一種產異戊二烯基因工程菌及其應用

1、說 明 書 摘 要本發(fā)明公開了一種產異戊二烯基因工程菌及其應用，屬于基因工程技術領域。本發(fā)明通過將含有乙酰輔酶A?；D移酶、3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶和油酸水合酶的基因轉化入宿主菌獲得重組菌，并利用重組菌發(fā)酵生產異戊二烯。本發(fā)明所提供的方法比實驗室是現(xiàn)有的利用大腸桿菌外源MVA途徑產異戊二烯的反應過程更短（Jianming Yang等，2012），由乙酰輔酶A僅需5步反應就可合成異戊二烯，避免了由于過多外源基因的表達而導致的對細胞自身代謝的影響。同時，經過發(fā)酵條件優(yōu)化，發(fā)酵產物異戊二烯的產量達到39.49g/L。與已有文獻的1091mg/

2、L還有很大差距。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于提供了一種生物合成異戊二烯的新方法，大大縮短了工程大腸桿菌利用外源途徑合成異戊二烯的反應過程。 權 利 要 求 書1. 一種產異戊二烯的基因工程菌，其特征在于，是在微生物中共表達乙酰輔酶A酰基轉移酶、3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶和油酸水合酶的基因得到的重組菌。2. 根據(jù)權利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述微生物是大腸桿菌E.coli BL21(DE3)；所述表達乙酰輔酶A?；D移酶和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的基因是乙酰輔酶A?；D移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE，GenBank登錄序列號為

3、AAG02438；所述表達3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶的基因是3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS，GenBank登錄序列號為AAG02439；所述表達末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶的基因是末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT，GenBank登錄序列號為ADW41779.1；所述表達油酸水合酶的基因是油酸水合酶基因OhydEM，GenBank登錄序列號為ACT54545.1。3. 一種利用權利要求1所述基因工程菌生物合成異戊二烯的方法，其特征在于，通過化學合成或克隆獲得含有乙酰輔酶A酰基轉移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE、3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS、末端烯烴形成脂肪

4、酸脫羧酶基因OleT和油酸水合酶基因OhydEM，構建含有上述基因的重組菌，再利用重組菌發(fā)酵生產異戊二烯。4. 根據(jù)權利要求3所述方法，其特征在于，步驟如下：1） 分別克隆或化學合成乙酰輔酶A?；D移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因，3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因, 末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因和油酸水合酶；2） 將步驟1）所得的基因連接到表達載體上，獲得重組質粒；3） 將步驟2）所得的重組質粒轉化到宿主菌，獲得重組菌；4） 利用步驟3）所得重組菌，發(fā)酵生產異戊二烯。5. 根據(jù)權利要求4所述方法，其特征在于，步驟1）中所述乙酰輔酶A酰基轉移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE，GenB

5、ank登錄序列號為AAG02438。6. 根據(jù)權利要求4所述方法，其特征在于，步驟1）中所述3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS，GenBank登陸序列號為AAG02439。7. 根據(jù)權利要求4所述方法，其特征在于，步驟1）中所述末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT，登錄序列號為ADW41779.1。8. 根據(jù)權利要求4所述方法，其特征在于，步驟1）中所述油酸水合酶基因OhydEM，登陸序列號為ACT54545.1。9. 根據(jù)權利要求4所述方法，其特征在于，具體步驟如下：1） 分別化學合成乙酰輔酶A?；D移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE，3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mva

6、S，末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT和油酸水合酶OhydEM，并分別與載體pGH連接；2） 將步驟1）所得的含有基因mvaE和基因mvaS的pGH載體與pACYDuet-1載體重組后獲得重組質粒pACY-mvaE-mvaS；將步驟1）所得的含有基因OleT和基因OhydEM的pGH載體與pCOLADuet-1載體重組后獲得重組質粒pCOLA-OleT-OhydEM；3） 將步驟2）中所得的重組質粒pACY-mvaE-mvaS和pCOLA-OleT-OhydEM轉化入大腸桿菌E. coli BL21(DE3)中，獲得重組菌；4） 利用步驟3）所得重組菌發(fā)酵生產異戊二烯。說 明 書一種產異戊二

