雙水相萃取技術(shù)g課件

1、雙水相萃取技術(shù)g1雙水相萃取技術(shù)雙水相萃取技術(shù)1.1 1.1 雙水相系統(tǒng)雙水相系統(tǒng)1.2 1.2 雙水相中的分配平衡雙水相中的分配平衡1.3 1.3 影響物質(zhì)分配平衡的因素影響物質(zhì)分配平衡的因素1. 4 1. 4 雙水相系統(tǒng)的應(yīng)用雙水相系統(tǒng)的應(yīng)用 基因工程產(chǎn)品如蛋白質(zhì)和酶往往是胞內(nèi)產(chǎn)品，需基因工程產(chǎn)品如蛋白質(zhì)和酶往往是胞內(nèi)產(chǎn)品，需經(jīng)細(xì)胞破碎后才能提取、純化，細(xì)胞顆粒尺寸的經(jīng)細(xì)胞破碎后才能提取、純化，細(xì)胞顆粒尺寸的變化給固液分離帶來了困難，同時(shí)這類產(chǎn)品的變化給固液分離帶來了困難，同時(shí)這類產(chǎn)品的活性和功能對(duì)活性和功能對(duì)pH值、溫度和離子強(qiáng)度等環(huán)境因素值、溫度和離子強(qiáng)度等環(huán)境因素特別敏感。由于它們?cè)?/p>

2、有機(jī)溶劑中的溶解度低并特別敏感。由于它們?cè)谟袡C(jī)溶劑中的溶解度低并且會(huì)變性，因此傳統(tǒng)的溶劑萃取法并不適合。采且會(huì)變性，因此傳統(tǒng)的溶劑萃取法并不適合。采用在有機(jī)相中添加表面活性劑產(chǎn)生反膠束的辦法用在有機(jī)相中添加表面活性劑產(chǎn)生反膠束的辦法可克服這些問題，但同樣存在相的分離問題?？煽朔@些問題，但同樣存在相的分離問題。有機(jī)溶劑萃取的不足：有機(jī)溶劑萃取的不足：許多蛋白質(zhì)都有極強(qiáng)的親水性，不溶于有機(jī)溶劑許多蛋白質(zhì)都有極強(qiáng)的親水性，不溶于有機(jī)溶劑;蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑相中易變性失活。蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑相中易變性失活。雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn)雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn): 使固液分離和純化兩個(gè)步驟同時(shí)進(jìn)行，一步完成；使固液分離和純化兩

3、個(gè)步驟同時(shí)進(jìn)行，一步完成； 適合熱敏物質(zhì)的提取，主要是胞內(nèi)酶；適合熱敏物質(zhì)的提取，主要是胞內(nèi)酶； 親水性聚合物加入水中，形成兩相，在這兩相中，水親水性聚合物加入水中，形成兩相，在這兩相中，水 分都占大比例（分都占大比例（8595），這樣生物活性蛋白質(zhì)在），這樣生物活性蛋白質(zhì)在兩相中不會(huì)失活，且以一定比例分配于兩相中。兩相中不會(huì)失活，且以一定比例分配于兩相中。 物質(zhì)類型物質(zhì)類型物質(zhì)物質(zhì)P的名稱的名稱物質(zhì)物質(zhì)Q的名稱的名稱兩種非離子型聚合兩種非離子型聚合物物聚丙二醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙二醇 聚乙烯醇聚乙烯醇葡聚糖（葡聚糖（Dx）羥丙基葡萄糖羥丙基葡萄糖 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）聚乙烯醇聚乙烯醇

4、葡萄糖葡萄糖 (Dx)聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮P為帶電荷聚電解質(zhì)為帶電荷聚電解質(zhì)硫酸葡聚糖鈉鹽硫酸葡聚糖鈉鹽羧甲基葡聚糖鈉鹽羧甲基葡聚糖鈉鹽聚丙二醇、聚乙二醇聚丙二醇、聚乙二醇甲基纖維素甲基纖維素P Q都為聚電解質(zhì)都為聚電解質(zhì) 羧甲基葡聚糖鈉鹽羧甲基葡聚糖鈉鹽羧甲基纖維素鈉鹽羧甲基纖維素鈉鹽P為聚合物為聚合物Q為鹽類為鹽類 聚乙二醇聚乙二醇 磷酸鉀、硫酸銨、硫酸鈉磷酸鉀、硫酸銨、硫酸鈉硫酸鎂、酒石酸鉀鈉硫酸鎂、酒石酸鉀鈉雙水相萃取技術(shù)g6a雙節(jié)線系線b雙節(jié)線均相區(qū)均相區(qū)兩相區(qū)兩相區(qū)系線臨界點(diǎn)圖分別為圖分別為PEG/葡萄糖葡萄糖(Dx)和和PEG/磷酸鉀磷酸鉀(KPi)系統(tǒng)的典型相圖系統(tǒng)的典

