hmgb1對(duì)肝星狀細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響

1、                       作者：韓紅莉 楊柳絮 吳紅樣 趙中夫【摘要】  目的：探討高遷移率族蛋白b1（hmgb1）對(duì)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell hsc)合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ecm)的影響。方法：劑量效應(yīng)組分別用含hmgb1 0 mg/l,0.1 mg/l,1.0 mg/l,10 m

2、g/l，20 mg/l和40 mg/l的hmgb1培養(yǎng)液培養(yǎng)hsc-t6 6 h；時(shí)間效應(yīng)組以含有10 mg/l hmgb1的培養(yǎng)液培養(yǎng)0 h、6 h、12 h、18 h和24 h,對(duì)照組以不含hmgb1的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)hsc-t6細(xì)胞，留取各組培養(yǎng)液離心后的上清，用雙抗體夾心elisa方法檢測(cè)其上清中p?p和c?的含量。結(jié)果：對(duì)照組hsc-t6細(xì)胞ecm分泌量較低；hsc-t6的ecm分泌量與hmgb1呈劑量依賴關(guān)系(r=0.835,0.955，p<0.05)；10 mg/l hmgb1時(shí)間效應(yīng)組的p?p,c?分泌量在18 h和24 h 均明顯高于對(duì)照組（p<0.05）。結(jié)論：h

3、mgb1能誘導(dǎo)hsc-t6細(xì)胞分泌ecm，可能在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 【關(guān)鍵詞】  hmgb1；hsc-t6；細(xì)胞外基質(zhì)；肝纖維化     abstract  objective:to investigate the effect of human high mobility group box1 protein(hmgb1)on the extracellular matrix secretion of rat hepatic stellate cell and explore the function of hmgb1 in

4、 the occurrence and development of hepatic fibrosis.methods:the effects of various doses of hmgb1 on the ecm secretion of the hsc-t6 cells:cells were divided into six groups(0 mg/l,0.1 mg/l,1.0 mg/l,10 mg/l,20 mg/l,40 mg/l),each group cells were stimulated by different concentrations of hmgb1 for 6h

5、;the relationship stimulated time of hmgb1 and secretion of ecm in hsc-t6 cells:cells were divided into control group and stimulated groups (0 h,6 h,12 h,18 h,24 h,hmgb1 10 mg/l).the p?p and c? of culture supernatant were detected by elisa method.results:the secretion of ecm in the control groups wa

6、s low, but it was obviously increased in the stimulated groups. and it was increased as time went on (0 h-24 h) and the secretion of ecm in stimulated groups were obviously higher than in control groups at 18 h,24 h(p<0.05).there was significantly dose-dependent relationship in 0.1 mg/l-10 mg/l s

7、cope(r=0.835,0.955，p<0.05).conclusion:the secretion of ecm in hsc-t6 cell was induced by hmgb1 which could play an important role in the development of hepatic fibrosis.     key words  hmgb1;hsc-t6;ecm;hepatic fibrosis    目前認(rèn)為，hsc的激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，hsc激活的始動(dòng)因素是肝損傷和炎癥反應(yīng)

8、，而hsc激活的過(guò)程包括早期啟動(dòng)激活和后期“持久化”激活，激活的“持久化”是維持hsc激活狀態(tài)及產(chǎn)生ecm的必要條件。多種急性肝損傷因素雖能引發(fā)早期啟動(dòng)激活，但因?yàn)槿狈Α俺志没奔せ钜蛩?，所以不?huì)導(dǎo)致肝纖維化或肝硬化的發(fā)生（如hav/hbv引起的急性肝炎），而各種慢性感染或慢性炎癥反應(yīng)能持續(xù)激活hsc （如     hcv/hbv引起的慢性肝炎），因此，慢性炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在是hsc激活“持久化”的基礎(chǔ)。近年來(lái)，隨著對(duì)炎癥反應(yīng)認(rèn)識(shí)的深入，人們發(fā)現(xiàn)了一種有效的炎癥介質(zhì)hmgb1,它具有較其他細(xì)胞因子釋放晚和作用時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)。那么hmgb1是否對(duì)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展發(fā)

