水微生物檢測蒼松書屋

1、水微生物檢測南華大學預防醫(yī)學與放射衛(wèi)生實驗教學中心南華大學預防醫(yī)學與放射衛(wèi)生實驗教學中心1深層分析 教學對象：高等醫(yī)學院校衛(wèi)生檢驗專業(yè)學生教學對象：高等醫(yī)學院校衛(wèi)生檢驗專業(yè)學生 實驗課時：實驗課時：8 8學時學時 課程類型：專業(yè)實驗課課程類型：專業(yè)實驗課 課程要求：必修課程要求：必修 每組人數(shù)：每組人數(shù)：2 2人人2深層分析實驗目的與要求掌握水樣采集規(guī)則及注意事項。熟悉常用水衛(wèi)生細菌學指標。熟悉菌落總數(shù)、大腸菌群的測定方法及檢測意義。學會對所檢測的水樣作綜合分析。3深層分析水微生物檢測的意義 水體的微生物污染問題日趨嚴重。在各種水體，特別是污染水體中存在有大量的有機物質(zhì)，適于各種微生物的生長。

2、水體中微生物污染的來源：土壤，以及人類、動物的排泄物污染。水體中少數(shù)致病微生物（主要來自人或動物的糞便污染）可導致某些腸道傳染病傳播。 水微生物檢測可用于評價水質(zhì)情況，預報水質(zhì)的污染趨勢，以保證水質(zhì)的衛(wèi)生安全。4深層分析 在實際工作中，對水質(zhì)衛(wèi)生質(zhì)量的評價和控制，是無法對水體中各種可能存在的致病微生物一一進行檢測。 一般選擇有代表性的一種或一類微生物作為指示菌，通過對指示菌的檢測，來了解水體是否受到過的微生物污染，是否有腸道病原微生物存在的可能。5深層分析水微生物的檢測指標 菌落總數(shù)(aerobic bacterial count)是指1ml水樣在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37經(jīng)24h培養(yǎng)后，所生長

3、的細菌菌落的總數(shù)。檢測意義：作為一般性污染的指標，即評價被檢樣品的微生物污染程度和安全性。水樣菌落總數(shù)越多，說明水被微生物污染程度越嚴重，病原微生物存在的可能性越大，但不能說明污染的來源。6深層分析水質(zhì)微生物的檢測指標 總大腸菌群(coliform bacteria)是指一群需氧及兼性厭氧的，37生長時能使乳糖發(fā)酵，在24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。檢測意義：作為糞便污染的指標。水樣總大腸菌群數(shù)的含量，表明水被糞便污染的程度，而且間接地表明有腸道致病菌存在的可能。7深層分析實驗內(nèi)容水樣采集；菌落總數(shù)的測定；總大腸菌群的測定。8深層分析一、水樣采集9深層分析 采樣原則所采集的樣品具有代表

4、性。采樣容器：選擇硼硅玻璃瓶和聚乙烯塑料瓶。不能是新的污染源；不吸收或吸附某些待測組分；不與待測組分發(fā)生反應。保證從采樣到分析期間，樣品各組分的濃度不發(fā)生改變。 必須按一般無菌操作的基本要求采集，并保證在運送、貯存過程中不受污染。10深層分析 自來水水樣：先將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌，再開放水龍頭使水流5 min（經(jīng)常用水的水龍頭放水13min）后，采集水樣于無菌錐形瓶，約占瓶容量80%，以便搖勻水樣。 水源水水樣：選有代表性的地點及可疑地方，一般距水面下1015cm采樣。采樣后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。11深層分析注意事項嚴格無菌操作。做好標記：采得水樣后應立即記錄水樣名稱、地點、

