動物細(xì)胞培養(yǎng)的準(zhǔn)備PPT課件

1、 玻璃器皿 金屬器械 橡膠 塑料制品 第1頁/共90頁玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 浸泡（自來水） 刷洗（洗衣粉） 酸泡（2424小時） 自來水沖洗蒸溜水浸泡和沖洗 50 50烘干 橡膠、塑料制品的清洗橡膠、塑料制品的清洗 清水清洗浸于自來水過夜用紗布或棉簽和5050稀洗液刷洗流水沖洗（15152020遍） 晾干浸于清潔液1515分鐘流水沖洗（15152020遍） 蒸餾水浸洗三次，三蒸水泡2424小時晾干或5050烘干備用。第2頁/共90頁 金屬器械的清洗金屬器械的清洗 放到含洗滌劑的水中反復(fù)刷洗后自來水反復(fù)沖洗干凈晾干用7575酒精擦拭自來水反復(fù)沖洗干凈最后三蒸水浸洗3 3次，晾干或5050

2、烘干備用。 正壓除菌濾器的清洗正壓除菌濾器的清洗 含稀洗滌劑的水中，反復(fù)刷洗后流水沖洗15min 15min 漓水蒸餾水浸泡24h 24h 三蒸水浸泡24h 24h 晾干或5050烘干備用。第3頁/共90頁 塑料器材塑料器材 常用的塑料器材有多孔培養(yǎng)板（常用的塑料器材有多孔培養(yǎng)板（4孔、孔、6孔、孔、12孔、孔、24孔、孔、96孔）、培養(yǎng)孔）、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及吸頭。皿、培養(yǎng)瓶及吸頭。 重復(fù)使用的處理步驟：重復(fù)使用的處理步驟： 自來水刷洗自來水刷洗 3HCl或或2NaOH溶液浸泡溶液浸泡過夜過夜 自來水充分沖洗自來水充分沖洗 雙蒸水沖洗雙蒸水沖洗3次次 紫外線直接照射或輻照滅菌紫外線直接照射或輻

3、照滅菌第4頁/共90頁 清洗時應(yīng)注意： 浸泡、煮沸、酸泡的器皿內(nèi)要充滿液體，不得有氣泡。 沖洗時要流水振蕩沖洗，方法是：每瓶灌2/32/3容積的自來水，振蕩后倒掉，重復(fù)15-2015-20次。 煮沸前水面要高于器材5 5厘米，水沸后投入洗滌劑第5頁/共90頁配制時先在容器中加入蒸餾水，加熱溶解重鉻酸鉀， 再將容器置流動自來水中，待重鉻酸鉀液冷卻后， 緩慢加入濃硫酸，邊加邊攪拌。重鉻酸鉀（克）濃硫酸（毫升）蒸餾水（毫升）弱液1001001000次強液1202001000強液631000200組成強度第6頁/共90頁 包裝材料：牛皮紙 硫酸紙 鋁箔 紗布 金屬消毒桶 鋁質(zhì)飯盒方式：全包裝 局部包裝

4、第7頁/共90頁 包裝時應(yīng)注意：手指與器材接觸面積要小，手指不能觸及器材的使用端；封閉器材使用端，標(biāo)記器材手持端；小包裝；玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端等）加棉花。第8頁/共90頁消毒滅菌方法清除或殺滅物品 上的一切微生物, 以殺滅芽孢為準(zhǔn)第9頁/共90頁物理法1：紫外線消毒 紫外線直接照射消毒是各實驗室常用的方法； 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒。 紫外線消毒時產(chǎn)生臭氧，對身體有害，故紫外線消毒停止后30分鐘才可入室工作。 目前有的實驗室采用電子滅菌燈代替紫外燈進(jìn)行空氣消毒。第10頁/共90頁 紫外線消毒法是利用紫外線照射，使菌體蛋白發(fā)生光解、變性，菌體內(nèi)的核酸、

