溫度對顆粒脂肪和ASCs活性及體外處理方法對移植后脂肪成活的影響

1、溫度對顆粒脂肪和ascs活性及體外處理方法對移植后脂肪成活的影響 暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文摘 要研 究背 景 :脂肪源性干細(xì)胞(a di p o se -der i ved st r om a l v ascul a r f ract i o n cel ls /st em cel ls ,ascs ) , 是存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞, 具有自我更新及多向分化潛能等干細(xì)胞的生物學(xué)特性。目前已成為再生醫(yī)學(xué)研究的新熱點(diǎn),特別是關(guān)于脂肪源性干細(xì)胞輔助的自體脂肪移植 , 將傳統(tǒng)的顆粒脂肪移植提高到了一個(gè)新的層面,展現(xiàn)出了更加廣闊的應(yīng)用前景。自體脂肪組織因其較好的生物相容性,獲取簡便,已作為

2、臨床上常用的軟組織填充材料廣泛應(yīng)用于整形修復(fù)和美容為目的的軟組織增大。如何提高移植脂肪組織的成活率是目前最為關(guān)注和需要解決的問題。脂肪組織供體及受體的選擇 、 脂肪組織的獲取、 脂肪組織的處理、 保存環(huán)境及時(shí)間對脂肪組織的影響、注射脂肪組織的方法及注射量等因素均可影響脂肪組織移植的成活率。本實(shí)驗(yàn)通過不同保存溫度及時(shí)間對體外顆粒脂肪組織的活性及其脂肪源性干細(xì)胞提取、增殖能力的差異及體外顆粒脂肪組織的不同處理方式對體外顆粒脂肪組織移植效果的差異,探討不同保存溫度、時(shí)間及體外處理方法對移植脂肪組織的影響,從而優(yōu)化臨床脂肪源性干細(xì)胞輔助的自體脂肪組織移植技術(shù),使得該技術(shù)更加簡便、安全、有效。目 的:1

3、、分離和培養(yǎng)人脂肪來源干細(xì)胞(ascs ) ,對獲得 ascs 進(jìn)行鑒定。2、觀察不同保存溫度及時(shí)間對體外顆粒脂肪組織的活性及其脂肪源性干細(xì)胞提取效率、增殖能力的影響。3、觀察顆粒脂肪組織在體外不同處理方式對其移植后成活情況的影響。材 料及 方法 :1) 人脂肪組織取材,i 型膠原酶酶消化法分離培養(yǎng)脂肪源性干細(xì)胞。 觀察細(xì)胞形態(tài)。選取 p1 代脂肪源性干細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀(f l u o r es cence- act i vat ed cel lsorti ng ,f a cs cd44 cd45 cd59 cd29 hl a-dr) 細(xì)胞表型檢測, 選取 、 、 、 、 進(jìn)暨 南大 學(xué)碩

4、士學(xué) 位論 文行檢測。 成脂和成骨誘導(dǎo)液連續(xù)培養(yǎng) ascs 3 周后, 分別進(jìn)行油紅染色和茜紅素染色,觀察細(xì)胞多向分化能力。2) 獲取健康女性抽脂所得體外顆粒脂肪組織, 將體外顆粒脂肪組織按保存方式及時(shí)間進(jìn)行分組保存,對每組顆粒脂肪進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)、油脂比值、g3pdh 活性、脂肪源性干細(xì)胞提取效率及增殖能力進(jìn)行研究。3) 獲取健康女性抽脂所得體外顆粒脂肪組織, 將體外顆粒脂肪組織按不同純化方式(洗滌離心法、單純離心法、洗滌靜置法、單純靜置法、洗滌靜置離心法及不進(jìn)行純化)進(jìn)行分組,將每組處理好的體外顆粒脂肪稱重后分別注入裸鼠皮下,飼養(yǎng) 4 周后取材,對其重量、形態(tài)學(xué)情況進(jìn)行研究分析。結(jié) 果:1、

