核酸的制備與提取

1、核酸的分離與鑒定核酸的分離與鑒定第一部份、核酸的基本知識；第二部份、常用核酸制備方法；學(xué)習(xí)內(nèi)容學(xué)習(xí)內(nèi)容第一部份、核酸的基本知識第一部份、核酸的基本知識第一節(jié)第一節(jié) 核酸核酸的研究歷史；的研究歷史； 第二節(jié)第二節(jié) 核酸的化學(xué)組成；核酸的化學(xué)組成；第三節(jié)第三節(jié) 核酸的結(jié)構(gòu)特點；核酸的結(jié)構(gòu)特點；l1868年瑞士科學(xué)家米歇爾(f.miescher)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)含高量磷的酸性物質(zhì)，命名為核素(后改名為核酸)l早期的研究僅將核酸看成是細(xì)胞中的一般化學(xué)成分，沒有人注意到它在生物體內(nèi)有什么功能； 第一節(jié)、核酸的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)、核酸的發(fā)現(xiàn)f.miescher 核酸作為遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)過程核酸作為遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)過程20

2、世紀(jì)初，德國生理學(xué)家柯塞爾(kossel)證實了核酸是由四種不同的堿基所組成；美國科學(xué)家列文(levene)又確定了核酸有兩種,即dna和rna； 1928英國科學(xué)家格里菲斯 (griffith)利用細(xì)菌的性狀轉(zhuǎn)變實驗，證明了遺傳信息的可傳遞性；1944美國科學(xué)家艾佛瑞(avery )證實了dna造成細(xì)菌性狀轉(zhuǎn)變的物質(zhì)基礎(chǔ)；1952美國科學(xué)家赫雪(heishey)和蔡斯(chase )證明遺傳物質(zhì)是dna非蛋白質(zhì)；1953年，英國科學(xué)家沃森和克里克發(fā)現(xiàn)了dna的雙螺旋結(jié)構(gòu)；一一 核酸的概念和重要性核酸的概念和重要性(一)概念由核苷酸或脫氧核苷酸通過3，5-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子，具

3、有非常重要的生物功能，主要是貯存遺傳信息和傳遞遺傳信息。包括核糖核酸(rna)和脫氧核糖核酸(dna)兩類。(二)重要性1.與生命活動關(guān)系密切，是重要的生命物質(zhì)。生命的起源、生長、發(fā)育、衰老、死亡與之有關(guān)。2.核酸研究是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的核心。第二節(jié)、核酸的組成第二節(jié)、核酸的組成二、 核酸的類別、分布和組成（一）、類別：核酸(nucleic acid)分為: 脫氧核糖核酸(dna, deoxyribonucleic acid )與核糖核酸(rna, ribonucleic acid )。核糖核酸（rna）分成以下幾類： 1、信使rna（mrna） 2、轉(zhuǎn)移rna（trna） 3、核糖體rna（

4、rrna） 4、其他的非編碼rna (snrna, microrna)（二）、核酸的分布：（二）、核酸的分布：1 1、dnadna的分布：的分布：真核生物細(xì)胞核，線粒體亦含有dna.原核生物集中于核區(qū)，核外的質(zhì)粒病毒含有dna或rna.2 2、rnarna的分布的分布 存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。 發(fā)現(xiàn)了許多新的具有特殊功能的rna： 如反義rna，核酶等. 病毒和亞病毒rna有許多種：正鏈rna、負(fù)鏈rna病毒、 類病毒、衛(wèi)星病毒等 . （三） 核酸的組成1. 組成的基本單位: 核苷酸2. 組成元素:c 、 h 、 o 、 n 、 prna為d-核糖，dna為 d-2-脫氧核糖，二者都是 型。差

