翻譯-Gradient_overview_with_notes

1、LC故障排除系列終版梯度洗脫分析概述9/21/2010 劇本文稿邊欄附注前言Michael Woodman：嗨，大家好！我是 Mike Woodman，是安捷倫公司的一名應(yīng)用專家。今天和我在一起的是安捷倫在線技術(shù)支持團(tuán)隊部的Rita Steed，你們中的一些人可能在過去曾經(jīng)和他通過電話。Rita：嗨，大家好！這真是可能的! 我們接到過來自不同地區(qū)的許多求助電話。Michael：在本次討論中，我們將關(guān)注梯度洗脫以及如何建立梯度分析方法如何建立的問題，并且討論梯度分析中易犯的常見錯誤以及如何處理它們。首先，我們來重溫一下梯度方程，這樣就能理解當(dāng)進(jìn)行梯度分析時，我們?nèi)绾稳フ{(diào)整方法的變量。然后，我們來

2、討論流動相改性劑，以及它們是如何引起基線問題的。最后， 我們將討論延遲體積的重要性，以及如何解決它們，以避免梯度分析方法在不同系統(tǒng)之間轉(zhuǎn)移應(yīng)用時組分的保留時間發(fā)生變化。Mike Woodman 是一名應(yīng)用化學(xué)家，致力于安捷倫儀器應(yīng)用的研究。Rita Steed就職于安捷倫HPLC色譜柱技術(shù)支持部。 為什么使用梯度洗脫？Rita： 那么人們?yōu)槭裁词褂锰荻认疵撃?？這是由于當(dāng)前隨著色譜分析變得愈加復(fù)雜，因此人們越來越多地使用梯度洗脫。 當(dāng)在組合化學(xué)或雜質(zhì)分析中需要分離一些未知化合物如組合化學(xué)產(chǎn)物或產(chǎn)品雜質(zhì)需要分離時，梯度洗脫就非常有用。梯度洗脫也有助于分離極性差異大的化合物，或者高分子量化合物，如肽

3、類和蛋白質(zhì)類。在梯度洗脫中，流出各峰的寬度基本上是相同的，不像等度洗脫時，某組分在色譜柱中停留的時間越長，色譜峰就越寬。梯度洗脫還有其它的優(yōu)點(diǎn)，包括由于梯度壓縮效應(yīng)使峰形更尖銳，并且由于梯度洗脫中色譜柱不斷被逐漸提高強(qiáng)度的溶劑沖洗，從而最大程度地減少了污染積聚。梯度洗脫分析可用于： · 分離一些未知化合物· 組合化學(xué)研究· 雜質(zhì)分析· 分離極性差異大的化合物，或者高分子量化合物，如肽類和蛋白質(zhì)類。梯度方程Rita：我們一起來看一下梯度方程，并去理解梯度方程是如何使用的。show gradient_equation.gif這個梯度方程乍看起來有些令人生畏，

4、但如果您進(jìn)一步再對它稍作了解，您就會看到事情并非想象的那樣。它涉及了影響您分析的關(guān)鍵變量，如果您不理解這些變量，也許會給您的色譜分析帶來問題。請看這是point as discussed流速、梯度程序時間、梯度范圍和柱體積。謹(jǐn)記分母如果發(fā)生變化，分子就一定要做出相應(yīng)改變來補(bǔ)償，反之亦然，這一點(diǎn)非常重要。增大保留因子k（或k*，梯度洗脫中）是一個簡單的提高分離度的方法。當(dāng)然不過，這會以更長的運(yùn)行時間為代價。此外，還會導(dǎo)致峰寬增加，峰高降低，這可能會從而使使定量分析變得更加困難。Mike：目前，改變色譜柱的尺寸非常普遍，更短或者內(nèi)徑更窄。因此，柱體積的任何減小，都需要通過成比例減小梯度程序時間或增