7、烯基因工程菌及其應用技術領域本發(fā)明涉及一種產異戊二烯基因工程菌及其應用，屬于基因工程技術領域。技術背景異戊二烯是一種重要的化工平臺化合物，其95%用于合成橡膠；也是丁基橡膠的第二單體。此外，異戊二烯還廣泛應用于農藥、醫(yī)藥、香料及粘結劑等領域。目前，異戊二烯的來源主要是通過石油基原料異戊烷、異戊烯脫氫法、化學合成法( 包括異丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、 丙烯二聚法)和裂解C5餾分萃取蒸餾法。然而，隨著化石資源的日益枯竭，原料來源是利用石油基原料制備異戊二烯的重要瓶頸問題。生物體中主要存在兩種天然的代謝途徑進行異戊二烯的生物合成，即甲羥戊酸（MVA）途徑和甲基赤蘚糖-4-磷酸（MEP）途徑。MVA

8、 途徑主要存在于真核生物、古細菌和高等植物的細胞液中，而MEP途徑存在于植物的質體，細菌，藻類。這兩類代謝途徑的最終產物都是形成異戊二烯的前體物質二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），之后經過異戊二烯合成酶催化DMAPP至異戊二烯。利用MVA途徑和MEP途徑生產異戊二烯的反應分別涉及8和9步反應，反應涉及過多的基因。隨著分子生物學技術的發(fā)展，研究者開始探討生物法合成異戊二烯可行性。例如Pia Lindberg等利用藍藻的MEP途徑進行異戊二烯的生產，取得了50 微克/克干細胞/天的產率（Pia Lindberg等，2009），但藻類生長緩慢、生物

9、量低下是利用藻類制備異戊二烯的瓶頸問題。Genencor和Goodyear公司則是將外源的MVA途徑重組入大腸桿菌細胞中，進而利用工程菌發(fā)酵生產異戊二烯（美國專利公開，2009/0203102）。該工程菌中獲得外源MVA途徑時需要轉入多達8個異源基因，由于過多的異源基因表達可能會導致細胞自身代謝的紊亂，影響細胞的正常生長代謝。發(fā)明內容為避免代謝途徑過長可能導致的細胞自身代謝紊亂的問題，本發(fā)明提出利用可再生資源葡萄糖為原料，通過縮短MVA途徑的反應步驟，完成生物催化劑的制備，構建了具有簡短的異戊二烯代謝途徑的基因工程菌。本發(fā)明所采取的技術方案如下：一種產異戊二烯的基因工程菌，是在微生物中共表達乙

10、酰輔酶A?；D移酶、3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶和油酸水合酶的基因得到的重組菌。所述基因工程菌的宿主菌是大腸桿菌E.coli BL21(DE3)；所述表達乙酰輔酶A酰基轉移酶和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的基因是乙酰輔酶A?；D移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE，GenBank登錄序列號為AAG02438；所述表達3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶的基因是3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS，GenBank登錄序列號為AAG02439；所述表達末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶的基因是末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT，GenBank登錄序列

11、號為ADW41779.1；所述表達油酸水合酶的基因是油酸水合酶基因OhydEM，GenBank登錄序列號為ACT54545.1。一種利用所述基因工程菌生物合成異戊二烯的方法，是通過化學合成或克隆獲得含有乙酰輔酶A?；D移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE、3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS、末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT和油酸水合酶基因OhydEM，構建含有上述基因的重組菌，再利用重組菌發(fā)酵生產異戊二烯。所述方法的步驟如下：1) 分別克隆或化學合成乙酰輔酶A酰基轉移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因，3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因，末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因和油酸水合酶

12、；2) 將步驟1）所得的基因連接到表達載體上，獲得重組質粒；3) 將步驟2）所得的重組質粒轉化到宿主菌，獲得重組菌；4) 利用步驟3）所得重組菌，發(fā)酵生產異戊二烯。所述方法步驟1）中所述乙酰輔酶A?；D移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE，GenBank登錄序列號為AAG02438。所述方法步驟1）中所述3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS，GenBank登錄序列號為AAG02439。所述方法步驟1）中所述末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT，GenBank登錄序列號為ADW41779.1。所述方法步驟1）中所述油酸水合酶基因OhydEM，GenBank登錄序列號為ACT54545