5、別：2 位羥基是否脫氧。（1）核酸中的糖）核酸中的糖（2）堿基：）堿基：a、嘌呤堿：腺嘌呤（ade)、鳥嘌呤(gua)b、嘧啶堿：胞嘧啶(cyt)、尿嘧啶(ura)、胸腺嘧啶(thy) （3）核苷）核苷：l戊糖與堿基通過-糖苷鍵相連，cn糖苷鍵。l糖c1與嘧啶堿n1與嘌呤堿n9相連，堿基與糖環(huán)垂直。l根據(jù)核苷中所含戊糖的不同，分為核糖核苷和脫氧核糖核苷。l核酸分子中的堿基或核苷酸的修飾非常常見，如dna的甲基化，rna的轉(zhuǎn)錄后修飾。 堿基相連（核苷）酯鍵（4）核苷酸）核苷酸一切生物的遺傳物質(zhì)核酸核酸核酸脫氧核糖脫氧核糖核酸核酸（dna）核糖核酸核糖核酸（rna）基本組成單位基本組成單位主要在細(xì)

6、胞核的染主要在細(xì)胞核的染色體上，少數(shù)在線色體上，少數(shù)在線粒體和葉綠體粒體和葉綠體主要在細(xì)胞質(zhì)中主要在細(xì)胞質(zhì)中基本組成單位基本組成單位脫氧核糖脫氧核糖核苷酸核苷酸核糖核苷酸核糖核苷酸五碳糖：脫氧核糖五碳糖：脫氧核糖堿基：堿基：磷酸磷酸a、 g、c 、 t脫氧脫氧核糖核糖堿基堿基磷酸磷酸a腺嘌呤腺嘌呤g鳥嘌呤鳥嘌呤 脫氧核糖核苷酸脫氧核糖核苷酸c胞嘧啶胞嘧啶t胸腺嘧啶胸腺嘧啶五碳糖：核糖五碳糖：核糖堿基：堿基：磷酸磷酸a、 g、c 、 u核糖核糖堿基堿基磷酸磷酸a腺嘌呤腺嘌呤g鳥嘌呤鳥嘌呤 核糖核苷酸核糖核苷酸c胞嘧啶胞嘧啶u尿嘧啶尿嘧啶一、核酸的一級結(jié)構(gòu)一、核酸的一級結(jié)構(gòu)（一）核酸中核苷酸的連接

7、方式dna、rna中的脫氧核苷酸、核苷酸是通過3，5 磷酸二酯鍵連接的。表示方法：書寫順序53。核酸的一級結(jié)構(gòu)是指核酸分子中各核苷酸殘基以磷酸二酯鍵連接、沿多核苷酸鏈排列的順序。第三節(jié)、核酸的結(jié)構(gòu)第三節(jié)、核酸的結(jié)構(gòu)核苷酸的組成與連接核苷酸的組成與連接dnadna的的一一級級結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)圖圖示示（二）一級結(jié)構(gòu)的表示方法（二）一級結(jié)構(gòu)的表示方法（1）線條式：豎線碳鏈、堿基、磷酸pp5335pp53p53acgt（2）文字式：5ppppppppp3dna5ppppppppp3rna此式可進(jìn)一步簡化為：53532 、一級結(jié)構(gòu)特點l dna的相對分子量非常大，能編碼的信息量十分巨大。l細(xì)菌的基因是連續(xù)的,無

8、內(nèi)含子功能相關(guān)基因組成操縱子，有共同的調(diào)控序列，較少重復(fù)序列。l真核生物的基因是斷裂的，有內(nèi)含子功能相關(guān)基因不組成操縱子，調(diào)控序列占比重大，有較大重復(fù)序列,又分為高度重復(fù)、中度重復(fù)、單一序列。此外還有回文結(jié)構(gòu).l越是高等的真核生物其調(diào)控序列和重復(fù)序列的比例越大。1、dna的一級結(jié)構(gòu)ldna的一級結(jié)構(gòu)a、t、g、c通過3，5-磷酸二酯鍵連接，c1堿基，c2脫氧。l堿基：a、t、g、c；脫氧核糖；沒有側(cè)鏈二、dna的二級結(jié)構(gòu)（1）、模型建立的依據(jù)：chargaff等科學(xué)家用紙層析及紫外分光光度技術(shù)分析了各種生物的dna的堿基組成。結(jié)果顯示： 摩爾數(shù) a=t；g=c；a+c=g+t； a+g=c+t