5、大流速來補(bǔ)償。Rita：當(dāng)我們轉(zhuǎn)換應(yīng)用方法到不同尺寸的色譜柱上時，一個可以幫助我們的極好途徑就是使用安捷倫方法轉(zhuǎn)換器軟件。 它能幫您確定您是否已經(jīng)調(diào)整好了所有相關(guān)的方法參數(shù)。您可以登陸，通過搜索找到方法轉(zhuǎn)換器。它有幾個版本， 包括在Agilent 1290 Infinity LC上適用的一款。 show search and bring up Method Translator on screenDemonstrate on screen比方說，您正在使用經(jīng)典的4.6 x 250 mm，5 µm色譜柱。 您可以看到您在轉(zhuǎn)換器中有兩種選擇：基本模式和高級模式。在本例中我們選擇基本模式。

6、基本模式假定設(shè)定為您正在使用的是一臺常規(guī)HPLC儀。在色譜柱部分，我們輸入色譜柱的規(guī)格為內(nèi)徑4.6 mm、長度250 mm、粒徑5 µm。在方法部分，我們需要輸入溫度信息，可這里設(shè)為30 ，流動相設(shè)為水/甲醇。注意當(dāng)我們?nèi)缟喜僮鲿r，最大黏度值發(fā)生了變化。為了了解那個數(shù)值是從哪里來的，讓我們?nèi)タ匆幌吗ざ缺?。您可以看到我們有一張關(guān)于水/乙腈和水/甲醇的表，以及一張其它相關(guān)HPLC溶劑黏度的信息表。由于我們的梯度分析系在30 時使用甲醇/水作流動相，因此我們需要查看30時流動相的黏度。我們看到這個條件下該流動相的 最大黏度是1.47，這也是我們使用的轉(zhuǎn)換器的默認(rèn)值。接下來我們輸入流速、進(jìn)樣

7、體積及梯度程序條件。為簡單起見，我們將保持所有我們看到這里默認(rèn)的條件不變。現(xiàn)在讓我們轉(zhuǎn)移到設(shè)定一個新的方法上。在基本模式下，默認(rèn)的儀器是1200 RRLC系統(tǒng)。如果您使用的是高級模式，您可以設(shè)定系統(tǒng)信息以適應(yīng)您使用的儀器。輸入我們使用的新色譜柱的規(guī)格2.1 x 50 mm，1.8 µm。由于改變了色譜柱內(nèi)徑，我們可以看到轉(zhuǎn)換器已經(jīng)成比例地調(diào)整了流速。雖然進(jìn)樣體積不是梯度方程中的變量，但考慮到原色譜柱與新色譜柱柱體積的差異，軟件也會成比例調(diào)整進(jìn)樣體積。注意由于我們改變了柱長，因此也要注意梯度程序時間的也發(fā)生了變化。在本例中，我們做了簡單的轉(zhuǎn)換，但是同樣方法您同時還可以優(yōu)化出峰速度或分離

8、度。高級模式中的其它功能還有待您去探索。Mike：使用同一根色譜柱時，如果梯度程序組成流動相配比范圍中有任何變化，若要保持相同的梯度陡度斜率和k*值，就需要相應(yīng)調(diào)整梯度時間或流速。對于梯度洗脫分析，影響方法耐用性的兩個重要變量是延遲體積和梯度陡度。我們將首先討論梯度陡度。show gradient_steepness.gif理解梯度方程是非常重要的。分母要相應(yīng)改變（梯度范圍、柱體積等）去抵消分子的變化（梯度時間、流速），反之亦然。請登陸A搜索LC方法轉(zhuǎn)換器。它是一個很好的幫助您妥善進(jìn)行方法調(diào)整的工具。梯度陡度Rita：我們再看一下梯度方程洗脫的保留因素值方程，以及它與梯度陡度的關(guān)系。您可以認(rèn)為

9、梯度陡度b就是等度分離中有機(jī)溶劑的百分含量。當(dāng)梯度陡度減小時，保留時間增大；當(dāng)梯度陡度增大時，保留時間減小。并且梯度陡度減小時，峰寬增加，峰高降低。關(guān)于梯度陡度請謹(jǐn)記以下事項(xiàng)：· 只要b保持不變，您就可以看到色譜峰會以相同的相關(guān)模式相對格局被洗脫出來。· 減小梯度陡度，并不意味著一定會得到更理想的保留時間和分離度。換句話說，對于不同的分析物而言，改變有機(jī)溶劑一定的百分比，所有分析物的保留時間可能并不會均產(chǎn)生相同比例的保留時間變化。不同的分析物有特定的S值，該值反映了某該分子對流動相中有機(jī)溶劑百分含量的敏感度。insert molecular_vs.jpg· 對于大