13、.1。所述方法的具體步驟如下：1） 分別化學合成乙酰輔酶A?；D移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE，3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS，末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT和油酸水合酶OhydEM，并分別與載體pGH連接；2） 將步驟1）所得的含有基因mvaE和基因mvaS的pGH載體與pACYDuet-1載體重組后獲得重組質粒pACY-mvaE-mvaS；將步驟1）所得的含有基因OleT和基因OhydEM的pGH載體與pCOLADuet-1載體重組后獲得重組質粒pCOLA-OleT-OhydEM；3） 將步驟2）中所得的重組質粒pACY-mvaE-mvaS和pCOLA-Ole

14、T-OhydEM轉化入大腸桿菌E. coli BL21(DE3)中，獲得重組菌；4） 利用步驟3）所得重組菌發(fā)酵生產異戊二烯。本領域技術人員應該理解，為在重組細胞中更好地表達，上述各種酶的基因序列或由其衍生的編碼具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以根據(jù)所用的宿主細胞的密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化。本領域技術人員還應該理解，上述各種酶的基因序列或由其衍生的編碼具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以按照常規(guī)分子克隆技術克隆到宿主細胞中。另外，這些核苷酸片段還可以與適當?shù)谋磉_控制元件（例如，啟動子，增強子等）可操作地連接。這些都在本領域技術人員的能力范圍之內，不需要付出創(chuàng)造性的勞動。這些核苷酸片

15、段可操作性連接可以借助于接頭也可以不用接頭，這可以由本領域技術人員根據(jù)實際需要進行適當?shù)倪x擇。本領域技術人員還應該理解，在選擇適當?shù)乃拗骷毎麡嫿ê媚軌驈囊阴］o酶A合成-或-蒎烯的重組細胞后，本領域技術人員能夠根據(jù)技術常識或經過有限次實驗確定合適的培養(yǎng)條件（例如，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度、攪拌速度、pH值、溶氧率、發(fā)酵時間等參數(shù)），也能夠選擇合適的誘導劑，確定加入誘導劑的時機，等等。這不需要付出創(chuàng)造性的勞動。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所提供的方法大大縮短了大腸桿菌外源MVA途徑的反應過程，以乙酰輔酶A作為原料合成異戊二烯只需要5步反應，僅涉及5種酶，避免了由于過多外源基因的表達而導致的對細胞自身代謝的影響，

16、最終在大腸桿菌中構建生物基異戊二烯合成途徑。附圖說明圖1是利用乙酰輔酶A生物合成異戊二烯代謝途徑示意圖。圖2是pFHR-1質粒圖譜。圖3是pFHR-2 質粒圖譜。圖4是pFHR-3質粒圖譜。圖5是異戊二烯標準品與發(fā)酵產物異戊二烯的GC-MS分析圖譜。圖6顯示IPTG濃度對工程菌產異戊二烯的影響。圖7顯示誘導溫度對工程菌產異戊二烯的影響。具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。通過在大腸桿菌中共同表達來源于糞腸球菌（Enterococcus faecalis）的乙酰輔酶A?；D移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(mvaE，SEQ ID NO.1)，3-羥-3

17、-甲基戊二酰輔酶A合酶基因(mvaS，SEQ ID NO.2)；來源于Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456的末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因(OleT,SEQ ID NO.3)和來源于腦膜炎膿毒性黃桿菌（Elizabethkingia meningoseptica）的油酸水合酶基因（OhydEM, SEQ ID NO.4），利用葡萄糖降解中間產物乙酰輔酶A生物合成異戊二烯，縮短了異戊二烯的代謝途徑（圖1）。實施例1 外源基因的克隆和表達載體的構建1. 外源基因的克隆1.1 糞腸球菌MVA上游代謝途徑基因的克隆來自于糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）的mvaS基因

18、（GenBank No. AAG02439），mvaE基因（GenBank No. AAG02438）由上海捷瑞公司通過化學合成方法獲得。之后分別與載體pGH（購自上海捷瑞生物工程有限公司）連接獲得pGH/mvaS, pGH/mvaE。1.2 OleT, OhydEM基因的克隆分別對來自于Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456的OleT基因（GenBank No.ADW41779.1），Elizabethkingia meningoseptica的OhydEM基因（GenBank No.ACT54545.1）由上海捷瑞公司進行化學合成，并連入pGH載體上分別形成pGH/OleT