9、揮重要作用呢？我們課題組的先前研究表明在肝纖維大鼠的肝組織中hmgb1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，但hmgb1是否通過(guò)激活hsc參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展目前尚不清楚，本研究擬通過(guò)hmgb1刺激hsc以觀察ecm的合成情況來(lái)進(jìn)一步探討hmgb1與肝纖維化的關(guān)系。     1  材料與方法     1.1  主要試劑     hmgb1由本室制備保存；新生胎牛血清（fcs）為杭州四季青生物工程材料研究所產(chǎn)品；高糖型dmem購(gòu)自英國(guó)gibco公司；大鼠p?p ，c?雙抗體夾心elisa檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海晶

10、天生物科技有限公司（進(jìn)口分裝）；hsc-t6細(xì)胞株由北京地壇醫(yī)院肝病研究所惠贈(zèng)。     1.2  實(shí)驗(yàn)分組及處理     大鼠hsc-t6細(xì)胞系在含10%的胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代4次至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105密度接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔1 ml,細(xì)胞貼壁后改用2%的胎牛血清的dmem培養(yǎng)液同步饑餓培養(yǎng)2 h,使培養(yǎng)細(xì)胞處于g0期后做下面實(shí)驗(yàn)：     1.2.1.  hmgb1的劑量效應(yīng)組：分別用含有0 mg/l、0.1 mg/l、1.0 mg/l、1

11、0 mg/l 、20 mg/l和40 mg/l的hmgb1培養(yǎng)液培養(yǎng)hsc-t6，6 h后,收集hmgb1刺激孔及對(duì)照孔培養(yǎng)上清液，用雙抗體夾心elisa法測(cè)hsc-t6培養(yǎng)上清液中p?p，c?的含量。以上每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。     1.2.2.  hmgb1的時(shí)間效應(yīng)組：刺激組（10 mg/l hmgb1）和正常對(duì)照組（等量的pbs）分別用含10 mg/l hmgb1和等量的pbs的dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)hsc-t6細(xì)胞0 h、6 h、12 h、18 h和24 h,同上收集培養(yǎng)上清液 用雙抗體夾心elisa 方法測(cè)hsc-t

12、6培養(yǎng)上清液中p?p ，c?的含量。以上每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。     1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法     采用spss12.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行spearman相關(guān)分析，單因素anova(方差分析)，兩樣本比較采用lsd-t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(x±s)表示,p0.05判定有顯著性差異。    2  結(jié)果     2.1.  hmgb1對(duì) hsc-t6分泌p?p、c?的劑量效應(yīng)     h

13、mgb1能促進(jìn)hsc-t6分泌p?p、c?，在一定濃度范圍內(nèi)（0.1 mg/l10mg/l）呈劑量依賴關(guān)系（r=0.835，0.955，p<0.05），當(dāng)hmgb1濃度為10 mg/l時(shí)，hmgb1顯著促進(jìn)hsc-t6分泌p?p、c?并達(dá)峰值，當(dāng)hmgb1濃度為20 mg/l時(shí)，hsc-t6 p?p、c?的分泌量與10 mg/l時(shí)相當(dāng)，hmgb1濃度為40 mg/l時(shí)分泌量下降。（見(jiàn)表1)表1  不同劑量的hmgb1對(duì)hsc分泌ecm的影響2.2.  hmgb1對(duì)hsc-t6分泌p?p,c?的時(shí)間效應(yīng)     刺激組hsc-t6分泌p?p

14、、c?在0 h24 h間呈遞增趨勢(shì),隨著時(shí)間的延長(zhǎng)增加,呈時(shí)間依賴關(guān)系(r=0.970，0.982，p<0.05)，正常對(duì)照組上清液p?p、c?含量變化趨勢(shì)與hmgb1刺激組一致。在6 h和12 h兩組上清液p?p、c?的含量無(wú)顯著差異（p>0.05），但在18 h、24 h刺激組上清液p?p,c?含量明顯高于正常對(duì)照組（p<0.05）(見(jiàn)圖1,圖2)。     3  討論       目前認(rèn)為hsc在肝纖維化的進(jìn)程中起重要的作用,在慢性損傷因素的持續(xù)作用下,肝臟內(nèi)大量的細(xì)胞因子分泌，其中最主要的