5、利用膠原酶消化法, 可以獲得大量的人脂肪源性干細(xì)胞。 體外培養(yǎng)人脂肪源性干細(xì)胞成梭形細(xì)胞生長。 在 p1 細(xì)胞中有大量 cd44 、cd59 、cd29 所標(biāo)記的細(xì)胞 , cd45 、 hl a-dr 所標(biāo)記細(xì)胞含量極少。 成脂和成骨誘導(dǎo)液連續(xù)培養(yǎng) a scs3 周后, 分別進(jìn)行油紅染色和茜紅素染色可見呈橙紅色顆粒狀脂滴及紅色鈣化結(jié)節(jié)。2、 4保存體外顆粒脂肪組織 24 小時(shí)內(nèi)可以有效的保護(hù)其活力, 室溫條件下保存體外顆粒脂肪組織會(huì)使其活力下降較快。體外顆粒脂肪組織提取干細(xì)胞的效率及其增殖能力受保存溫度及時(shí)間影響,室溫條件下保存超過 1 小時(shí)的體外顆粒脂肪組織,其脂肪源性干細(xì)胞的提取效率及增殖

6、能力均明顯下降。3、不同體外脂肪組織處理方法對移植后成活脂肪組織重量及形態(tài)學(xué)無明顯影響。結(jié) 論:1、 人脂肪組織中可以獲得大量的具有多分化能力的貼壁細(xì)胞, 并且表達(dá) cd44 、cd59 、cd292、 24 小時(shí)內(nèi), 4保存可以有效的保證體外顆粒脂肪組織的活性及其提取脂肪源性干細(xì)胞的效率、增殖能力,因此,脂肪組織獲取過程中低溫保存有重要意義。3、 單純靜置法是有效的體外脂肪組織的處理方法, 具有操作簡便, 減少污染的優(yōu)點(diǎn),且不影響移植效果。暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文關(guān) 鍵詞 :脂肪源性干細(xì)胞 脂肪組織活性 提取效率 增殖能力暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文abs tr actbac kgr

7、o und :a di p o se -der i ved st r om a l v ascul a r f ract i o n cel l s / st em cel ls a sc s arem e se nchy ma l st em cel l s exi s t i ng i n adi p o se ti s sue s , wh i c h are ch a ract er i z ed b yse l f- renewa l and m ul t i p o ten t i al di f f e ren t i at i o n. th ey h ave b eco m

8、e a n e w h o t pot i nst udi es on th e regen e rati ve m e di c i ne , es peci a l ly on th e ascs - as si s t ed autol o gous f atgraf t i ng, wh i c h gi ve s a n e w di m e ns i o n to th e tradi t i o n al grai ny f at graf t i ng and sh o wsm o re poten t i al appl i c a t i o n s i n th i s

9、f i e l dov er th e pas t 20 y e ars, th e re h a s b e en a dram at i c i nc reas e i n th e use of autol o gousf at graft i ng to treat v o l um e an d co n t our def ect s i n aes t h et i c and reco n st ructi vesurgery b e caus e of i t s good b i o c o m pa t i bi lit y and eas i ly acc essi b

10、lehoweve r , th ere arem a ny procedural v a ri at i o n s , and i n term s of ob j e c t i ve cl i nic a l ef f e ct i veness, th e m a j o rdi s advant age of th i s techni que rem ai ns th e un predi c t abl e f at reso r pti o n rates. ho wto i m p ro v e th e survi va l rate of tran spl a nt ed

11、 adi po se ti ssue i s th e m o st co n cerned andto b e resol ved prob l e mth e ch o i c e of th e don o r an d recept or of graft i ng adi po seti s sue , th e acqui s i t i o n, process i ng , th e m et h o ds an d ti m e of sa vi ng adi po se ti s sue , th em e th o d an d v o l um e of i nj e

12、c t i ng adi po se ti s sue , an d so on co ul d i nf lu ence th e survi va lrate of th e f at ti ssue tran s pl a nt ati o na cc o r di ng to di f f e ren c es of di f f e renttem pe ratur es and ti m e s i n act i vi t i e s of i n v i t ro grai ny adi po se ti s sue and i t s extracti o nand prol