9、腺嘌呤腺嘌呤胸腺嘧啶胸腺嘧啶鳥嘌呤鳥嘌呤胞嘧啶胞嘧啶堿基之間形成氫鍵模型雙螺旋平面圖the double helix maintains a constant width because purines always face pyrimidines in the complementary a-t and g-c base pairs. the sequence in the figure is t-a, c-g, a-t, g-c.（2）dna雙螺旋的特點雙螺旋的特點：a、兩條反平行多核苷酸鏈繞中心軸纏繞，右手螺旋； b、骨架：內(nèi)側(cè)堿基垂直于縱軸；外側(cè)-磷酸與戊糖、彼此通過3、5磷酸二酯鍵

10、，糖環(huán)平面與縱軸平行。大溝寬1.2nm，深0.85nm；小溝寬0.6nm，深0.75nm；c、直徑：2nm，二相鄰堿基高度0.34nm，二核苷酸夾角36度，度，旋轉(zhuǎn)一周旋轉(zhuǎn)一周10個個核苷酸，一周高度3.4nm；三、dna的三級、四級結(jié)構(gòu)：細(xì)長的分子以一種高度壓縮狀態(tài)存在于細(xì)胞中，雙螺旋的進(jìn)一步扭曲就構(gòu)成了三級結(jié)構(gòu)。超螺旋，三級結(jié)構(gòu)中的一種。dna壓縮總原則：多級螺旋，4級壓縮。真核真核原核原核基因基因a基因基因b基因區(qū)間基因區(qū)間四、四、rnarna分子的結(jié)構(gòu)與功能分子的結(jié)構(gòu)與功能（一）、（一）、rna的類別1 信使rna (messenger rna, mrna); 2 轉(zhuǎn)移rna (tra

11、nsfer rna , trna); 3 核糖體rna (ribosomal rna , rrna);（二）、rna結(jié)構(gòu)的特點 rna與dna結(jié)構(gòu)十分相似，二者相比有幾點不同：（1）核糖：（2）堿基：a、 g、 c、 u（3）二者在三維結(jié)構(gòu)上的區(qū)別rna不具有規(guī)則的氫鍵結(jié)構(gòu)，單鏈形式存在，只是回折，局部配對，不配對形成突環(huán)。1、mrna5cap的功能：的功能：3 poly a 的功能：的功能：ala的trna結(jié)構(gòu)示意圖2、trna：轉(zhuǎn)運氨基酸：轉(zhuǎn)運氨基酸t(yī)rna有有“接頭接頭” (adaptor)功能，具備雙重功能，具備雙重特性；特性；識別氨基酸識別氨基酸其其 3末端末端的腺苷酸可與一氨基酸共

12、的腺苷酸可與一氨基酸共價連接價連接識別密碼子識別密碼子反密碼子反密碼子與與mrna中的密碼子堿基中的密碼子堿基配對。配對。6、rrnarrna占rna總量的80%以上，核糖體由大小兩個亞基組成，大小亞基分別幾種rrna和數(shù)十種蛋白質(zhì)組成。rrna與幾十種蛋白質(zhì)組成的細(xì)胞顆粒核糖體是細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的工廠。核糖體上催化肽鍵合成的是rrna，蛋白質(zhì)只是維持rrna的構(gòu)象，起輔助作用。轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯場所：核糖體場所：核糖體場所：細(xì)胞核場所：細(xì)胞核其他其他rna的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能l不均一核內(nèi)不均一核內(nèi)rna (heterogeneous nuclear rna,hnrna)：hnrna是是mr

13、na的未成熟前體。的未成熟前體。l細(xì)胞內(nèi)有小核細(xì)胞內(nèi)有小核rna (small nuclearrna，snrna)。它是真。它是真核生物轉(zhuǎn)錄后加工過程中核生物轉(zhuǎn)錄后加工過程中rna剪接體剪接體(spilceosome)的主要的主要成分，參與成分，參與mrna前體的加工過程。前體的加工過程。l核仁小分子核仁小分子rna (snorna) 負(fù)責(zé)負(fù)責(zé)rrna加工加工(切割和修飾切割和修飾)由由內(nèi)含子編碼。內(nèi)含子編碼。l染色質(zhì)染色質(zhì)rna (chromosome rna), 穩(wěn)定基因組穩(wěn)定基因組dna的作用。的作用。第一節(jié)第一節(jié) 核酸分離純化的設(shè)計及原則核酸分離純化的設(shè)計及原則第二節(jié)第二節(jié) 基因組基因