5、型相圖 在系線上各點(diǎn)處系統(tǒng)的總濃度不同，但均分成組成相同而體積不同的兩相。兩相的體積近似服從杠桿規(guī)則，即 系線的長度是衡量兩相間相對(duì)差別的尺度，系線越長，兩相間的性質(zhì)差別越大，反之則越小。當(dāng)系線長度趨向于零時(shí)，即在圖b的雙節(jié)線上K點(diǎn)，兩相差別消失，任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1，因此K點(diǎn)稱為臨界點(diǎn)(critical point)。 與溶劑萃取相同，溶質(zhì)在雙水相中的分配系與溶劑萃取相同，溶質(zhì)在雙水相中的分配系數(shù)也用數(shù)也用m=c2/c1表示。為簡便起見，用表示。為簡便起見，用c1 和和c2分分別表示平衡狀態(tài)下下相和上相中溶質(zhì)的總濃度。別表示平衡狀態(tài)下下相和上相中溶質(zhì)的總濃度。 生物分子的分配系數(shù)

6、取決于溶質(zhì)與雙水相系生物分子的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)與雙水相系統(tǒng)間的各種相互作用，其中主要有統(tǒng)間的各種相互作用，其中主要有靜電作用、疏靜電作用、疏水作用和生物親和作用水作用和生物親和作用等。等。 lnm=lnme+lnmh+lnml 非電解質(zhì)型溶質(zhì)的分配系數(shù)不受靜電作用的影響，非電解質(zhì)型溶質(zhì)的分配系數(shù)不受靜電作用的影響，利用相平衡熱力學(xué)理論可推導(dǎo)下述分配系數(shù)表達(dá)式：利用相平衡熱力學(xué)理論可推導(dǎo)下述分配系數(shù)表達(dá)式：lnlnm m = -M/RT= -M/RTm-m-分配系數(shù)；分配系數(shù)；M-M-溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量；溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量；-與溶質(zhì)表面性質(zhì)和與溶質(zhì)表面性質(zhì)和成相系統(tǒng)有關(guān)的常數(shù)成相系統(tǒng)有關(guān)的常數(shù)

7、; R-; R-氣體常數(shù)，氣體常數(shù)，J/(mo1J/(mo1K)K)；T-T-絕對(duì)溫度，絕對(duì)溫度，K K。 因此，溶質(zhì)的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)與相對(duì)分子質(zhì)量之因此，溶質(zhì)的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)與相對(duì)分子質(zhì)量之間呈線性關(guān)系，在同一個(gè)雙水相系統(tǒng)中，若間呈線性關(guān)系，在同一個(gè)雙水相系統(tǒng)中，若00，不，不同溶質(zhì)的分配系數(shù)隨相對(duì)分子質(zhì)量的增大而減小。同同溶質(zhì)的分配系數(shù)隨相對(duì)分子質(zhì)量的增大而減小。同一溶質(zhì)的分配系數(shù)隨雙水相系統(tǒng)的不同而改變，這是一溶質(zhì)的分配系數(shù)隨雙水相系統(tǒng)的不同而改變，這是因?yàn)槭街械囊驗(yàn)槭街械碾S雙水相系統(tǒng)而異。隨雙水相系統(tǒng)而異。雙水相萃取技術(shù)g10 實(shí)際的雙水相系統(tǒng)中通常含有緩沖液和無機(jī)鹽等實(shí)際的雙水相系統(tǒng)