13、 i fe rat i o n of a sc s al o ng wi t h di f f e rences i n ef f e ct s of di f f e rent treatm ent s ofi n v i t ro grai ny adi po se ti s sues on th ei r graft i ngs, th i s experi m e nt wi l l di s cus s th ei m p ac t s of di f f e ren t st or age tem pe ratur es , ti m e s and i n v i t ro tr

14、eatm ent s on th e adi po seti s sue tran s pl a nted so as to opti m iz e th e cl i nic a l ascs -assi s t ed aut ol o gous f at ti ssuegraf t i ng to b e sa f e r , si mp l e r and m o re ef f e ct i veobje ctive:1. t o se perat e and cul t ure h um a n a sc s to i de nti f y th e i r charact eri

15、st i cs of st em cel ls2. t o un derst an d th e i m p ac t s of di f f e rent st or age tem pe ratur es an d ti m e s on acti vi t i e sof in vitr o grai ny adi po se ti s sues and th e i r ex t racti o n and prol i f e rat i o n of ascs.暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文3. t o un ders tand th e i m p ac t s of di f

16、f e rent process i ng of i n v i t ro grai ny adi po se ti s sueson th ei r graft i ng s.m e th od s:1. hum an adi p o se ti ssue se l e ct i o n , ascs were se parat ed and cul t ured b y col l a ge nas ety pe i di ge st i o nce l l u l a r m o rph o l o gy was ob s erved. p1 generat i o n ascs wer

17、ese l e ct ed to det ect cel l ph e no ty pe s b y f l u o r es cence- act i vat ed cel l so rti ng f a cs, an dcd44, cd45, cd59, cd29 and hl a-dr were se l e ct ed to det ect. th ree wee ks af t ercon t i nuo us cul t ure of ascs i n adi po geni c an d ost eogen i c i nduct i o n m e di a , th e y

18、weresta i ne d wi t h oi l red an d al i z a ri n red, respec t i vel y , and th ei r m ul t i p o ten t i aldi f f e ren t i at i o n was ob s erved.2. in v i t ro grai ny adi po se ti ssues , wh i c h were ob t ai ne d b y l i p o suc t i o n s i n h e al t hyf em a l e s , were kept i n di f f e

19、rent groups b ased on di f f e rent st or age pat ter n s and ti m e s ;al l groups of adi p o se gran ul e s were st udi ed i n th e h i s t o m o r ph o l o gy , oi l rati o , act i vi t yof g3pdh, ext r act i o n ef f ic i e ncy and prol i fe rati o n of a scs.3. in v i t ro grai ny adi p o se ti

20、 s sue s , wh i c h were ob t ai ne d b y l i p o suc t i o n s i n h e al t hyf em a l e s , were grouped b y di f f e rent process i ng of puri f i c a t i o n centri f u gal was hi ng ,si m p l e cent r i f u gat i o n , was hi ng st an di ng , si mp l e st an di ng , was hi ng -st an di ngcentri

21、 f u gat i o n an d n o puri f ic at i o n ; al l groups of wel l-t reated i n v i t ro grai ny adi p o seti ssues were wei g hed f o r subc ut an eo us i nj e c t i o n i n n ude m i c e , respe ct i vel y; th e m i c ewere se l e ct ed to st udy and an a l y z e th ei r wei g ht s,m o rph o l o gi

22、 es af t er 4-week f ee di ngres ult s:1. a l arge am o unt of h um a n a scs co ul d b e ob t ai ne d b y co l l a genase di ge st i o nhum a na sc s cul t ured i n v i t ro grew i nt o spi nd l e cel lsam o n g p1 cel ls , th e re were a l a r geam o un t of cel ls l a bel le d wi t h cd44, cd59 a

23、nd cd29 b ut rar e on e s l a bel le d wi t hcd45 an d hl a-dr. th ree weeks af t er co n t i nuo us cul t ure of a scs i n adi p o gen i c andost eogen i c i nduc ti o n m e di a , cel l s st ai ned wi t h oi l red and al i z a ri n red sho wed oran gered gran ul a r l i p i d dropl et s and red ca