10、多數(shù)小分子（<幾百Da），S值約為4-5，這對它們的敏感度不會有什么太大影響。但肽類和蛋白質(zhì)類的S值相對大的多，且彼此之間的差異可能會超過2-3個數(shù)量級。· 這就是為什么分離肽類和蛋白質(zhì)類時必須選用梯度分離，并且較小的梯度陡度變化就會引起其保留時間較大變化的原因。為了說明方程中的這些觀念概念是如何在您的色譜分析中得以體現(xiàn)的，讓我們一起來看幾個例子。insert gradient_time_example.gif這里，我們將梯度程序時間從10 分鐘增加到60 分鐘，但保持其它梯度參數(shù)不變。如從方程上看得到的一樣，我們希望獲得到了增大的梯度保留時間，并會且顯著地全面改善了梯度分辨率

11、。較長的梯度程序時間會導(dǎo)致較緩的梯度陡度，并且通過減小梯度陡度，我們可將色譜峰1和2、6和7分開indicate。 在下一個實(shí)例中，讓我們一起來看一下梯度陡度與柱長的關(guān)系。insert gradient _steepness _example.gif每張色譜圖的梯度陡度是相同的，即組分均保持了相同的洗脫模式，然而分析時間卻從24 分鐘減少到12 分鐘。在左邊的色譜圖中，在梯度程序時間30 min、流速1.0 mL/min的條件下，我們的樣品在4.6 x 150 mm，5 µm色譜柱上得到了良好的分離。當(dāng)我們將柱長減小到75 mm時， 分析時間會顯著縮短，此時柱體積減小了一半，分析時間

12、也相應(yīng)縮短了一半。梯度陡度沒有改變，但分析時間卻縮短了50%。同時減少了溶劑消耗，同時也獲得了較短的色譜柱再平衡時間（譯者注：此部分內(nèi)容是否應(yīng)該補(bǔ)充柱長改變后其它參數(shù)的相應(yīng)調(diào)整，使該結(jié)論與其它視頻相關(guān)內(nèi)容的說明一致。請核對。）。 Mike： 好！我想我們對如何在實(shí)際分析中應(yīng)用梯度方程已有了一個很好的感覺理解。你還聽說過什么其它的常見問題嗎？梯度陡度類似于等度分離中有機(jī)溶劑的百分比。當(dāng)梯度陡度減小時，保留時間增大；當(dāng)梯度陡度增大時，保留時間減小。請謹(jǐn)記以下要點(diǎn)：- 只要b保持不變，色譜峰就會以相同的相對格局相關(guān)模式被洗脫出來。- 減小梯度陡度，并不意味著就一定會得到更理想的保留時間和分離度。分析

13、結(jié)果是否滿意取決于您的分析物。流動相改性劑與基線漂移Rita：我們經(jīng)常會接到正在一些運(yùn)行梯度分析的分析員打來的有關(guān)基線漂移問題的求助電話。 運(yùn)行梯度程序時，基線漂移是很常見的現(xiàn)象。這是由于在梯度條件下，開始和結(jié)束時的梯度條件下流動相的紫外吸收不一致造成的。我們可能第一個要問求助者的問題是所用流動相里含有什么？Mike：這個表格中展示了許多常見流動相成分的紫外吸收截止波長。我們相關(guān)的視頻記錄中有這張表，您登陸安捷倫的官方網(wǎng)頁 搜索“Gradient Video Notes（梯度洗脫視頻記錄）”即可查到。 insert table.jpg人們之所以喜歡選擇使用乙腈的原因之一是乙腈的紫外吸收截止波長

14、低（190 nm），而甲醇的為205 nm，THF的為212 nm。THF在215 nm處有那么高的紫外吸收，因此它很難用于梯度分析。并且依據(jù)您的梯度范圍，THF的吸收度可能會高達(dá)2 Aus。而在較長的吸收波長如254 nm處，您將可能就不會遇到存在同樣這樣的問題。因此在梯度洗脫分析中我們不但首先要考慮溶劑選擇，接著還要進(jìn)一步考慮所將使用的改性劑。1% 醋酸溶液的紫外吸收截止波長為230 nm，0.1%TFA溶液的紫外吸收截止波長為205 nm?；仡欉^去曾經(jīng)，我個人喜歡使用磷酸鹽緩沖液和稀磷酸。無論酸性還是中性pH值下，它們都具有絕對完美的紫外透光度。Rita：但是Mike，你不能每次都享受享