14、組dnadna的分離純化的分離純化第三節(jié)第三節(jié) 質(zhì)粒質(zhì)粒dnadna的提取與純化的提取與純化第四節(jié)第四節(jié) rnarna的分離純化的分離純化第二章、核酸分離技術(shù)第二章、核酸分離技術(shù)第五節(jié)第五節(jié) 核酸的保存與鑒定核酸的保存與鑒定 1、保持核酸分子結(jié)構(gòu)的完整性； 2、盡量清除其它分子的污染，保證核酸純度； 應(yīng)盡量簡化分離純化步驟，縮短提取時間 盡量避免各種有害因素對核酸的破壞 第一節(jié)第一節(jié) 核酸分離純化的設(shè)計及原則核酸分離純化的設(shè)計及原則一、核酸分子提取的技術(shù)路線一、核酸分子提取的技術(shù)路線i. i.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備ii.ii.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放iii.iii.核酸分離、

15、純化核酸分離、純化iv.iv.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) v.v.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中 （一）核酸的釋放（一）核酸的釋放細(xì)胞破碎的方法細(xì)胞破碎的方法機(jī)械法機(jī)械法高速組織搗碎機(jī)高速組織搗碎機(jī)玻璃勻漿器玻璃勻漿器研缽研缽物理法物理法超聲勻漿器超聲勻漿器凍融法凍融法化學(xué)法化學(xué)法自溶法自溶法酶處理酶處理表面活性劑處理法表面活性劑處理法（二）核酸的分離與純化：（二）核酸的分離與純化：應(yīng)該清除的雜質(zhì)主要包括三部分應(yīng)該清除的雜質(zhì)主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物：蛋白質(zhì)、多糖及脂類 物質(zhì)等 2、非需要的核酸分子：分離某一特定的核酸分子 時，其它

16、的核酸分子皆為雜質(zhì)； 3、加入的有機(jī)溶劑和某些金屬離子（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌l沉淀是濃縮核酸的最常用的方法l常用的鹽類有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂l常用的有機(jī)溶劑則為乙醇、異丙醇和聚乙二醇l核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用70%75%的乙醇洗滌去除二、技術(shù)路線的設(shè)計二、技術(shù)路線的設(shè)計破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞核酸從細(xì)胞中游離出來核酸從細(xì)胞中游離出來沉淀核酸沉淀核酸除去蛋白質(zhì)除去蛋白質(zhì)乙醇乙醇酚和氯仿酚和氯仿核酸的提取過程核酸的提取過程 基因組基因組dnadna的特點：的特點： 1. 1. 分子大，容易斷裂分子大，容易斷裂 2.2.容易污染其它來源

17、的容易污染其它來源的dnadna分離純化方法：分離純化方法：1.1.酚抽提法酚抽提法2.2.甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法3.3.玻棒纏繞法玻棒纏繞法4.4.異丙醇沉淀法異丙醇沉淀法第二節(jié)第二節(jié) 真核基因組真核基因組dnadna的分離純化的分離純化dna酚抽提法示意圖 一、酚抽提法一、酚抽提法基因組基因組dna的提取的提取 - 酚抽提法酚抽提法樣品的準(zhǔn)備細(xì)胞的裂解蛋白質(zhì)變性dna的抽提dna的沉淀血基因組血基因組dna試劑盒試劑盒酵母基因組酵母基因組dna試劑盒試劑盒細(xì)菌基因組細(xì)菌基因組dna試劑盒試劑盒細(xì)胞基因組細(xì)胞基因組dna試劑盒試劑盒dna柱層析法柱層析法示意圖示意圖l質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)獨立于染色

18、體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀dna分子其大小范圍從lkb至200kb以上不等已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒這些質(zhì)粒都是獨立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。l質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實驗技術(shù)。 質(zhì)粒特性質(zhì)粒特性1. 分子相對小 2. 含有高效的自主復(fù)制成分 3. 不相容性4. 轉(zhuǎn)移性5. 選擇的標(biāo)記6. 限制性內(nèi)切酶單一切。質(zhì)粒質(zhì)粒dnadna的提取和純化的提取和純化 1 1細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng) 先分離單個菌落，接種先分離單個菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的到含少量適當(dāng)