8、中通常含有緩沖液和無機(jī)鹽等電解質(zhì)，當(dāng)這些離子在兩相中分配濃度不同時(shí)電解質(zhì)，當(dāng)這些離子在兩相中分配濃度不同時(shí)( (即分即分配系數(shù)配系數(shù)1)1)，將在兩相間產(chǎn)生電位差，此時(shí)，荷電溶，將在兩相間產(chǎn)生電位差，此時(shí)，荷電溶質(zhì)的分配平衡將受相間電位的影響，從相平衡熱力學(xué)質(zhì)的分配平衡將受相間電位的影響，從相平衡熱力學(xué)理論推導(dǎo)溶質(zhì)的分配系數(shù)表達(dá)式為理論推導(dǎo)溶質(zhì)的分配系數(shù)表達(dá)式為lnm=lnmo+FZ/RT 因此，荷電溶質(zhì)的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)與溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成正因此，荷電溶質(zhì)的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)與溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成正比比, ,由于同一雙水相系統(tǒng)中添加不同的鹽產(chǎn)生的相間電位不同，由于同一雙水相系統(tǒng)中添加不同的鹽產(chǎn)生的相間電

9、位不同，故分配系數(shù)與靜電荷數(shù)的關(guān)系因無機(jī)鹽而異故分配系數(shù)與靜電荷數(shù)的關(guān)系因無機(jī)鹽而異. . PEG/Dx和和PEG/無機(jī)鹽等雙水相系統(tǒng)的上相無機(jī)鹽等雙水相系統(tǒng)的上相(PEG相相)疏水疏水性較大，相間的疏水性差用疏水性因子性較大，相間的疏水性差用疏水性因子HF (hydrophoblc factor)表示。表示。HF可通過測定疏水性已知的氨基酸在其等電點(diǎn)可通過測定疏水性已知的氨基酸在其等電點(diǎn)處的分配系數(shù)處的分配系數(shù)maa測算測算lnmaa=HF(RH+B)其中，其中，RH為氨基酸的相對(duì)疏水性為氨基酸的相對(duì)疏水性(relative hydrophobicity)，是通過測定氨基酸在水和乙醇中溶解度

10、的差別確定的，并設(shè)是通過測定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差別確定的，并設(shè)疏水性最小的甘氨酸的疏水性最小的甘氨酸的RH0。所以上式中。所以上式中 B為為 B = lnmGly/HFpHpI時(shí)氨基酸在雙水相系統(tǒng)中的分配系數(shù)與其時(shí)氨基酸在雙水相系統(tǒng)中的分配系數(shù)與其RH值呈線性關(guān)系，值呈線性關(guān)系，直線的斜率就是該雙水相系統(tǒng)的直線的斜率就是該雙水相系統(tǒng)的HF值。值。雙水相萃取技術(shù)g14 如果在如果在pH為等電點(diǎn)的雙水相中蛋白質(zhì)的分配系數(shù)為等電點(diǎn)的雙水相中蛋白質(zhì)的分配系數(shù)(m0)與與HF值之間呈線性關(guān)系，則直線的斜率定義為該蛋白質(zhì)值之間呈線性關(guān)系，則直線的斜率定義為該蛋白質(zhì)的表面疏水性，用的表面疏水性，用H

11、FS (hydrophobic factor of solutes)表示表示lnm0=HF HFS鹽濃度對(duì)血紅蛋白分配系數(shù)的影響PEG/Dx,pH=pI;NaCl(mol/kg):() 0; () 0.6; () 1; () 2從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,蛋白質(zhì)的表面疏水性蛋白質(zhì)的表面疏水性HFS隨添加隨添加NaCl濃度的增大而增大濃度的增大而增大.將鹽對(duì)蛋白質(zhì)疏水性的影將鹽對(duì)蛋白質(zhì)疏水性的影響引入上式，則響引入上式，則lnm0=HF( HFS+ HFS)式中，式中， HFS為鹽濃度增加引起的為鹽濃度增加引起的HFS值增量。因此：值增量。因此：lnm=HF(HFS+HFS)+ FZ/RT該式