15、用到磷酸鹽的好處，有時也會遇到它不利的一面。磷酸鹽存在溶解度問題且不易揮發(fā)，在進(jìn)行質(zhì)譜分析時，磷酸鹽會失寵于許多人就不再選用磷酸鹽。Mike：是的，因此如果您使用有機(jī)溶劑的濃度大于80%，應(yīng)避免使用濃度大于10 mM的磷酸鹽緩沖液。并且就對于會導(dǎo)致磷酸鹽沉淀來說，乙腈比甲醇更嚴(yán)重。Rita：還有當(dāng)你試圖簡化操作而僅在流動相的水溶液部分加入改性劑時，你常會看到基線漂移。在醋酸銨和甲醇作流動相的情況下，在215 nm波長處，醋酸銨的背景吸收遠(yuǎn)大于甲醇，在梯度分析運(yùn)行中這將會引起基線顯著的負(fù)漂移。負(fù)漂移對于大多數(shù)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)而言尤其是一個嚴(yán)重的問題。為了抵消這種負(fù)漂移，您可以在流動相B中加入適量有紫

16、外吸收的化合物。理想情況下，流動相A和流動相B中的緩沖鹽或改性劑的濃度應(yīng)該相同。換句話說，在梯度洗脫中，當(dāng)僅有有機(jī)溶劑濃度改變時即可才能獲得最理想的色譜分析結(jié)果。當(dāng)然也會有例外。對于一些流動相改性劑，它們在水中和乙腈中的吸收度不同，這可能會在梯度形成后導(dǎo)致基線漂移。TFA就是這樣那樣一個例子，我們導(dǎo)致一些常見到的問題的例子。當(dāng)我們使用TFA時，嘗試使它在溶劑A中的濃度使用為0.1%時 ，在溶劑B中即的濃度約為0.09% 。 現(xiàn)在我們一起來看一張色譜圖，說明一下這個問題。insert effect _of_ tfa.gif在這個梯度洗脫分析中，流動相A和B中含TFA均為0.1% ，在215 nm

17、波長下檢測時，基線向上發(fā)生漂移。如果我們將流動相B中TFA的濃度調(diào)整為0.09%這一較低的值時，就可以拉平基線，從而解決這個問題。使用更長的波長檢測，如254 nm，也可以解決這個問題，但并非任何情況下都適用。這是我們所希望看到的梯度分析的結(jié)果insert gradient_sep_of _pep -tides.gif這顯示了典型的梯度洗脫不同分子量大小的多肽類/蛋白質(zhì)類組分的狀況。流動相A中含0.1% 的TFA，流動相B中含0.085%的 TFA。其結(jié)果是基線水平，不僅看起來更好，且更有助于數(shù)據(jù)積分。 當(dāng)然，您將常會碰到基線漂移很小而影響不大的情況，尤其是如果此時當(dāng)您的色譜峰大小不變并且可以

18、準(zhǔn)確積分的話，那就沒有什么關(guān)系。Mike：好?，F(xiàn)在讓我們一起來談?wù)勓舆t體積吧的問題。 Rita：聽起來很不錯?；€漂移是梯度洗脫中常見的問題。它通常與流動相及其紫外吸收有關(guān)。在許多應(yīng)用中，理想的情況是流動相A和B中緩沖鹽或改性劑的濃度相同。當(dāng)使用TFA時，嘗試溶劑A中用0.1% 的TFA，溶劑B中用約0.09%的 TFA。滯后延遲體積Mike：那么，什么是延遲體積呢？ 對于高壓混合系統(tǒng)，延遲體積等于從溶劑在兩個計量泵后相遇混合點(diǎn)到柱頭流經(jīng)的所有體積之和。對于低壓混合系統(tǒng)，show dwell volum -e .gif延遲體積等于從比例閥經(jīng)過泵到柱頭流經(jīng)的所有體積之和。對于梯度分離，延遲體積實(shí)