19、抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長，質(zhì)粒菌的生長，質(zhì)粒dnadna也也在自主復(fù)制。在自主復(fù)制。質(zhì)粒質(zhì)粒dna的小量制備的小量制備 2-5ml質(zhì)粒質(zhì)粒dna的大量制備的大量制備 500ml2細(xì)菌的收集l細(xì)胞生長過程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒dna的純度，離心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用ste或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈 堿裂解法堿裂解法 煮沸法煮沸法 sdssds裂解法裂解法 triton-triton-溶菌酶法溶菌酶法 3細(xì)菌的裂解方法方法4質(zhì)粒dna的提取- 適用于大質(zhì)粒適用于大質(zhì)粒dna- 不適宜含糖高的菌株如不適宜含糖高的菌株如

20、hb101 l選擇性地使用rnase的變性劑（如酚、氯仿及強(qiáng)烈的胍類變性劑）l設(shè)置專門rna移液裝置；l使用蛋白酶k和陰離子去污劑如sds、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉;l準(zhǔn)備溶液或緩沖液時，使用無rna酶的器皿,depc處理水等; 一、rna制備的條件與環(huán)境第四節(jié)第四節(jié) 真核細(xì)胞真核細(xì)胞rnarna的分離純化的分離純化細(xì)胞細(xì)胞rna的含量的含量每個細(xì)胞的每個細(xì)胞的rna量約為量約為10-5 g 80%-85% rrna 10%-15% trna 1%-5% mrna 其他其他rna：hnrna、 snrna 、snorna核酸的鑒定核酸的鑒定濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定核酸的保存核酸的保存dn

21、a的儲存rna的儲存第五節(jié)第五節(jié) 核酸的鑒定與保存核酸的鑒定與保存一、核酸的濃度鑒定一、核酸的濃度鑒定（1）紫外分光光度法：）紫外分光光度法：該法是基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)因而可以吸收紫外線，其最大吸收波長為260nm。dna或rna的定量，od260=1.0相當(dāng)于l50g/ml雙鏈雙鏈dnal40g/ml單鏈單鏈dna（或（或rna）l20g/ml寡核苷酸寡核苷酸濃度鑒定紫外分光光度法：測定紫外分光光度法：測定dnadna在在a a260nm260nm的光吸收值。的光吸收值。如計算如計算dnadna濃度濃度 a a260260稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)5050 g/mlg/ml紫外分光光度

22、法只用于測定濃度大于紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25ug/ml的的核酸溶液。核酸溶液。(a值等于1時，相當(dāng)于50g/ml雙鏈dna， 40g/ml單鏈dna或rna，20 g/ml單鏈寡核苷酸）熒光光度法：熒光光度法：核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，本身無熒光的核酸在uv激 發(fā)下發(fā)出紅色熒光，且熒光強(qiáng)度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）3.dna 分子片斷的測定l應(yīng)用凝膠電泳可以正確地測定應(yīng)用凝膠電泳可以正確地測定dnadna片段的分片段的分子大小。電泳完畢后，經(jīng)澳化乙錠染色，照子大小。電泳完畢后，經(jīng)澳化乙錠染色，照相，從照片上比較待測

23、樣品中的相，從照片上比較待測樣品中的dnadna片段與片段與標(biāo)準(zhǔn)樣品中的哪一條帶最接近，即可推算出標(biāo)準(zhǔn)樣品中的哪一條帶最接近，即可推算出未知樣品中各片段的大小。未知樣品中各片段的大小。 紫外分光光度法：紫外分光光度法：該法主要通過a260與a280 的比值來判定有無蛋白質(zhì)的污染，比值升高與降低均提示不純。 判斷核酸樣品的純度判斷核酸樣品的純度ldna純品純品: od260/od280 = 1.8lrna純品純品: od260/od280 = 2.0二、核酸的純度鑒定二、核酸的純度鑒定純純dna dna 比值比值1.81.8， 1.8 pr1.8 pr、苯酚污染、苯酚污染純純rna rna 比值