19、,pGH/OhydEM載體。2表達載體的構建2.1 pFHR-1 載體構建將pGH-OleT與pCOLADuet-1載體（Novagen）分別用BamH和Sac進行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1:5的比例，4連接過夜或16連接46 h，連接產物轉化E. coli DH5，然后涂布加有50mgmL-1卡那霉素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒pFHR-1(pCOLA-OleT，圖2)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。2.2 pFHR-2 載體構建將pCOLA-OleT(pFHR-1)與pGH-OhydEM載體分別用BglII和NdeI進行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1

20、:5的比例，4連接過夜或16連接46 h，連接產物轉化E. coli DH5，然后涂布加有50mgmL-1卡那霉素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒pFHR-2(pCOLA-OleT-OhydEM，圖3)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。2.3 pFHR-3 載體構建將pACY-mvaE-mvaS-ispSPa載體（pYJM20，實驗室保存）與pACYDuet-1載體分別用NcoI和PstI進行雙酶切，載體pACYDuet-1與外源片段mvaE-mvaS按摩爾比1:5的比例，4連接過夜或16連接46 h，連接產物轉化E. coli DH5，然后涂布加有34gmL-1氯霉

21、素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒pYJM3(pACY-mvaE-mvaS，圖4)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。實施例2 重組菌株的構建和發(fā)酵培養(yǎng)將構建好的質粒轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，通過搖瓶發(fā)酵對重組菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，利用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-MS）和氣相色譜（GC）分別對發(fā)酵產物進行定性和定量的檢測。2.1 E.coli重組菌株的構建將pFHR-2(pCOLA-OleT-OhydEM)和pFHR-3(pACY-mvaE-mvaS)重組質粒共同熱擊轉化E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布于加有氯霉素和卡那霉素的LB固體平板，通過PCR篩選獲

22、得陽性克隆，由此獲得含有pFHR-2和pFHR-3的工程大腸桿菌。2.2 工程大腸桿菌的培養(yǎng)將活化后的工程大腸桿菌按1:100的比例接種到含有氯霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)液中，37, 180rpm條件下振蕩培養(yǎng)，當OD600nm為0.6-0.8時，在菌液中加入誘導劑IPTG至終濃度0.5mmolL-1，然后轉入在30，180rpm條件下，繼續(xù)培養(yǎng)。當工程菌株誘導24h后，取頂空氣體1ml，利用GC-MS定性檢測。 GC-MS檢測條件：GC-MS儀器型號： Thermo GC Trace ITQ 1110；分離柱型號： HP-INNOWax 30m*0.25mm*0.25um；離子源：EI；進

23、樣量：0.2ml；檢測器：ICR；柱溫：40保溫5min，然后以20/min的速度升溫至75，保溫1min，然后再以20/min的速度升至245，保溫5min。GC-MS檢測結果如圖6所示，該結果表明：發(fā)酵產物與異戊二烯標準品氣相色譜出峰時間及質譜特征一致，從而確定發(fā)酵產物為異戊二烯。實施例3 不同發(fā)酵條件對重組菌產量的影響不同的發(fā)酵條件，如誘導溫度，轉速，誘導劑濃度，氮源，底物濃度，培養(yǎng)基pH值及成分配比等，會影響發(fā)酵產物異戊二烯的產量。本發(fā)明檢測了不同的誘導溫度，誘導劑濃度對異戊二烯產量的影響。培養(yǎng)方法同實施例2，利用GC對發(fā)酵產物進行定量。GC檢測條件：GC系統(tǒng)采用山東魯南瑞虹SP-68

