雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體

1、雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體單克隆抗體（單克隆抗體（mcabmcab）：）：是由只識(shí)別單一抗原決定簇的是由只識(shí)別單一抗原決定簇的b b細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。 理化性狀高度均一理化性狀高度均一效價(jià)高效價(jià)高只與一種抗原表位發(fā)生反應(yīng)、生物活性單一只與一種抗原表位發(fā)生反應(yīng)、生物活性單一具有高度特異性又易于大量制備具有高度特異性又易于大量制備如何獲得如何獲得mcab?mcab?如何大量獲得如何大量獲得mcab?mcab?需要克服哪些技術(shù)問(wèn)題？需要克服哪些技術(shù)問(wèn)題？理想的抗體分泌細(xì)胞：理想的抗體分泌細(xì)胞： 具有合成和分泌抗體的能力具有合成和分泌抗體的能力 具有

2、大量無(wú)限生長(zhǎng)的特性具有大量無(wú)限生長(zhǎng)的特性 在在1975年，年，kohler 和和milstein將來(lái)源于小鼠骨髓的將來(lái)源于小鼠骨髓的骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞和嚙齒動(dòng)物可以和嚙齒動(dòng)物可以分泌抗體的細(xì)胞分泌抗體的細(xì)胞融合后形成雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤融合后形成雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞無(wú)限繁殖的能力，也具有免疫細(xì)胞分泌抗體的能細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞無(wú)限繁殖的能力，也具有免疫細(xì)胞分泌抗體的能力，后來(lái)將這種雜交細(xì)胞系統(tǒng)統(tǒng)稱為力，后來(lái)將這種雜交細(xì)胞系統(tǒng)統(tǒng)稱為雜交瘤雜交瘤（hybridoma）。）。 通過(guò)篩選，分離得到針對(duì)通過(guò)篩選，分離得到針對(duì)特異性抗原特異性抗原并具有所要求的抗體親和并具有所要求的抗體親和力

3、的力的雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞。在適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)條件下，雜交瘤細(xì)胞能夠。在適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)條件下，雜交瘤細(xì)胞能夠生長(zhǎng)和無(wú)限生長(zhǎng)和無(wú)限制性傳代制性傳代，并且能產(chǎn)生，并且能產(chǎn)生大量單一類(lèi)型的抗體大量單一類(lèi)型的抗體及單克隆抗體。及單克隆抗體。一、雜交瘤技術(shù)的基本原理一、雜交瘤技術(shù)的基本原理二、單克隆抗體的制備二、單克隆抗體的制備三、單克隆抗體的應(yīng)用三、單克隆抗體的應(yīng)用 利用利用聚乙二醇聚乙二醇作為細(xì)胞融合劑，使免疫的作為細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)小鼠脾細(xì) 胞胞與具與具有在體外不斷繁殖能力的有在體外不斷繁殖能力的小鼠骨髓瘤細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞融為一融為一 體，在體，在hathat選擇選擇性培養(yǎng)基性培養(yǎng)基的作用下，只讓融

4、合成功的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)反的作用下，只讓融合成功的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)反復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選和單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)（克隆化）復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選和單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)（克隆化）, ,最終獲得既能最終獲得既能產(chǎn)生所需單克隆抗體產(chǎn)生所需單克隆抗體, ,又能不斷繁殖的又能不斷繁殖的雜交瘤雜交瘤 細(xì)胞系細(xì)胞系，將這種細(xì)，將這種細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，在其產(chǎn)生的腹水中即可得到高胞擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，在其產(chǎn)生的腹水中即可得到高效價(jià)的效價(jià)的單克隆抗體單克隆抗體。 流流程程雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù)1.顆粒性抗原顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果 2.可溶性抗