12、較全面地描述了雙水相系統(tǒng)的疏水性和相間該式較全面地描述了雙水相系統(tǒng)的疏水性和相間電位、蛋白質(zhì)的疏水性和凈電荷數(shù)對(duì)分配系數(shù)的電位、蛋白質(zhì)的疏水性和凈電荷數(shù)對(duì)分配系數(shù)的影響，同時(shí)也間接地通過鹽對(duì)蛋白質(zhì)表面疏水性影響，同時(shí)也間接地通過鹽對(duì)蛋白質(zhì)表面疏水性和相間電位的影響表現(xiàn)了鹽對(duì)蛋白質(zhì)分配系數(shù)的作用。和相間電位的影響表現(xiàn)了鹽對(duì)蛋白質(zhì)分配系數(shù)的作用。雙水相萃取技術(shù)g151.3 影響物質(zhì)分配平衡的因素影響物質(zhì)分配平衡的因素 聚合物的分子量聚合物的分子量 聚合物的濃度聚合物的濃度分子量越小，蛋白質(zhì)容易分配于富含該聚合物的相中。分子量越小，蛋白質(zhì)容易分配于富含該聚合物的相中。l當(dāng)接近分配的臨界點(diǎn)蛋白質(zhì)均勻分

13、配于兩相中，分配系數(shù)接近當(dāng)接近分配的臨界點(diǎn)蛋白質(zhì)均勻分配于兩相中，分配系數(shù)接近1；l成相聚合物的總濃度或聚合物成相聚合物的總濃度或聚合物/鹽濃度的比例增加時(shí)，系統(tǒng)遠(yuǎn)離平衡鹽濃度的比例增加時(shí)，系統(tǒng)遠(yuǎn)離平衡點(diǎn)，此時(shí)兩相性質(zhì)的差別增加，蛋白質(zhì)容易趨向于某一極。點(diǎn)，此時(shí)兩相性質(zhì)的差別增加，蛋白質(zhì)容易趨向于某一極。雙水相萃取技術(shù)g163. 鹽的種類和濃度鹽的種類和濃度4. pH值值5. 溫度溫度 鹽的種類鹽的種類(離子組成離子組成)影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分配影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分配系數(shù)，鹽濃度不僅影響蛋白質(zhì)的表面疏水性，而且擾亂雙水相系數(shù)，鹽濃度不僅影響蛋白質(zhì)的表面疏水性，而且擾亂雙水

14、相系統(tǒng)，改變各相中成相物質(zhì)的組成和相體積比。系統(tǒng)，改變各相中成相物質(zhì)的組成和相體積比。 pH值影響蛋白質(zhì)的解離度，調(diào)節(jié)值影響蛋白質(zhì)的解離度，調(diào)節(jié)pH值可改變蛋白質(zhì)的表面值可改變蛋白質(zhì)的表面電荷數(shù)，從而改變分配系數(shù)。電荷數(shù)，從而改變分配系數(shù)。 溫度影響雙水相系統(tǒng)的相圖，因而影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。溫度影響雙水相系統(tǒng)的相圖，因而影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。但一般來說，當(dāng)雙水相系統(tǒng)離雙節(jié)線足夠遠(yuǎn)時(shí)，溫度的影響很小，但一般來說，當(dāng)雙水相系統(tǒng)離雙節(jié)線足夠遠(yuǎn)時(shí)，溫度的影響很小，12度的溫度改變不影響目標(biāo)產(chǎn)物的萃取分離。度的溫度改變不影響目標(biāo)產(chǎn)物的萃取分離。 目前已知的胞內(nèi)酶約目前已知的胞內(nèi)酶約2500種，但投入生

15、產(chǎn)的很種，但投入生產(chǎn)的很少。原因之一是提取困難。胞內(nèi)酶提取的第一步系將少。原因之一是提取困難。胞內(nèi)酶提取的第一步系將細(xì)胞破碎得到勻漿液，但勻漿液黏度很大，有微小的細(xì)胞破碎得到勻漿液，但勻漿液黏度很大，有微小的細(xì)胞碎片存在，欲將細(xì)胞碎片除去，過去是依靠離心細(xì)胞碎片存在，欲將細(xì)胞碎片除去，過去是依靠離心分離的方法，但非常困難。分離的方法，但非常困難。雙水相系統(tǒng)可用于細(xì)胞碎雙水相系統(tǒng)可用于細(xì)胞碎片以及酶的進(jìn)一步精制。片以及酶的進(jìn)一步精制。1. 雙水相萃取法常用于胞內(nèi)酶提取雙水相萃取法常用于胞內(nèi)酶提取1.4 雙水相萃取的應(yīng)用雙水相萃取的應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)g18酶酶菌種菌種相系統(tǒng)相系統(tǒng)收率收率(%)分配