5、酶遭到破壞而死亡的一種消毒方法。紫外線的殺菌力與其波長密切相關(guān)，最佳殺菌波長為250-270nm250-270nm. . 第11頁/共90頁 光照消毒法主要利用紫外線照射，使菌體蛋白發(fā)生光解變性而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，常用方法有： 日光曝曬消毒法 日光曝曬法用于枕頭、床褥、床墊、棉絮等的消毒，一般曝曬6 h6 h可達(dá)到消毒，曝曬時2 h2 h翻面一次 紫外線消毒法 紫外線消毒法用于空氣消毒與物品表面的消毒 第12頁/共90頁物理法2：干熱消毒 干熱是指相對濕度在20%20%以下的高熱，由空氣導(dǎo)熱，傳熱 較慢，干熱消毒滅菌常用的方法; ;1.1.焚燒滅菌法; ;2.2.燃燒滅菌法; ;3.3.干烤消毒滅

6、菌法: :用于高溫下不變質(zhì)、不損壞、不蒸發(fā)的物品，如油劑、粉劑、玻璃器具、金屬制品等; ; 玻璃器皿，160oC 90-240mins4.微波消毒滅菌法: :用于食品及餐具的消毒 醫(yī)療藥品及耐熱非金屬材料物品的消毒滅菌第13頁/共90頁物理法3：濾過消毒 目前細(xì)胞培養(yǎng)工作中采用的培養(yǎng)用液，包括人工合成培養(yǎng)液、血清、消化用胰酶等常含有維生素、蛋白、多肽、生長因子等物質(zhì)，這些物質(zhì)在高溫或射線照射下易發(fā)生變性或失去功能，因而上述液體多采用濾過消毒以除去細(xì)菌 。第14頁/共90頁濾膜使用時應(yīng)注意：濾膜薄且光滑，容易移動，安裝時膜位置一定要放正。過分干燥的濾膜很脆，在高壓或高溫干燥時易破裂，因此安裝前可

7、先用三蒸水潤濕濾膜。為保證過濾效果，在使用時，每次墊兩張濾膜，上面一張孔徑為045微米，下面一張孔徑為022微米，或兩張均為022微米。使用無齒玻片鑷子夾取濾膜，以防止鑷齒弄破濾膜。加大壓力時用力應(yīng)均勻，用后打開濾器對光檢查濾膜是否移動和有無破裂。第15頁/共90頁用于濾過除菌的各式濾器用于濾過除菌的各式濾器濾過除菌法：培養(yǎng)基、血清、消化酶、抗生素等。第16頁/共90頁物理法4： 濕熱滅菌 濕熱由空氣和水蒸氣導(dǎo)熱，傳熱快，穿透力強，濕熱消毒滅菌常用的方法： 煮沸消毒法 高壓蒸汽滅菌法，一般高壓蒸汽滅菌的壓力為 kPakPa，溫度為1211211261260 0C C經(jīng)15-30 min15-3

8、0 min可達(dá)到滅菌目的 最常用、最有效的方法； 布、金屬、橡膠、玻璃、某些培養(yǎng)液 培養(yǎng)液，橡膠：10磅（115oC）20mins； 玻璃、金屬： 12磅（121oC）30mins；第17頁/共90頁高壓蒸汽滅菌器高壓蒸汽滅菌器第18頁/共90頁化學(xué)消毒滅菌法 化學(xué)消毒滅菌法是利用化學(xué)藥物滲透細(xì)菌體內(nèi)，使菌體蛋白凝固變性，干擾細(xì)菌酶的活性，抑制細(xì)菌代謝和生長或損害細(xì)菌膜的結(jié)構(gòu)，改變其滲透性，破壞其生理機能等，從而達(dá)到消毒滅菌目的第19頁/共90頁化學(xué)消毒劑的使用原則 (1)(1)根據(jù)物品的性能及微生物的特性，根據(jù)物品的性能及微生物的特性，選擇合適的消毒劑。選擇合適的消毒劑。 (2)(2)嚴(yán)格掌

9、握消毒劑的嚴(yán)格掌握消毒劑的有效濃度、消毒時間及使用方法。有效濃度、消毒時間及使用方法。 (3)(3)消毒劑應(yīng)消毒劑應(yīng)定期更換定期更換，易揮發(fā)的消毒劑要加蓋，并定期檢測，易揮發(fā)的消毒劑要加蓋，并定期檢測，調(diào)整其濃度。調(diào)整其濃度。 (4)(4)浸泡前將物品洗凈擦干浸泡前將物品洗凈擦干，浸沒在消毒液內(nèi)的物品應(yīng)注意打開，浸沒在消毒液內(nèi)的物品應(yīng)注意打開軸節(jié)或套蓋，管腔內(nèi)應(yīng)注滿消毒液。軸節(jié)或套蓋，管腔內(nèi)應(yīng)注滿消毒液。 (5)(5)在使用前用無菌生理鹽水沖凈消毒后的物品在使用前用無菌生理鹽水沖凈消毒后的物品，避免消毒劑刺，避免消毒劑刺激人體組織激人體組織 第20頁/共90頁化學(xué)消毒劑的分類 l l、高效消毒