5、原可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，免疫原性弱，一般要加佐劑，可溶性抗原可溶性抗原10-50ug/100ul+等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔，等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔， 2-4周后加強(qiáng)免疫（量減半，改用不完全佐劑，可反復(fù)多次）周后加強(qiáng)免疫（量減半，改用不完全佐劑，可反復(fù)多次）沖擊免疫（融合前沖擊免疫（融合前3天進(jìn)行）天進(jìn)行）選用選用6-12周齡周齡balb/c小鼠小鼠免疫方案免疫方案不產(chǎn)生不產(chǎn)生igig的重鏈和輕鏈的重鏈和輕鏈hgprt-與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同小鼠骨髓瘤細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞處于免疫狀態(tài)脾臟中處于免疫狀態(tài)脾臟中的的b b淋巴母細(xì)胞或漿母淋巴母細(xì)

6、胞或漿母細(xì)胞細(xì)胞動(dòng)動(dòng) 物：物：6 61212周齡周齡20g20g25g25g體重體重免疫脾細(xì)胞免疫脾細(xì)胞細(xì)胞融合劑：細(xì)胞融合劑：peg:分子量分子量4000 的的peg是最常用的細(xì)胞融合劑是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開(kāi)而有助于細(xì)胞融合膜易打開(kāi)而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：作用特點(diǎn)：不同的分子質(zhì)量、濃度、作用時(shí)間、不同的分子質(zhì)量、濃度、作用時(shí)間、ph,可可能直接影響融合效果能直接影響融合效果細(xì)胞融合細(xì)胞融合培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期渾圓、透亮、均一、排列整齊渾圓、透亮、均一、排列整齊避

7、免細(xì)胞返祖：定期用避免細(xì)胞返祖：定期用8-ag8-ag處理細(xì)胞處理細(xì)胞1-21-210107 7免疫脾細(xì)胞的制備：免疫脾細(xì)胞的制備：1-21-210108 8 無(wú)菌手術(shù)無(wú)菌手術(shù)飼養(yǎng)細(xì)胞：飼養(yǎng)細(xì)胞：常用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，常用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，5-85-810106 6分泌細(xì)胞生長(zhǎng)因子分泌細(xì)胞生長(zhǎng)因子吞噬衰老細(xì)胞和微生物吞噬衰老細(xì)胞和微生物存活一般不超存活一般不超2 2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞dna合成途經(jīng)：合成途經(jīng)：1. 1.替代途徑：次黃嘌呤（替代途徑：次黃嘌呤（h h） hgprt hgprt2. 2.主要途徑：

8、主要途徑：氨基酸氨基酸 鳥(niǎo)嘌呤核苷酸鳥(niǎo)嘌呤核苷酸谷氨酰胺谷氨酰胺 （a-a-）尿核苷單磷酸尿核苷單磷酸 胸腺嘧啶核苷酸胸腺嘧啶核苷酸 tk tk3. 3.次要途徑：胸腺嘧啶核苷（次要途徑：胸腺嘧啶核苷（t t）hathat培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：h（hypoxanthine）:次黃嘌呤次黃嘌呤a（aminopterin）：）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷dna合成主要合成主要途徑途徑 t(thymidine)：胸胸腺嘧啶核苷；腺嘧啶核苷；“核苷酸前體核苷酸前體”，供細(xì)胞通過(guò)替，供細(xì)胞通過(guò)替代途徑合成代途徑合成dnadnahat選擇培養(yǎng)基的原理選擇培養(yǎng)基的原理hathat選擇作用

9、：選擇作用：淋巴細(xì)胞：淋巴細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，不能生長(zhǎng)，5 57 7天死亡；天死亡；dnadna合成的主要途合成的主要途徑被徑被a a阻斷阻斷骨髓瘤細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，不能生長(zhǎng)，5 57 7天死亡；天死亡；hgprthgprt缺乏，缺乏，dnadna合成的替代途徑受阻合成的替代途徑受阻克隆化：克隆化：指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無(wú)關(guān)抗體細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開(kāi)。分泌細(xì)胞分開(kāi)。克隆化的原則：克隆化的原則：盡早進(jìn)行，反復(fù)盡早進(jìn)行，反復(fù)4-5次次陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的