24、90型氣相色譜儀，色譜柱為HP-INNOWAX column(25 m250 m0.2 m)，檢測器為FID檢測器；氣化室溫度200 ，檢測器溫度230 ，載氣流速：1ml/min。柱溫: 50恒溫。3.1 E.coli重組菌株的構建將pFHR-2(pCOLA-OleT-OhydEM)和pFHR-3(pACY-mvaE-mvaS)重組質粒共同熱擊轉化E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布于加有氯霉素和卡那霉素抗生素的LB固體平板，通過PCR篩選獲得陽性克隆，由此獲得含有pFHR-2和pFHR-3的工程大腸桿菌。3.2研究不同IPTG濃度對異戊二烯產量的影響挑取單克隆于5ml LB小

25、瓶中培養(yǎng)活化過夜，按1%接種于100ml 含有Cm+Kan抗生素的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)4h，當OD600nm=0.6-0.8左右，加入不同濃度 IPTG（0.125mM，0.25mM，0.5mM，0.75mM, 1mM, 1.125mM,1.25mM）在30條件下進行誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后取1ml頂空氣體進行GC測定。檢測結果如圖7所示，結果表明：IPTG濃度為1mM時，異戊二烯產量最高，為35.43g/L。3.3研究不同誘導溫度對異戊二烯產量的影響挑取單克隆于5ml LB小瓶中培養(yǎng)活化過夜，按1%接種于100ml 含有Cm+Kan抗生素的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37, 180rpm條件下

26、振蕩培養(yǎng)，當OD600nm為0.6-0.8時，在菌液中加入誘導劑IPTG至終濃度1mmolL-1，然后轉入不同溫度下（25，28，30，34，37）進行誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后取1ml頂空氣體進行GC測定。檢測結果如圖8所示，結果表明：誘導溫度為37時，異戊二烯產量最高，為39.49g/L。應該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經對本發(fā)明進行具體地顯示和描述，但是本領域的普通技術人員應該理解，在不背離由權利要求書所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進行各種形式和細節(jié)的變化，可以進行各種實施方案的任意組合。說 明 書 附 圖圖1圖2圖3圖4標準品發(fā)酵產物標準品發(fā)酵產物圖5圖6圖7核苷酸

27、和/或氨基酸序列表序列表 中國科學院青島生物能源與過程研究所 一種產異戊二烯基因工程菌及其應用 1 4 PatentIn version 3.5 1 2412 DNA SEQ ID NO.1 Enterococcus faecalis mvaE mRNA 1atgaaaacag tagttattat tgatgcatta cgaacaccaa ttggaaaata taaaggcagc 60ttaagtcaag taagtgccgt agacttagga acacatgtta caacacaact tttaaaaaga 120cattccacta tttctgaaga aattgatcaa g

28、taatctttg gaaatgtttt acaagctgga 180aatggccaaa atcccgcacg acaaatagca ataaacagcg gtttatctca tgaaattccc 240gcaatgacag ttaatgaggt ctgcggatca ggaatgaagg ccgttatttt ggcgaaacaa 300ttgattcaat taggagaagc ggaagtttta attgctggcg ggattgagaa tatgtcccaa 360gcacctaaat tacaacgatt taattacgaa acagaaagct atgatgcgcc ttt

29、ttctagt 420atgatgtacg atgggttaac ggatgccttt agtggtcaag caatgggctt aactgctgaa 480aatgtggccg aaaagtatca tgtaactaga gaagagcaag atcaattttc tgtacattca 540caattaaaag cagctcaagc acaagcagaa gggatattcg ctgacgaaat agccccatta 600gaagtatcag gaacgcttgt ggagaaagat gaagggattc gccctaattc gagcgttgag 660aagctaggaa cg

30、cttaaaac agtttttaaa gaagacggta ctgtaacagc agggaatgca 720tcaaccatta atgatggggc ttctgctttg attattgctt cacaagaata tgccgaagca 780cacggtcttc cttatttagc tattattcga gacagtgtgg aagtcggtat tgatccagcc 840tatatgggaa tttcgccgat taaagccatt caaaaactgt tagcgcgcaa tcaacttact 900acggaagaaa ttgatctgta tgaaatcaac gaag

31、catttg cagcaacttc aatcgtggtc 960caaagagaac tggctttacc agaggaaaag gtcaacattt atggtggcgg tatttcatta 1020ggtcatgcga ttggtgccac aggtgctcgt ttattaacga gtttaagtta tcaattaaat 1080caaaaagaaa agaaatatgg agtggcttct ttatgtatcg gcggtggctt aggactcgct 1140atgctactag agagacctca gcaaaaaaaa aacagccgat tttatcaaat gag