10、劑 高效消毒劑可殺滅一切微生物，包括芽孢 ( (碘酊、福爾馬林等) ) 2 2、中效消毒劑 中效消毒劑可殺滅細(xì)菌繁殖體，不能殺滅芽孢( (乙醇、碘伏等) ) 3 3、低效消毒劑 低效消毒劑可殺滅細(xì)菌繁殖體，不能殺滅結(jié)核桿菌、親水性病毒或芽孢( (苯扎溴銨、氯己定等) ) 第21頁/共90頁化學(xué)消毒劑的使用方法 浸泡法 侵泡法是將物品洗凈、擦干后，浸沒在消毒液中進(jìn)行消毒滅菌的方法。 擦拭法 擦拭法是用消毒劑直接擦拭人體或物品表面，如皮膚、桌椅等，達(dá)到消毒滅菌的方法。 噴霧法 噴霧法是利用噴霧器將消毒劑變成微粒氣霧彌散在空氣中對空氣和物品表面進(jìn)行消毒滅菌的方法。 熏蒸法 熏蒸法是將消毒劑加熱或加人

11、氧化劑，使其產(chǎn)生氣體來進(jìn)行消毒滅菌的方法。第22頁/共90頁常用消毒劑 過氧過氧乙酸乙酸 peracetic acidperacetic acid 福爾福爾馬馬林林formalin formalin （37 -40%37 -40%的甲的甲醛醛溶液溶液) ) 戊二戊二醛醛glutaraldehyde glutaraldehyde 環(huán)氧環(huán)氧乙乙烷烷ethylene oxide ethylene oxide 含含氯氯消毒消毒劑劑 乙醇乙醇alcohol alcohol 苯苯扎漠扎漠銨銨( (新新潔潔爾爾滅滅) ) 第23頁/共90頁過氧過氧乙酸乙酸 消毒效力：高效 用于手消毒，浸泡1- 2min 1

12、- 2min 用于用具消毒，浸泡30 - 60 min 30 - 60 min 用于物體表面消毒，或浸泡10 min 10 min 1 1 -2-2用于空氣消毒，8 mL/m8 mL/m3 3，加熱熏蒸，密閉門窗30-120 min 30-120 min 第24頁/共90頁注意事項： 對金屬有腐蝕性，不可用于金屬器械的消毒； 易氧化分解而降低殺菌力，需現(xiàn)配現(xiàn)用； 濃溶液有腐蝕性，配制時要戴口罩和橡膠手套； 存放于陰涼避光處，防高溫引起爆炸； 第25頁/共90頁福爾馬林(37 -40%(37 -40%的甲醛溶液) ) 消毒效力：高效 4040甲醛2 210 mL10 mLm m3 3加水4 42

13、0 mL20 mL加熱，作室內(nèi)物品及空氣消毒； 4040甲醛4060 mL4060 mLm m3 3加高錳酸鉀2040 g2040 g，柜內(nèi)熏蒸，密閉6 612 h12 h； 1010甲醛可作浸泡器械消毒第26頁/共90頁 注意事項： 蒸汽穿透力弱，因此衣服應(yīng)掛起消毒； 消毒效果易受溫度、濕度影響，要求室溫在1818以上，相對濕度在7070以上； 對人體有一定毒性和刺激性，使用時注意防護(hù)；第27頁/共90頁戊二醛 消毒效力：高效 濃度和用法：2 2戊二醛溶液加入碳酸氫鈉，成為2 2堿性戊二醛，用于浸泡不耐高溫的金屬器械、醫(yī)學(xué)儀器、內(nèi)鏡等，消毒需10-30 min10-30 min，滅菌需7-1