10、克隆化陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化有限稀釋法有限稀釋法(limiting dilution) 軟瓊脂平板法軟瓊脂平板法(soft agar method)單細(xì)胞顯微操作法單細(xì)胞顯微操作法(micromanipulation)熒光激活細(xì)胞分類(lèi)法法（熒光激活細(xì)胞分類(lèi)法法（fluorescence activated cell sorter， facs ）克隆化方案：克隆化方案：特點(diǎn)：特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法實(shí)驗(yàn)室常用方法方法：方法：細(xì)胞懸液通過(guò)系列稀釋細(xì)胞懸液通過(guò)系列稀釋每個(gè)培養(yǎng)孔含每個(gè)培養(yǎng)孔含0.50.51 1個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞有限稀釋法有限稀釋法在沒(méi)

11、有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中在沒(méi)有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞污染，分泌抗體能力喪失等隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞污染，分泌抗體能力喪失等“慢凍慢凍”：分步冷凍，分步冷凍，30-7030-70液氮液氮 “快融快融”：取出立即浸入取出立即浸入37374040水浴中，使其迅速融化、水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇防止污染防止污染避免染色體丟失避免染色體丟失防止非分泌細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)防止非分泌細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)防止細(xì)胞密度過(guò)高而死亡防止細(xì)胞密度過(guò)高而死亡細(xì)胞冷凍的意義細(xì)胞冷凍的意義1.1.抗體分泌穩(wěn)定性抗體分泌穩(wěn)定性抗體連

12、續(xù)傳代法抗體連續(xù)傳代法-保持穩(wěn)定分泌特異性抗體保持穩(wěn)定分泌特異性抗體2.2.細(xì)胞核學(xué)特征細(xì)胞核學(xué)特征檢查細(xì)胞分裂中期染色體檢查細(xì)胞分裂中期染色體-保證不丟失產(chǎn)生抗體基因的染色體保證不丟失產(chǎn)生抗體基因的染色體3.3.鼠源病毒檢查鼠源病毒檢查細(xì)胞試驗(yàn)，動(dòng)物抗體產(chǎn)生試驗(yàn)，雞胚感染試驗(yàn)等細(xì)胞試驗(yàn)，動(dòng)物抗體產(chǎn)生試驗(yàn)，雞胚感染試驗(yàn)等-排除單抗制品的排除單抗制品的病毒污染病毒污染4.4.支原體檢查支原體檢查熒光染色法，培養(yǎng)法，分子生物學(xué)法等熒光染色法，培養(yǎng)法，分子生物學(xué)法等防止污染防止污染5.5.無(wú)菌試驗(yàn)無(wú)菌試驗(yàn)直接接種法，薄膜過(guò)濾法直接接種法，薄膜過(guò)濾法 二二 單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備 經(jīng)過(guò)反復(fù)克

13、隆化獲得的經(jīng)過(guò)反復(fù)克隆化獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染染色體逐漸丟失色體逐漸丟失而使細(xì)胞而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。體。 動(dòng)物體內(nèi)誘生方法：動(dòng)物體內(nèi)誘生方法： 操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)主要用于生產(chǎn)科研或診斷用單抗主要用于生產(chǎn)科研或診斷用單抗腹水濃度可達(dá)腹水濃度可達(dá)2-5mg/ml2-5mg/ml實(shí)體瘤法、腹水制備法實(shí)體瘤法、

14、腹水制備法體外培養(yǎng)法：體外培養(yǎng)法：使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞工藝簡(jiǎn)單、易控制，可大規(guī)模生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、易控制，可大規(guī)模生產(chǎn)濃度不高，濃度不高，200-500ug/ml200-500ug/ml懸浮培養(yǎng)法、固相培養(yǎng)法懸浮培養(yǎng)法、固相培養(yǎng)法單克隆抗體的產(chǎn)生單克隆抗體的產(chǎn)生腹水制備法腹水制備法預(yù)先腹腔注射降直烷或液狀石蠟預(yù)先腹腔注射降直烷或液狀石蠟1-21-2周后注射（周后注射（1 15 5）10106 6細(xì)胞細(xì)胞1 13 3w w形成腹水形成腹水5-20mg/ml,1-10ml5-20mg/ml,1-10ml高滴度腹水高滴度腹水抗體特異性鑒定：抗體特異性鑒定： 抗