19、際上使梯度開始時進(jìn)行了一段時間的等度洗脫，這個時間等于延遲體積除以流速。過大的延遲體積會使一些儀器不能使用窄徑色譜柱進(jìn)行梯度分離。較大的延遲體積不會影響等度分離，除了改變流動相時，平衡色譜柱需花費(fèi)更長的時間。當(dāng)使用窄徑色譜柱時，儀器配置是至關(guān)重要的。使用窄徑（2.1 mm ID）和微徑（1 mm， 和<1 mm ID）色譜柱進(jìn)行梯度洗脫分析條件優(yōu)化時，為了得到最佳的結(jié)果，必須將延遲體積和柱外體積最小化。Rita：因此即使是很小延遲體積的差異都可以改變分離度。Mike：是的, 它們當(dāng)然會。在這張幻燈片show gradient_ example1中，我們可以看到分離一個復(fù)雜混合物的模擬梯度

20、分析色譜圖。上圖是LC分離中實(shí)際數(shù)據(jù)的模擬。將色譜峰的保留時間輸入DryLab軟件，儀器實(shí)際的延遲體積為0.43 mL。分析使用配有二元泵的Agilent 1100 LC系統(tǒng)，未啟用混合器。下圖系使用延遲體積為2.0 mL的儀器代替延遲體積為0.43 mL的儀器進(jìn)行相同分離后的模擬色譜圖。您可以看到在某儀器上兩個本可以完全分離的色譜峰，在有較大延遲體積的儀器上卻會共一起流出。point to second lower hyphenated peak在梯度分離中，不同的延遲體積會改變峰寬和相對保留時間。建立梯度洗脫方法時，測試不同延遲體積對分析結(jié)果的影響是非常明智的！一些儀器調(diào)整延遲體積時具有很

21、大的靈活性。我們有時使用這樣的系統(tǒng)去模擬各種不同的HPLC配置，因?yàn)長C主要的區(qū)別之一就是延遲體積的不同。insert dwell volume_ compare iso n.gif現(xiàn)在您可以看到在同一個系統(tǒng)上，同一個樣品的四張不同的梯度分析譜圖。它們的梯度時間程序是相同的，但儀器可以經(jīng)過重新配置以實(shí)現(xiàn)了設(shè)定更寬范圍的延遲體積。我們可以看到，在這些特殊設(shè)置的色譜條件下，在最大的和最小的延遲體積時均出現(xiàn)了分辨率問題。這表明最初的方法開發(fā)應(yīng)在中等延遲體積條件的儀器上進(jìn)行。為使此方法可在四種配置的儀器上均正常運(yùn)行，我們需要調(diào)整梯度程序并再次運(yùn)行測試。 延遲體積等于從溶劑在兩個計量泵后相遇混合點(diǎn)到柱頭

22、流經(jīng)的所有體積之和。 對于低壓混合系統(tǒng)，延遲體積等于從比例閥經(jīng)過泵到柱頭流經(jīng)的所有體積之和。延遲體積實(shí)際上使梯度開始時運(yùn)行了一段時間的等度洗脫，這個時間等于延遲體積除以流速。在梯度分離中，延遲體積的差異會改變峰寬和相對保留時間。延遲體積對方法耐用性的影響梯度分離 讓我們一起來看一個關(guān)于延遲體積的LC故障排除的實(shí)例。請看這張色譜對比圖 。insert dwell_volume _comparison2.jpg注意早期流出的峰較寬。這是由于延遲體積造成早期的峰實(shí)際流出較晚實(shí)質(zhì)上它們是以等度洗脫的方式流出的。如果這干擾了分離或檢測的結(jié)果，我們需要減小延遲體積或?qū)⒋藨?yīng)用移至另一個系統(tǒng)。當(dāng)建立梯度分離方

