相比，代謝足跡比較容易獲得，這使得代謝足跡成為一種在功能基因組研究中強(qiáng)有效的方法。酵母和大腸桿菌的不同基因突變，其基因是與代謝組密切相關(guān)的，則根據(jù)代謝足跡能成功地將它們區(qū)分開來。 這種方法依靠對(duì)小部分的差異（質(zhì)譜峰）的鑒定，這些差異的變化有一個(gè)規(guī)律，就是它們與特定的突變有關(guān)。因此，代謝足跡能夠

9、用于第一輪的分析，確定能區(qū)分歸因于變異的質(zhì)譜峰。 微生物菌種的快速鑒別不僅與功能基因組學(xué)有關(guān)，而且與工業(yè)生物技術(shù)有關(guān)，在工業(yè)生物技術(shù)中，新的高產(chǎn)菌株的鑒定具有重要的意義。舉個(gè)例子來說，通過代謝足跡對(duì)啤酒酵母進(jìn)行鑒別和分類，揭示了對(duì)那些由于基因組的內(nèi)在復(fù)雜性，而不能在基因水平上區(qū)分的啤酒酵母菌株進(jìn)行分類是可行的 代謝足跡的應(yīng)用和可能的成果 新的代謝途徑的發(fā)現(xiàn)和代謝工程 目前，相當(dāng)多的工業(yè)研究興趣聚焦在植物纖維的降解上，通過發(fā)酵的方法，將其作為原材料用于乙醇或其它燃料和化合物的生產(chǎn)。在這方面研究的一個(gè)主要目標(biāo)是使植物多糖（纖維素和半纖維素）進(jìn)行完全地降解成單糖（木糖和阿拉伯糖），理想的是不使用化學(xué)

10、試劑或只采用酶催化的方法。微生物和反應(yīng)條件的優(yōu)化仍有待于研究，但代謝足跡提供了一個(gè)重要的信息，使得我們能夠通過鑒定胞外培養(yǎng)基中的降解產(chǎn)物來衡量降解的程度。 對(duì)來自于降解纖維素的微生物的胞外代謝物進(jìn)行定性和定量的研究，能夠提供針對(duì)瓶頸的重要線索和之前沒被鑒別的微生物代謝途徑。這些信息能與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的數(shù)據(jù)結(jié)合起來，進(jìn)一步表征那些參與纖維降解的基因或相關(guān)的代謝途徑。 代謝足跡還可以應(yīng)用于生物修復(fù)。在生物修復(fù)領(lǐng)域，通過放射性同位素標(biāo)記底物來跟蹤異性生物質(zhì)的不同降解途徑，對(duì)代謝途徑和可能的代謝抑制進(jìn)行檢測(cè)和表征，將得到進(jìn)一步的改善。 代謝足跡的應(yīng)用和可能的成果 生物過程的檢測(cè)和開發(fā) 代謝足跡能帶

11、來大量的生化信息，這些信息連同先進(jìn)的自動(dòng)分析技術(shù)的開發(fā)，使得代謝足跡成為一種能從工業(yè)水平上監(jiān)測(cè)生物過程的誘人的方法。遍及不同的生物生長階段，微生物的胞外代謝組發(fā)生根本的變化，各個(gè)不同的生長階段可以用一特定的足跡來表征，這就意味著簡單地通過讀取相應(yīng)的質(zhì)譜峰圖可以確定培養(yǎng)物的狀況 對(duì)生物過程而言，代謝足跡更重要的另一個(gè)方面是，可以用它來檢測(cè)細(xì)胞的生理狀況和能夠誘導(dǎo)胞內(nèi)壓力的環(huán)境條件。對(duì)于一給定的生物過程，代謝足跡可能有助于我們篩選最合適的菌株和生長條件，另外，通過代謝足跡，能夠揭示細(xì)胞對(duì)環(huán)境壓力和生物標(biāo)記的存在的特殊反應(yīng)，這些反應(yīng)能暗示環(huán)境中有毒化合物的存在。舉個(gè)例子來說，在廢水生物處理的過程當(dāng)中

12、，污泥培養(yǎng)物的代謝足跡，使得我們能夠?qū)⒋嬖谟谔幚淼乃胁煌愋偷幕瘜W(xué)應(yīng)力因素區(qū)分開來，比如鎘，2,4-dnt和n-ethyl-maleimide，并且這種方法為微生物感應(yīng)器的環(huán)境監(jiān)測(cè)的開發(fā)鋪平了道路。 代謝足跡的應(yīng)用和可能的成果 高通量應(yīng)用的一般過程和數(shù)據(jù)庫 代謝足跡的一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)是它作為一種高通量的分析方法，使用簡單，能同時(shí)用于實(shí)驗(yàn)室的研究和工業(yè)的就地生物處理過程。 另外，與代謝指紋相比，代謝足跡不需要任何復(fù)雜的操作程序，比如抑制（快速阻斷）胞內(nèi)代謝物，從代謝物從細(xì)胞中提取出來以及隨后的處理以便于分析。對(duì)胞內(nèi)代謝的真正分析前所需要的步驟的多寡，另外耗時(shí)長和高的成本，都可能影響結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，因此，較少的操作步驟也是代謝足跡的一個(gè)優(yōu)勢(shì) 為了把代謝足跡開發(fā)成適合高通量應(yīng)用的代謝組技術(shù)，需要具有確定峰的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，因此從ms或nmr分析得到的峰模式才能被轉(zhuǎn)譯成相關(guān)的生物信息?；诖耍敿?xì)的光譜數(shù)據(jù)庫的建立，對(duì)所有代謝組的分析，都是非常重要的，但對(duì)高通量代謝足跡則尤為重要 結(jié)論 我們能從代謝足跡的分析中獲得關(guān)于