14、0 h.7-10 h.第28頁/共90頁 注意事項： 每周過濾1 1次，每2 2周應(yīng)更換消毒液1 1次； 浸泡金屬類物品時，加入亞硝酸鈉作為防銹劑 ； 消毒滅菌后的物品，使用前用無菌蒸餾水沖凈第29頁/共90頁含氯消毒劑 含氯消毒劑：常用的有漂白粉 消毒效力：中、高效 濃度和用法： 漂白粉溶液、1 1氯胺溶液用于浸泡餐具、便器等，浸泡30 min 30 min ； 1 13 3漂白粉溶液、3 3氯胺溶液噴灑或擦拭地面、墻壁及物品表面； 排泄物消毒：干糞5 5份加漂白粉1 1份攪拌，放置2 h2 h，尿液100 mL100 mL加漂白粉1 g1 g，放置1 1 h h第30頁/共90頁 注意事項

15、： 消毒劑保存在密閉容器內(nèi)， 置于陰涼、干燥、通風(fēng)處，減少有效氯的喪失； 配制的溶液性質(zhì)不穩(wěn)定，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用； 有腐蝕及漂白作用，不宜用于金屬制品、有色衣服及油漆家具的消毒； 3 d3 d更換一次消毒液第31頁/共90頁乙醇消毒效力：中效 濃度和用法： 7070-75-75用于皮膚消毒 9595用于燃燒滅菌 注意事項： 易揮發(fā)，需加蓋保存，定期測定，保持有效濃度 有刺激性，不宜用于黏膜及創(chuàng)面消毒 易燃，故應(yīng)置于避火處第32頁/共90頁苯扎漠銨( (新潔爾滅) )消毒效力：低效 用于皮膚消毒 用于金屬器械消毒，浸泡15-30 min (15-30 min (加入亞硝酸鈉以防銹) )第33頁/共90

16、頁 注意事項： 對肥皂、碘、高錳酸鉀等陰離子表面活性劑有拮抗作用 有吸附作用，會降低藥效，所以溶液內(nèi)不可投人紗布、棉花等 對鋁制品有破壞作用，故不可用鋁制品盛裝第34頁/共90頁 75酒精、新潔爾滅、過氧乙酸、乳酸和洗必泰等都是常用的有效消毒劑。 的過氧乙酸在10分鐘內(nèi)可將芽孢菌和各種病毒殺死； 乳酸蒸汽常用做無菌室內(nèi)或周圍環(huán)境的定期消毒； 75酒精常用于超凈臺的臺面、器械、實驗操作者的皮膚等的消毒;新潔爾滅用于對桌、椅、地面、皮膚、操作臺面進(jìn)行擦拭或浸泡消毒； 洗必泰水溶液用于皮膚浸泡消毒。第35頁/共90頁總結(jié)：物理消毒（1）射線消毒：60Co60Co、X X射線，用于血清和塑料制品滅射線

17、，用于血清和塑料制品滅菌。菌。（2）紫外線：器皿需結(jié)合器皿需結(jié)合7575酒精浸泡，照射酒精浸泡，照射30min30min。（3）干熱滅菌：160160C C，9090120 min120 min。主要用于玻璃、。主要用于玻璃、金屬器皿。金屬器皿。（4）濕熱滅菌：）濕熱滅菌：121121C C，30 min30 min；適用布、橡膠、某些；適用布、橡膠、某些塑料、金屬、玻璃等。塑料、金屬、玻璃等。（5）過濾除菌：）過濾除菌：用孔徑小于用孔徑小于mm的濾膜過濾，適用于培的濾膜過濾，適用于培養(yǎng)用液和其他不能高壓滅菌的溶液。養(yǎng)用液和其他不能高壓滅菌的溶液。第36頁/共90頁總結(jié)：化學(xué)消毒（1）70（7

18、5）酒精：用于手、器械、工作臺面。用于手、器械、工作臺面。（2）新潔爾滅：主要用于手的清洗和工作臺面的清主要用于手的清洗和工作臺面的清洗洗。（3）來蘇水：主要用于桌椅、墻壁、地面的消毒，也主要用于桌椅、墻壁、地面的消毒，也可用于空氣消毒可用于空氣消毒。（4）0.5%過氧乙酸：過氧乙酸：10min10min可將芽孢菌殺死，用于表可將芽孢菌殺死，用于表面消毒。面消毒。 （5）其他：）其他：乳酸、甲醛、高錳酸鉀、氯等乳酸、甲醛、高錳酸鉀、氯等。第37頁/共90頁無菌室的滅菌： 1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3來蘇爾或者新潔爾 滅或者過氧乙酸擦拭。 孵箱