24、比值2.02.0， 2.0 dna 2.0 dna、 prpr、苯酚污染、苯酚污染熒光光度法：熒光光度法：用eb等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可判定核酸制品的純度。dna分子較rna大得多，電泳遷移率低。 dna的完整性測定：的完整性測定：以eb為示蹤劑的核酸凝膠電泳結(jié)果可判定核酸制品的完整性?；蚪Mdna片段的分子量很大，在電場中泳動很慢，如果發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀。三、核酸的完整性鑒定三、核酸的完整性鑒定dnadna片段的降解片段的降解質(zhì)粒質(zhì)粒dna的完整性測定：的完整性測定：l完整或降解很少的總rna電泳圖譜中，三條帶熒光強(qiáng)度積分應(yīng)呈特定的比值，沉降系數(shù)大的核酸區(qū)帶，電泳遷移低，熒光強(qiáng)度

25、積分高；反之，分子量小，電泳遷移率高，熒光強(qiáng)度積分低。l 一般而言，28s（23s）rna的熒光強(qiáng)度約為18s（16s）rna的2倍，否則提示有rna的降解。若在點樣孔附近有著色條帶，則說明存在dna的污染。三三（2）rna的完整性測定：的完整性測定： 總總rnarna電泳圖譜電泳圖譜 正常時，正常時，28s rna的熒光強(qiáng)度的熒光強(qiáng)度約為約為18s rna的的2倍，否則提示倍，否則提示rna的降解的降解1 1、短期貯存：、短期貯存： 44或或-20-20存放于存放于tete（tristris和和edtaedta）緩沖液中。）緩沖液中。 tete緩沖液的緩沖液的phph與與dna dna 貯存

26、有關(guān)，貯存有關(guān)，phph為為8 8時，可減少時，可減少dnadna脫氨反應(yīng)，脫氨反應(yīng)，phph低于低于7.07.0時時dnadna容易變性。容易變性。2 2、長期貯存：、長期貯存： tete緩沖液中緩沖液中-70-70保存數(shù)年；在保存數(shù)年；在dnadna溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。菌和核酸的污染。（二）核酸的保存 -dnadna的儲存的儲存rna溶于0.3mol/l的naac溶液或三蒸水中，-70保存。注意避免rnase 的污染；分裝，避免反復(fù)凍融；如用depc處理過的水溶解rna或者在rna溶液中加入rnasin或vrc，保存時間可延長。2、rna

27、的儲存的儲存格里菲斯的細(xì)菌性狀轉(zhuǎn)變實驗格里菲斯的細(xì)菌性狀轉(zhuǎn)變實驗肺炎雙球菌s型有致病力r型無致病力老鼠死亡血液中分離出s型菌老鼠存活血液中分離不出r型菌格里菲斯格里菲斯的細(xì)菌性狀轉(zhuǎn)變實驗的細(xì)菌性狀轉(zhuǎn)變實驗活的s型菌活的r型菌死的s型菌活的r型菌加熱殺死的s型菌活的s型菌艾佛瑞證實了艾佛瑞證實了dna促使細(xì)菌轉(zhuǎn)型促使細(xì)菌轉(zhuǎn)型取出萃取物1.dna分解酶2.rna分解酶3.蛋白質(zhì)分解酶假設(shè)：s型菌具有某種物質(zhì)促使r型菌發(fā)生轉(zhuǎn)型s型菌r型菌r型菌r型菌r型菌s型菌s型菌赫雪、蔡斯證實了赫雪、蔡斯證實了dna為遺傳物質(zhì)為遺傳物質(zhì)l以t2噬菌體和大腸桿菌作為材料；l目的：欲知是何種物質(zhì)可作為噬菌體的遺傳物