15、原類(lèi)似物的交叉反應(yīng)抗原類(lèi)似物的交叉反應(yīng)igig類(lèi)型、亞類(lèi)鑒定：類(lèi)型、亞類(lèi)鑒定： 雙擴(kuò)法或雙擴(kuò)法或elisaelisa法法mcabmcab中和活性鑒定：中和活性鑒定： 動(dòng)物或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)mcabmcab識(shí)別抗原表位測(cè)定：識(shí)別抗原表位測(cè)定： 用競(jìng)用競(jìng) 爭(zhēng)結(jié)合法，測(cè)相加指數(shù)法爭(zhēng)結(jié)合法，測(cè)相加指數(shù)法mcabmcab親和力測(cè)定：親和力測(cè)定： elisa elisa 單克隆抗體性質(zhì)鑒定單克隆抗體性質(zhì)鑒定1.1.污染污染細(xì)菌，真菌，支原體細(xì)菌，真菌，支原體2.2.雜交瘤細(xì)胞不分泌或停止分泌抗體雜交瘤細(xì)胞不分泌或停止分泌抗體hathat中中a a失效；失效；免疫原的抗原性弱，免疫效果差；

16、免疫原的抗原性弱，免疫效果差；支原體污染；支原體污染；抗體非分泌細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)；抗體非分泌細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)；染色體丟失染色體丟失1.1.大量保持和補(bǔ)充液氮凍存的細(xì)胞原管；大量保持和補(bǔ)充液氮凍存的細(xì)胞原管；2.2.倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞生長(zhǎng)狀況；倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞生長(zhǎng)狀況；3.3.不讓細(xì)胞不讓細(xì)胞“過(guò)度生長(zhǎng)過(guò)度生長(zhǎng)”4.4.不讓培養(yǎng)物不加檢查任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾月；不讓培養(yǎng)物不加檢查任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾月；硫酸銨沉淀硫酸銨沉淀凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾法離子交換層析離子交換層析親和層析親和層析 大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化

17、力，可奪取蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出可奪取蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出 血清血清 50% 50%飽和度硫酸胺飽和度硫酸胺 上清上清 （清蛋白）（清蛋白） 沉淀（球蛋白）沉淀（球蛋白） 33% 33%飽和度硫酸胺飽和度硫酸胺 上清上清 沉淀沉淀 擬球蛋白擬球蛋白 r r球蛋白球蛋白干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠粒，將蛋白質(zhì)溶液加在凝膠干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠粒，將蛋白質(zhì)溶液加在凝膠柱上進(jìn)行洗脫時(shí)，大分子蛋白不能穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，留柱上進(jìn)行洗脫時(shí)，大分子蛋白不能穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最先流出，小分子蛋白可

18、穿過(guò)凝在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最先流出，小分子蛋白可穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，受到凝膠的阻留，向下移動(dòng)較慢洗脫出來(lái)較膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，受到凝膠的阻留，向下移動(dòng)較慢洗脫出來(lái)較慢，據(jù)此將不同大小的蛋白質(zhì)分離出來(lái)。慢，據(jù)此將不同大小的蛋白質(zhì)分離出來(lái)。交聯(lián)葡聚糖凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠( (sephadex)sephadex)瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠( (sepharose)sepharose)deaedeae纖維素：結(jié)合溶液中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，又稱陰離子交換劑纖維素：結(jié)合溶液中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，又稱陰離子交換劑cmcm纖維素：結(jié)合溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)，又稱陽(yáng)離子交換劑纖維素：結(jié)合溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)，又稱陽(yáng)離子交換劑親和層析法親和層析法將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體（或抗原），形成