19、（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3新潔爾滅擦拭，然后用75酒精擦拭或者過氧乙酸，再用紫外燈照射3.實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘 4.實驗后滅菌：用75酒精（3新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。第38頁/共90頁實驗人員的無菌準(zhǔn)備：1.肥皂洗手。2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋3.用75酒精棉球擦凈雙手。第39頁/共90頁無菌操作的注意事項：1.凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精燈火焰操作。3.器皿使用前必須過火滅菌4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。5.

20、各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。第40頁/共90頁培養(yǎng)前準(zhǔn)備 器材 物品放到操作場所（培養(yǎng)室、超凈臺）內(nèi)消毒。 第41頁/共90頁操作間消毒 每天0.2% 新潔爾滅拖地； 每天紫外線照射分鐘 超凈臺在每次試驗前用酒精擦拭，然后紫外線消毒分鐘第42頁/共90頁 洗手和著裝 火焰消毒 操作：動作準(zhǔn)確敏捷避免手碰到器皿布局合理瓶口順風(fēng)不同移液管取液不能講話、咳嗽第43頁/共90頁 專門人配液，滅菌，標(biāo)簽 一切用品固定存放；“避免污染”第44頁/共90頁第二節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng)用液第二節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng)用液第45頁/共90

21、頁第46頁/共90頁第47頁/共90頁（二）平衡鹽溶液（二）平衡鹽溶液第48頁/共90頁成分：無機鹽葡萄糖用途：洗滌配制其他溶液的基礎(chǔ)溶液可加指示劑 BBS 作用：提供細(xì)胞生長的基本元素；維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度；第49頁/共90頁平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS： NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 加水至1000 ml第50頁/共90頁（三）消化液（三）消化液作用：貼附型細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)過程中細(xì)胞和組織的分散； 胰蛋白酶液：使細(xì)胞間蛋白質(zhì)水解， 細(xì)胞分散 EDTA（二乙烯四乙酸二鈉）： 吸取Ca2，Mg2，

22、使細(xì)胞分離 膠原酶 原代培養(yǎng)分散組織細(xì)胞聯(lián)用第51頁/共90頁胰蛋白酶消化液來源：豬或者牛的胰臟，白色粉末作用：水解細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)濃度：0.25% 0.125%特點：不同細(xì)胞的要求不同終止：血清可以中止胰蛋白酶的繼續(xù)作用第52頁/共90頁EDTANa 又稱Versen溶液 化學(xué)鰲合劑 對細(xì)胞具有一定的解離作用 毒性小，價格低 0.02%第53頁/共90頁膠原酶溶液來源：細(xì)菌作用：對膠原組織和細(xì)胞間質(zhì)有較強的消化作用。第54頁/共90頁細(xì)胞培養(yǎng)用容器及培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)用容器及培養(yǎng)基Culture vessels and mediumfor animal cell culture第55頁/共90頁

23、培養(yǎng)基（液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液天然培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基：氨基酸、維生素、糖類 無機離子、其它成分 完全培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基+血清無血清培養(yǎng)基： 第56頁/共90頁（一）天然培養(yǎng)基（一）天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基有生物性液體（血清）， 組織浸液（胚胎浸液），凝固劑（血漿）優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點： 來源受限。 成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取 和實驗結(jié)果的分析。 易發(fā)生支原體污染第57頁/共90頁 血清(serum)(serum)： 一般常用為小牛血清( (包括胎牛血清) )，人血清和其它動物血清。 滅活：5656度，30min30min消除補體活性。 成分：總蛋白 球蛋白不高于2

24、g/100ml2g/100ml 外觀：透明淡黃色，無溶血，無沉淀。第58頁/共90頁第59頁/共90頁 常用血清有胎牛血潔,新生牛血清,小牛血清,兔血清,馬血清等,其中以胎牛血清質(zhì)量最好. 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn):透明,淡黃色,無沉淀物,無細(xì)菌,支原體,病毒污染. 第60頁/共90頁多種PRPR（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分第61頁/共90頁血清的使用與儲存血清的使用與儲存 使用前的處理使用前的處理 5656滅活滅活30min 30min 去除補體成分去除補體成分 儲存條件儲存條件 滅活后分裝成小包裝（滅活后分裝成