28、 質(zhì)，dna？還是蛋白質(zhì)外鞘？l利用放射性同位素：35s標(biāo)定噬菌體蛋白質(zhì) 32p標(biāo)定噬菌體dna蛋白質(zhì)外鞘dna噬菌體侵染細(xì)菌的實驗多基因表型多基因表型: :膚色膚色多基因表型多基因表型: :身高身高數(shù)量性狀多基因表型核酸核酸遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ) 基因是所有生物體遺傳信息的載體基因是所有生物體遺傳信息的載體，是決定生老，是決定生老病死等所有現(xiàn)象的基本元素?；虻奈镔|(zhì)基礎(chǔ)是病死等所有現(xiàn)象的基本元素?；虻奈镔|(zhì)基礎(chǔ)是核核酸分子酸分子。人類的健康是受人類的健康是受內(nèi)因和外因內(nèi)因和外因共同的影響。共同的影響。 所有疾病的發(fā)生都與基因密切相關(guān)所有疾病的發(fā)生都與基因密切相關(guān)葉綠體中含有環(huán)狀dna細(xì)

29、菌等原核生物細(xì)菌等原核生物線粒體中含有環(huán)狀dnabasesugaracid核苷酸的基本構(gòu)造monophosphatediphosphatetriphosphateadenineguaninethyminecytosineuracilnucleoside (adenosine)nucleotide (adenosine monophosphate, amp)purinepyrimidine核苷核苷酸磷 酸五環(huán)糖ribose, deoxyribose堿基12345高速搗碎法：將組織加鹽水(約1312)裝入搗碎機(jī)桶內(nèi)。用10 000 rmin間斷離心，每次3060 s，防止離心時間過長產(chǎn)生的熱破壞抗

30、原活性。高速組織搗碎機(jī)高速組織搗碎機(jī) 高速搗碎法高速搗碎法玻璃勻漿器玻璃勻漿器 研磨法用玻璃勻漿器。主要經(jīng)過旋轉(zhuǎn)、擠壓等方式將組織粉碎。用此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)高，對大分子的破壞也少。該法可用于粉碎少量軟嫩材料（腦、胰、肝等）時常用的方法。玻璃勻漿器玻璃勻漿器 常用酶類：常用酶類：溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等 方法：方法：在一定的條件下，能消化細(xì)菌和在一定的條件下，能消化細(xì)菌和 組織細(xì)胞。組織細(xì)胞。 特點：特點：此法適用多種微生物；此法適用多種微生物； 具有作用條件溫和；具有作用條件溫和； 內(nèi)含物成分不易受到破壞；內(nèi)含物成分不易受到破壞； 細(xì)胞壁損壞的程度可以

31、控制。細(xì)胞壁損壞的程度可以控制。 原理：原理：在適當(dāng)?shù)臏囟?、在適當(dāng)?shù)臏囟?、phph及低離子強(qiáng)度的條及低離子強(qiáng)度的條 件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡， 使膜的滲透性改變或使之溶解。使膜的滲透性改變或使之溶解。 常用的有：常用的有：十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉(sds,(sds,陰離子型陰離子型) )、二乙、二乙胺十六烷基溴（陽離子型）、聚山梨酯（非離子型）、胺十六烷基溴（陽離子型）、聚山梨酯（非離子型）、新潔爾滅等。新潔爾滅等。 應(yīng)用：應(yīng)用：破碎細(xì)菌，且作用比較溫和；破碎細(xì)菌，且作用比較溫和； 提取基因組或質(zhì)粒提取基因組或質(zhì)粒dnadna的常用破碎方法。的

32、常用破碎方法。 各種堿基的紫外吸收光譜各種堿基的紫外吸收光譜eb與dna的結(jié)合核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)l在細(xì)胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物形式存在在細(xì)胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物形式存在l微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機(jī)溶劑微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機(jī)溶劑l在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。ldnadna溶液粘度很大，溶液粘度很大，rnarna的粘度較小的粘度較小l在強(qiáng)大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來在強(qiáng)大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來dna樣品準(zhǔn)備樣品準(zhǔn)備l常見的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等；l需要對樣本進(jìn)行預(yù)處理；l生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存 70或液氮。ledta的作用：l二價金屬螯合劑，抑制核酸酶；l降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。lsds的作用：l溶解膜蛋白和脂肪，從而是細(xì)胞膜破裂；l溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來；l對rna、dna酶有抑制作用；l與蛋白質(zhì)形成r-o-so3 .r蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白