16、系數(shù)分配系數(shù)純化因子純化因子細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度(%)延胡索酸酶延胡索酸酶Brevibacterium ammoniagenesPEG/鹽鹽833.37.520天門冬氨酸酶天門冬氨酸酶E. ColiPEG/鹽鹽965.76.625異亮氨酰異亮氨酰tRNA 合成酶合成酶E. ColiPEG/鹽鹽933.62.320-半乳糖苷酶半乳糖苷酶E. ColiPEG/鹽鹽876.29.312亮氨酸脫氫酶亮氨酸脫氫酶Bacillus sphaericusPEG/Dx989.52.420甲醛脫氫酶甲醛脫氫酶Candida boidiniiPEG/鹽鹽9411-20葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶Streptomyces

17、sp.PEG/鹽鹽863.02.520延胡索酸酶延胡索酸酶E. ColiPEG/鹽鹽933.23.425利用雙水相從細(xì)胞碎片中提取胞內(nèi)酶的典型例子利用雙水相從細(xì)胞碎片中提取胞內(nèi)酶的典型例子雙水相萃取技術(shù)g19分離物質(zhì)分離物質(zhì)舉例舉例體系體系分配系數(shù)分配系數(shù)收率收率/%核酸核酸分離有活性核酸分離有活性核酸DNAPEG/Dextran-生長素生長素人生長激素的純化人生長激素的純化PEG/鹽鹽6.460病毒病毒脊髓病毒和線病毒脊髓病毒和線病毒PEG/NaDS-90干擾素干擾素分離分離-干擾素干擾素PEG-磷酸酯磷酸酯/鹽鹽63097細(xì)胞組織細(xì)胞組織分離含有膽堿受體分離含有膽堿受體的細(xì)胞的細(xì)胞三甲胺三

18、甲胺- PEG/Dextran3.6457雙水相萃取技術(shù)在其它分離過程中的應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)在其它分離過程中的應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)g20細(xì)胞勻漿液細(xì)胞勻漿液+PEG/鹽（或葡萄糖）PEG/鹽或鹽或PEG/Dx萃取系統(tǒng)萃取系統(tǒng)相分離下相下相上相（上相（ PEG)(細(xì)胞碎片，雜蛋白，多糖，核酸）（目標(biāo)產(chǎn)物，雜蛋白，多糖，核酸）+鹽PEG/鹽萃取系統(tǒng)鹽萃取系統(tǒng)相分離下相下相上相（上相（ PEG)（雜蛋白，多糖，核酸）（目標(biāo)產(chǎn)物）+鹽PEG/鹽萃取系統(tǒng)鹽萃取系統(tǒng)下相下相（雜蛋白，鹽）相分離上相上相（PEG，目標(biāo)產(chǎn)物）三步萃取流程示意圖：三步萃取流程示意圖： 欲提取的酶和細(xì)胞應(yīng)分配在不同的相中；欲提取的酶和細(xì)胞應(yīng)分配在不同的相中； 酶的分配系數(shù)應(yīng)足夠大，使在一定的相體積酶的分配系數(shù)應(yīng)足夠大，使在一定的相體積比時(shí)，經(jīng)過一次萃取，就能得到高的收率；比時(shí)，經(jīng)過一次萃取，就能得到高的收率； 兩相用離心機(jī)很容易分離。兩相用離心機(jī)很容易分離。2. 雙水相反應(yīng)雙水相反應(yīng) 在雙水相系統(tǒng)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化翻譯功能，如酶促反應(yīng)，在雙水相系統(tǒng)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化翻譯功能，如酶促反應(yīng)，可以把產(chǎn)物移入另一相中，消除產(chǎn)物抑制，因而提高可以把產(chǎn)物移入另一相中，消除產(chǎn)物抑制，因而提高了產(chǎn)率。這實(shí)際上是一種反應(yīng)和分離耦合的過程，有了產(chǎn)率。這實(shí)際上是一種反應(yīng)和分離耦合的過程，有時(shí)也稱為萃取生物轉(zhuǎn)化