25、小包裝（10mL10mL、20mL20mL、50mL50mL），），20 20 儲存；使用前儲存；使用前4 4 融化，可融化，可用用1 1個月。個月。 使用濃度使用濃度 一般為一般為5 52020，最常用的是，最常用的是1010。第62頁/共90頁影響血清的各種因素影響血清的各種因素 年齡：年齡：較老動物的血清對細(xì)胞生長較老動物的血清對細(xì)胞生長有抑制作用有抑制作用 血型：血型：ABAB型血清比型血清比A A型和型和OO型血清對型血清對細(xì)胞生長有利細(xì)胞生長有利 血色素血色素 膽紅質(zhì)膽紅質(zhì) 脂肪酸脂肪酸 血清在培養(yǎng)液中的濃度并非越高越血清在培養(yǎng)液中的濃度并非越高越好好第63頁/共90頁細(xì)胞培養(yǎng)中使

26、用血清的缺點細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點 使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)。態(tài)。 如：血清可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長，同如：血清可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長，同時會抑制表皮角質(zhì)細(xì)胞的生長。時會抑制表皮角質(zhì)細(xì)胞的生長。 血清中含有一些物質(zhì)對細(xì)胞會產(chǎn)生毒性作用。血清中含有一些物質(zhì)對細(xì)胞會產(chǎn)生毒性作用。 如：多胺氧化酶如：多胺氧化酶 每批血清之間都有差別每批血清之間都有差別，其成分不能保持一致。，其成分不能保持一致。 取材過程中有可能帶入取材過程中有可能帶入支原體、病毒支原體、病毒，對培養(yǎng)細(xì)，對培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生影響。胞產(chǎn)生影響。第64頁/共90頁關(guān)于血清的幾個問題

27、關(guān)于血清的幾個問題 血清必須貯存于20 20 -70-70，若存放于44，請勿超過一個月。如果一次無法用完一瓶，可將404045 ml45 ml分裝于無菌50ml 50ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時體積會增加約10 %10 %， 必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。第65頁/共90頁第66頁/共90頁血漿：1907年Harrison首次使用優(yōu)點：支持培養(yǎng)組織塊，供給細(xì)胞生長物質(zhì)。 缺點：易于液化。2、血漿第67頁/共90頁閱讀：P484、水解乳蛋白5、膠原回

28、答：膠原在細(xì)胞培養(yǎng)中的用途？ 膠原的制備方法？ 膠原的使用方法？第68頁/共90頁（二）合成培養(yǎng)基（二）合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 主要成分：氨基酸、維生素、碳水化合物、無 機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點： 標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。 成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì) 胞生長需要。 第69頁/共90頁常用合成培養(yǎng)基MEM: 12種氨基酸 +谷氨酰胺 + 8種維生素廣泛適用已建成細(xì)胞系的培養(yǎng)minimum essential medium第70頁/共90頁DMEM: MEM改良 成份加倍葡萄糖(高糖1000mg/L或者低

29、糖400mg/L) 低糖: 生長速度快,附著性稍差的腫瘤細(xì)胞 ; 高糖: 附著性差的細(xì)胞第71頁/共90頁RPMI-1640: 成份簡單, 正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞,廣泛適用第72頁/共90頁干粉培養(yǎng)基商品培養(yǎng)液第73頁/共90頁完全培養(yǎng)基也叫血清培養(yǎng)基;分成細(xì)胞生長和細(xì)胞維持培養(yǎng)基細(xì)胞生長培養(yǎng)基: 血清含量高, 10-20%維持培養(yǎng)基:血清含量低, 2-5%第74頁/共90頁青霉素 50100IU/ml培養(yǎng)液鏈霉素 50100ug/ml培養(yǎng)液第75頁/共90頁100IU/ml第76頁/共90頁（三）無血清培養(yǎng)基（三）無血清培養(yǎng)基第77頁/共90頁 血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，故在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。 在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 第78頁/共90頁v 19751975年，SatoSato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株