32、tcctgag 1200gaacgcctgg cttctcttct taatgaaggc cagatttctg ctgatacaaa aaaagaattt 1260gaaaatacgg ctttatcttc gcagattgcc aatcatatga ttgaaaatca aatcagtgaa 1320acagaagtgc cgatgggcgt tggcttacat ttaacagtgg acgaaactga ttatttggta 1380ccaatggcga cagaagagcc ctcagtgatt gcggctttga gtaatggtgc aaaaatagca 1440caaggatt

33、ta aaacagtgaa tcaacaacgt ttaatgcgtg gacaaatcgt tttttacgat 1500gttgcagacg ccgagtcatt gattgatgaa ctacaagtaa gagaaacgga aatttttcaa 1560caagcagagt taagttatcc atctatcgtt aaacgcggcg gcggcttaag agatttgcaa 1620tatcgtgctt ttgatgaatc atttgtatct gtcgactttt tagtagatgt taaggatgca 1680atgggggcaa atatcgttaa cgctat

34、gttg gaaggtgtgg ccgagttgtt ccgtgaatgg 1740tttgcggagc aaaagatttt attcagtatt ttaagtaatt atgccacgga gtcggttgtt 1800acgatgaaaa cggctattcc agtttcacgt ttaagtaagg ggagcaatgg ccgggaaatt 1860gctgaaaaaa ttgttttagc ttcacgctat gcttcattag atccttatcg ggcagtcacg 1920cataacaaag ggatcatgaa tggcattgaa gctgtcgttt tagc

35、tacagg aaatgataca 1980cgcgctgtta gcgcttcttg tcatgctttt gcggtgaagg aaggtcgcta ccaaggtttg 2040actagttgga cgctggatgg cgaacaacta attggtgaaa tttcagttcc gcttgcgtta 2100gccacggttg gcggtgccac aaaagtctta cctaaatctc aagcagctgc tgatttgtta 2160gcagtgacgg atgcaaaaga actaagtcga gtagtagcgg ctgttggttt ggcacaaaat 22

36、20ttagcggcgt tacgggcctt agtctctgaa ggaattcaaa aaggacacat ggctctacaa 2280gcacgttctt tagcgatgac ggtcggagct actggtaaag aagttgaggc agtcgctcaa 2340caattaaaac gtcaaaaaac gatgaaccaa gaccgagcct tggctatttt aaatgattta 2400agaaaacaat aa 2412 2 1152 DNA SEQ ID NO.2 Enterococcus faecalis mvaS mRNA 2atgacaattg gg

37、attgataa aattagtttt tttgtgcccc cttattatat tgatatgacg 60gcactggctg aagccagaaa tgtagaccct ggaaaatttc atattggtat tgggcaagac 120caaatggcgg tgaacccaat cagccaagat attgtgacat ttgcagccaa tgccgcagaa 180gcgatcttga ccaaagaaga taaagaggcc attgatatgg tgattgtcgg gactgagtcc 240agtatcgatg agtcaaaagc ggccgcagtt gtctt

38、acatc gtttaatggg gattcaacct 300ttcgctcgct ctttcgaaat caaggaagct tgttacggag caacagcagg cttacagtta 360gctaagaatc acgtagcctt acatccagat aaaaaagtct tggttgtagc agcagatatt 420gcaaaatatg gattaaattc tggcggtgag cctacacaag gagctggggc ggttgcaatg 480ttagttgcta gtgaaccgcg catcttggct ttaaaagagg ataatgtgat gctgacg

39、caa 540gatatctatg acttttggcg tccaacaggc catccgtatc ctatggtcga tggtcctttg 600tcaaacgaaa cctacatcca atcttttgcc caagtctggg atgaacataa aaaaagaacc 660ggtcttgatt ttgcagatta tgatgcttta gcgttccata ttccttacac aaaaatgggc 720aaaaaagcct tattagcaaa aatctccgac caaactgaag cagaacagga acgaatttta 780gcccgttatg aagaaa