23、法時，重要的是您首先要測量并記錄您所使用儀器的延遲體積。了解當(dāng)將梯度方法轉(zhuǎn)移到其它儀器和實(shí)驗(yàn)室時，明確延遲體積的差異是很重要的。我們在視頻記錄中提供了儀器延遲體積的直接測量方法，您可以登陸安捷倫網(wǎng)站搜索“Gradient Video Notes（梯度洗脫視頻記錄）”或在視頻播放器中點(diǎn)擊“get notes（獲得記錄）”按鈕找到它。這里還有幾種測量延遲體積的方法供您選用?，F(xiàn)在我將為您演示其中的一種。demo首先，準(zhǔn)備一張整版橫向輸出打印有梯度步驟變化曲線的紙，或者像我們這里所做的，將圖像復(fù)制粘貼到Powerpoint（幻燈片）中。insert calculate1. gif back to Mi

24、ke, with ruler and printout使用尺子在紙上或在Powerpoint（幻燈片） 中插入線段，在如下位置處繪制與x或y軸平行的線：1. 0%B區(qū)域信號為零處2. 100%B區(qū)域最大穩(wěn)定信號處3. 在2.0 min處繪制一條垂直線您得到的圖像看起來像這張圖片 insert calculate2.gif三條線繪制完畢后，再繪制另外兩條線：4. 計算這一步50%處的響應(yīng)值 ，在本例中應(yīng)為24.5 mAU，在該位置繪制一條穿過圖形的水平線5. 在50%響應(yīng)值與實(shí)際的檢測信號的交點(diǎn)處繪制一條垂直線您得到的新圖應(yīng)該像下面的這張幻燈片中所示。 insert calulate3.gifs

25、how on printout, pointing, as describing 測定沿x軸方向，至50%B垂直線交點(diǎn)的時間，應(yīng)盡可能接近該點(diǎn)的精確，在該時間點(diǎn)處得到50%響應(yīng)值即實(shí)測值。在延遲體積的估算中，0.1 min的誤差將會導(dǎo)致50 µL的誤差。在本例中，我們估算50%的時間為4.04 min。關(guān)于延遲體積的計算，一個簡單的公式是 時間 (50%響應(yīng)值處) 時間(步長) x 流速 = 延遲體積那么在本例中的延遲體積就應(yīng)為(4.04-2.00) min x 500 µL/min = 1020 µL。該測定在Agilent 1200 RRLC系統(tǒng)（1200SL

26、）上運(yùn)行，表觀背壓340 bar，通過一個額定的100 cm，0.062 mm (0.0025英寸) i.d. PEEK限流器。用水做特定的溶劑在液流輸運(yùn)過程中進(jìn)行可壓縮性補(bǔ)償。這個系統(tǒng)的正常流路中包括了標(biāo)準(zhǔn)混合器、脈沖阻尼器和一個正常流路中運(yùn)行的自動進(jìn)樣器（與旁路模式相比對照），與以及上面提到的限流器相連，并配備有3 mm 2 µL的流通池。Rita：為了探查考察延遲體積對梯度分離的影響，您必須在梯度運(yùn)行開始時，增加或減少等度洗脫的時間。如要在較小延遲體積的系統(tǒng)上模擬較大的延遲體積，您可在梯度程序開始時設(shè)置一個保持時間，這個時間等于這兩個延遲體積的差值（mL）除以流速（mL/min

27、）。模擬比您當(dāng)前的儀器小的延遲體積時，您必須調(diào)整進(jìn)樣器程序，延遲進(jìn)樣時間，延遲的時間等于滯后時間。有些儀器有這個功能，有些儀器沒有。最后，在您編寫的方法中，記錄下方法建立時儀器的延遲體積及其對分離的任何影響是非常重要的。 了解當(dāng)將梯度方法轉(zhuǎn)移到其它儀器和實(shí)驗(yàn)室時，明確延遲體積的差異是很重要的。自動進(jìn)樣器程序輔助梯度洗脫優(yōu)化Mike：延遲體積同樣也包括進(jìn)樣器體積，所以減小進(jìn)樣器內(nèi)體積及其周圍連接管路的體積是很重要的。大多數(shù)Agilent自動進(jìn)樣器提供旁路運(yùn)行模式的選項(xiàng)，樣品從樣品環(huán)中被沖出后，進(jìn)樣器再轉(zhuǎn)回到載樣位置demo。依據(jù)您現(xiàn)在使用的自動進(jìn)樣器類型，系統(tǒng)體積最多可減少300 µL。一個標(biāo)準(zhǔn)的Agilent儀器原始的延遲體積約為1100 µL，通