15、有tgf-、pdgf等，可以使靜止的hsc活化、增殖，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)沉積于肝組織,由于其在肝纖維化中的特殊性地位。因此，體外培養(yǎng)hsc常作為肝硬化基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)治療研究的重要手段11 。一般認(rèn)為，原代培養(yǎng)的hsc適用于研究相對(duì)靜止的hsc生物學(xué)行為,而傳代培養(yǎng)的hsc適用于研究活化的hsc生物學(xué)行為,本實(shí)驗(yàn)研究hsc的激活機(jī)制適宜選擇靜止?fàn)顟B(tài)的hsc，但原代hsc僅占肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)的5%10%，不管采用何種分離技術(shù)，最終得率很低。此外，原代培養(yǎng)的hsc細(xì)胞不甚穩(wěn)定，細(xì)胞分離狀況及培養(yǎng)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大，為克服上述缺陷，目前逐漸傾向以hsc系代替原代hsc作為研究的靶細(xì)胞，并

16、已建立若干hsc系。本研究采用的hsc-t6細(xì)胞系是由大鼠肝星狀細(xì)胞經(jīng)過(guò)sv40病毒轉(zhuǎn)染后形成的永生細(xì)胞系,具有無(wú)限傳代的特性，是肝纖維化研究的良好模型。ecm過(guò)度沉積是肝纖維化形成中關(guān)鍵的一步，ecm主要包括:(1)膠原:?型,?型, ?型、?型。(2)蛋白多糖:硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸等。(3)糖蛋白:層粘連蛋白、纖維連接蛋白、副層粘連蛋白、副纖維連接蛋白、粗纖維調(diào)節(jié)素。纖維化的肝臟含6倍于正常肝臟的膠原，其中?,?和?型膠原的含量顯著增高。因此，檢測(cè)ecm成分的含量常作為肝纖維化的輔助診斷手段13，目前認(rèn)為p?p，c?,層粘連蛋白及透明質(zhì)酸是最具代表性的肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)，因此在

17、實(shí)驗(yàn)中我們采用體外培養(yǎng)的hsc作為研究的靶細(xì)胞,用elisa方法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清液中p?p，c?的含量。本實(shí)驗(yàn)所用的hsc是經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)的活化細(xì)胞有一定水平的ecm表達(dá)，因此通過(guò)在此基礎(chǔ)上采用hmgb1作用于hsc作為刺激組，并設(shè)立相應(yīng)的對(duì)照組觀察ecm量的變化來(lái)說(shuō)明問(wèn)題。我們研究證實(shí)隨著hmgb1濃度的增加其促進(jìn)hsc分泌ecm能力也相應(yīng)增加，正常培養(yǎng)的hsc-t6細(xì)胞ecm分泌量較低,而經(jīng)hmgb1刺激后hsc能分泌大量的p?p,c?。在0.1 mg/l10 mg/l范圍內(nèi), hmgb1誘導(dǎo)hsc-t6分泌p?p,c?的量與hmgb1的濃度呈顯著的劑量依賴性關(guān)系；hsc-t6 ecm的分泌

18、與時(shí)間關(guān)系顯示：hmgb1刺激組與無(wú)hmgb1刺激的對(duì)照組hsc-t6分泌ecm的量在0 h24 h之間呈時(shí)間依賴性關(guān)系。但對(duì)照組與刺激組相比,各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ecm的分泌量低于刺激組，在18 h、24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著差異。上述研究結(jié)果進(jìn)一步表明，即使傳代培養(yǎng)的hsc作為具有活化生物學(xué)行為細(xì)胞，但在體外失去hmgb1刺激后，其分泌ecm的作用也逐漸減低。因此，hmgb1在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  friedman sl, molecular mechanism of hepatic fibrosis and principles of therapy.

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