40、gcat catctatagt cgtcgcgtag gaaacttgta tacgggttca 840ctttatctgg gactcatttc ccttttagaa aatgcaacga ctttaaccgc aggcaatcaa 900attgggttat tcagttatgg ttctggtgct gtcgctgaat ttttcactgg tgaattagta 960gctggttatc aaaatcattt acaaaaagaa actcatttag cactgctaga taatcggaca 1020gaactttcta tcgctgaata tgaagccatg tttgcag

41、aaa ctttagacac agatattgat 1080caaacgttag aagatgaatt aaaatatagt atttctgcta ttaataatac cgttcgctct 1140tatcgaaact aa 1152 3 1269 DNA SEQ ID NO.3 Jeotgalicoccus sp. ATCC 8456 OleT mRNA 3atggcaacac ttaagaggga taagggctta gataatactt tgaaagtatt aaagcaaggt 60tatctttaca caacaaatca gagaaatcgt ctaaacacat cagttt

42、tcca aactaaagca 120ctcggtggta aaccattcgt agttgtgact ggtaaggaag gcgctgaaat gttctacaac 180aatgatgttg ttcaacgtga aggcatgtta ccaaaacgta tcgttaatac gctttttggt 240aaaggtgcaa tccatacggt agatggtaaa aaacacgtag acagaaaagc attgttcatg 300agcttgatga ctgaaggtaa cttgaattat gtacgagaat taacgcgtac attatggcat 360gcgaa

43、cacac aacgtatgga aagtatggat gaggtaaata tttaccgtga atctatcgta 420ctacttacaa aagtaggaac acgttgggca ggcgttcaag caccacctga agatatcgaa 480agaatcgcaa cagacatgga catcatgatc gattcattta gagcacttgg tggtgccttt 540aaaggttaca aggcatcaaa agaagcacgt cgtcgtgttg aagattggtt agaagaacaa 600attattgaga ctcgtaaagg gaatatt

44、cat ccaccagaag gtacagcact ttacgaattt 660gcacattggg aagactactt aggtaaccca atggactcaa gaacttgtgc gattgactta 720atgaacacat tccgcccatt aatcgcaatc aacagattcg tttcattcgg tttacacgcg 780atgaacgaaa acccaatcac acgtgaaaaa attaaatcag aacctgacta tgcatataaa 840ttcgctcaag aagttcgtcg ttactatcca ttcgttccat tccttccag

45、g taaagcgaaa 900gtagacatcg acttccaagg cgttacaatt cctgcaggtg taggtcttgc attagatgtt 960tatggtacaa cgcatgatga atcactttgg gacgatccaa atgaattccg cccagaaaga 1020ttcgaaactt gggacggatc accatttgac cttattccac aaggtggtgg agattactgg 1080acaaatcacc gttgtgcagg tgaatggatc acagtaatca tcatggaaga aacaatgaaa 1140tactt

46、tgcag aaaaaataac ttatgatgtt ccagaacaag atttagaagt ggacttaaac 1200agtatcccag gatacgttaa gagtggcttt gtaatcaaaa atgttcgcga agttgtagac 1260agaacataa 1269 4 1941 DNA SEQ ID NO.4 Elizabethkingia meningoseptica OhydEM mRNA 4atgaacccaa taacttcaaa atttgacaaa gtacttaatg cttcttccga atacggacat 60gtaaaccatg aacc

47、ggattc cagtaaagaa cagcaacgaa acaccccgca aaaatcaatg 120cccttttctg atcagattgg aaattatcag agaaacaaag ggattcctgt acaatcatat 180gacaatagta agatttacat tataggcagt ggaatcgcag gtatgtcggc agcttattat 240tttatacgcg atgggcatgt tcctgcaaaa aacatcacct tcttggaaca attgcatatc 300gatggcggtt cattagatgg tgccggaaat ccgacagacg gctatattat ccgtggcggt 360cgtgaaatgg acatgacgta cgaaaatctt tgggatatgt ttcaggatat acctgcctta 420gaaatgcctg ctccttacag tgtactggac gaatacagat taattaatga taacgactcc 480aattattcta aagcccggtt aatcaacaat aaaggtgaga taaaagactt tagcaagttc 540ggcctaaata aaatggacca gttagctatt at