5、時間等項目。從速送檢。水樣從采集到檢驗不應超過2h，在04下保存不應超過24h。12深層分析二、菌落總數(shù)的測定 平板菌落計數(shù)法13深層分析（一）生活飲用水器材與試劑 無菌1ml吸管1支/組，無菌平皿3個/組，營養(yǎng)瓊脂。14深層分析方法水樣搖勻2025次，使細菌分散。傾注培養(yǎng)：無菌吸取1ml水樣分別置于2個空平皿，另一個作空白對照。再傾注15ml瓊脂（約45）于平皿中旋轉(zhuǎn)，混勻待瓊脂凝固后倒置3724h。菌落計數(shù)：用肉眼或放大鏡檢查，計數(shù)平皿內(nèi)菌落數(shù)目。15深層分析 結(jié)果分析與報告計算平均菌落數(shù)：報告方式：菌落總數(shù)(cfu/ml)。 cfu：colony forming units當檢樣的菌落數(shù)

6、為l100時，按實有數(shù)報告；大于100時，采用二位有效數(shù)字報告。國家標準（gb5749-2006）規(guī)定生活飲用水菌落總數(shù)每毫升不得超過100個。16深層分析（二）水源水 器材與試劑 無菌1ml吸管6支/組，無菌10ml吸管1支/組。無菌平皿9個/組，營養(yǎng)瓊脂。90ml滅菌鹽水1瓶（內(nèi)置適量玻璃珠），9ml滅菌鹽水管3支。17深層分析方法 稀釋水樣：無菌吸10ml混勻水樣注入90ml滅菌水瓶中,混勻成1:10水樣。取1:10水樣1ml注入9ml滅菌試管中混勻成1:100水樣。同法稀釋成1:1000, 1:10000水樣。18深層分析方法 傾注培養(yǎng)：用1ml無菌吸管吸取23個適當濃度的稀釋液1ml

7、,分別注入無菌平皿中，每個稀釋度應同時做2個平皿，另取一平皿作空白對照。再做傾注培養(yǎng)(方法同飲用水)。菌落計數(shù)：方法同飲用水。19深層分析菌落總數(shù)測定20深層分析結(jié)果分析與報告計算不同稀釋度的平均菌落數(shù)：稀釋度的選擇和菌落總數(shù)報告方式：首先選擇平均菌落在30300之間者進行計算。 計算方法和報告方式如表1所示。21深層分析表1稀釋度選擇及菌落總數(shù)報告方式例例次次不同稀釋度的平均菌不同稀釋度的平均菌落數(shù)落數(shù)兩稀釋兩稀釋度菌落度菌落總數(shù)之總數(shù)之比比 菌落總數(shù)菌落總數(shù) (cfucfum1) 報告方式報告方式 (cfucfum1) 10-1 10-2 10-3123456781365276028901

8、50多不可計多不可計27多不可計多不可計0 164 295 271 304650 1l305020466085135120 1.6 2.2 2 1640037750271001 5005130002703050011016000或或1.610438000或或3.810427000或或2.71041500或或1.5103510000或或5.1105270或或2.710231000或或3.11041022深層分析 由表2可判定水質(zhì)被污染的程度。表2 一般水源水中菌落總數(shù)與水清潔程度的關系 水的類別水的類別最清潔最清潔水水清潔水清潔水不太清潔不太清潔水水不清潔水不清潔水極不清潔極不清潔水水菌落總數(shù)菌

9、落總數(shù) cfucfum11010010010001000100001000010000010000023深層分析注意事項菌落總數(shù)測定中，應選擇合適的稀釋度進行。（生活飲用水，國家標準規(guī)定每毫升不得超過100個，因此可以直接吸取1毫升到平板進行培養(yǎng)）各稀釋管、相應平皿做好標記。包括：水樣名稱、稀釋度、時間、小組。嚴格無菌操作。進行水樣稀釋時，每一稀釋度均需更換吸管。傾注時，要注意營養(yǎng)瓊脂的溫度。傾入瓊脂后要混勻，待瓊脂凝固后倒置培養(yǎng)。24深層分析三、總大腸菌群的測定多管發(fā)酵法分為三步： 初發(fā)酵試驗 平板分離 復發(fā)酵證實試驗25深層分析 初發(fā)酵試驗：采用乳糖蛋白胨培養(yǎng)液37培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣

10、情況。 平板分離：對陽性管培養(yǎng)物，接種于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基或伊紅美藍培養(yǎng)基，觀察菌落特征，并進行革蘭氏染色和鏡檢。 復發(fā)酵證實試驗：對典型和可疑菌落，接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，進行復發(fā)酵證實試驗，并根據(jù)標準所附檢數(shù)表報告結(jié)果。 26深層分析產(chǎn)氣初發(fā)酵、復發(fā)酵試驗結(jié)果初發(fā)酵、復發(fā)酵試驗結(jié)果27深層分析大腸菌群emb上菌落特征28深層分析大腸菌群革蘭染色形態(tài)29深層分析（一）生活飲用水 器材與試劑 2瓶50ml三倍濃縮的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（內(nèi)有導管）, 10支5ml三倍濃縮的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（內(nèi)有導管）,10ml吸管1支,100ml量筒1支。emb，革蘭染液等。30深層分析 方法 初步發(fā)酵試驗：接種水

11、樣總量為300ml（100ml 2份，10ml 10 份，12支發(fā)酵管） 。37培養(yǎng)24h。平板分離：將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣(發(fā)酵乳糖)管接種emb, 37培養(yǎng)24h，取典型菌落作革蘭氏染色鏡檢。復發(fā)酵試驗：革蘭氏染色鏡檢為革蘭陰性無芽胞桿菌，取該菌接種于普通濃度乳糖蛋白胨(每管接13個菌落), 37培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者即證明有大腸桿菌的存在。 31深層分析產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)酸產(chǎn)氣報告為大腸菌群陽性32深層分析 結(jié)果分析與報告根據(jù)證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)，查接種水樣總量為300ml檢數(shù)表（表3）。報告每升水樣中的大腸菌群數(shù)（mpn 值，most probable number，最大可能

12、數(shù)法）。國家標準（gb5749-2006）規(guī)定生活飲用水大腸菌數(shù)每升不得超過3個。 33深層分析表3 大腸菌群數(shù)檢數(shù)表接種水樣總量300ml（100ml 2份，10ml 10 份）1010mlml水水量的陽量的陽性管數(shù)性管數(shù)100100 ml ml 水量的陽性管數(shù)水量的陽性管數(shù)012每升水樣中大腸菌群每升水樣中大腸菌群數(shù)數(shù)每升水樣中大腸菌群每升水樣中大腸菌群數(shù)數(shù)每升水樣中大腸菌群每升水樣中大腸菌群數(shù)數(shù)0l23456789103371114182227313640481318243036435160691118273852709212016123023034深層分析（二）水源水 器材與試劑 1m

13、l吸管3支/組，10ml吸管1支/組，10ml普通發(fā)酵管（內(nèi)有導管）3支/組，5ml三倍發(fā)酵管（內(nèi)有導管）1支/組。emb，革蘭染液等。35深層分析方法稀釋水樣：水樣做1:10及1:100稀釋。方法同菌落總數(shù)測定。初發(fā)酵試驗：接種水樣總量11.11ml， 4支發(fā)酵管。取10ml原水樣注入5ml三倍乳糖發(fā)酵管（內(nèi)有導管）；取1ml原水樣、1ml 1:10及1:100稀釋水樣分別注入10ml普通乳糖發(fā)酵管（內(nèi)有導管），37培養(yǎng)24h。平板分離與復發(fā)酵試驗：同生活飲用水。36深層分析結(jié)果分析與報告根據(jù)證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)，查接種水樣總量為11.11ml檢數(shù)表（表4），報告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。37深層分析表4 大腸菌群數(shù)檢數(shù)表接種水樣總量11.11ml（10ml、1ml 、0.1ml、0.01ml 各1份）接種水樣總量接種水樣總量( (ml)每升水樣中大腸每升水樣中大腸菌群數(shù)菌群數(shù)10 110 10.1 0.010.1 0.01 地地 38深層分析注意事項總大腸菌群的測定方法，由于飲用水和水源水可能的污染程度不同，因些采用不同的接種量，檢數(shù)