24、l c i f ic n o dul es, respec t i vel y2. in v i t ro grai ny adi po se ti s sue s cry o preserv e d at 4 wi t h i n 24 h o urs co ul d retai nth ei r acti vi t i e s ef f e ct i vel y , b ut th ei r acti vi t i e s woul d decreas e rapi dl y i f th e y prese rv ed暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文at room tem pe ratur

25、 e. th e ef f ic i e ncy of i n v i t ro grai ny adi p o se ti ssues ext r act i ng st emcel l s an d th e i r prol i f e rat i o n s were af f e ct ed b y st or age tem pe ratur es an d ti m e sif i nv i t ro grai ny adi po se ti s sue s preserv e d at room tem pe ratur e f o r ov e r 1 h o ur , th

26、 eex t racti o n ef f ic i e ncy and prol i fe rat i o n of th ei r ascs wo ul d l o wer si g ni f ic a nt l y3. no si g ni f ic a nt di f f e rence b e tween th e di f f e ren t proces si ng of i n v i t ro adi p o se ti s suean d th e adi po se tran s pl a nt ed i nt o subc ut an eo us adi p o se

27、ti s sue s of n ude m i c e wasob s erv e d i n wei g ht an d m o rph o l o gy af t er graft i ng.conclusi ons:1. a l a r ge am o un t of adherent cel l s wi t h m ul t i p o ten t i a l di f f e ren t i at i o n can b e ob t ai nedf ro m h um a n a di po se ti ssue s, express i ng cd44, cd59 and cd

28、29.2. in v i t ro grai ny adi po se ti s sues cry o preserv e d at 4 can ef f e ct i vel y ens ure th e i racti vi t i e s an d th e i r ext r act i o n ef f ic i e ncy and prol i f e rat i o n of a scs. it i s i m p o rtan t toprese rv e a di po se ti s sues at l o w tem perat ure wh e n acqui ri n

29、g th e m3. si m p l e st an di ng m et h o d i s ef f e ct i ve to treat i n v i t ro a di po se t i s sues, wi t h an eas i e roperati o n , l e ss pol l u t i o n and n o i nf lu ence on graft i ng resul t s.key words :ascs; grai ny fat graf ti ng ; pr ol i fe rat i o n暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文目 錄前言. - 1 -第

30、一部分:人體脂肪源性干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定- 5 -材料及方法 - 5 -一、實(shí)驗(yàn)材料及試劑 - 5 -.二、實(shí)驗(yàn)方法 - 6 -1.細(xì)胞分 離- 6 -2.細(xì)胞培 養(yǎng) - 7 -3. 流式細(xì) 胞儀細(xì)胞 表型檢測- 7 -4.細(xì)胞成 骨誘導(dǎo)與 細(xì)胞染色 觀察 - 7 -5.細(xì)胞成 脂誘導(dǎo)與 細(xì)胞染色 觀察 - 7 -.結(jié)果 - 7 -討論. - 8 -第二部分 顆粒脂肪組織保存溫度對其及內(nèi)含 asc s 生物學(xué)活性影響 - 11 -材料和方法 - 11 -一、實(shí)驗(yàn)材料及試劑- 11 -二、實(shí)驗(yàn)方法. - 12 -1、脂肪 組織取材 分組后 he 染色石蠟 切片制作 - 12 -2、體外 顆粒脂

31、肪 組織 ga pdh 活性檢 測- 13 -3、不同 保存條件 下的體外 脂肪組織 所提取脂 肪源性干 細(xì)胞生長 情況 - 13 -.4、不同 保存條件 下的體外 脂肪組織 所提取 a scs 增殖能 力檢測 - 14 -.結(jié) 果 - 14 -.討 論 - 17 -第三部分 體外顆粒脂肪組織的不同處理方式對移植效果影響的研究. - 20 -材料與方法 - 20 -一、實(shí)驗(yàn)材料與試劑- 20 -二、實(shí)驗(yàn)步驟及方法- 21 -.1、實(shí)驗(yàn) 分組 - 21 -2、體外 顆粒脂肪 組織處理 、分裝及 注射 - 21 -.3、檢測 方法 - 22 -結(jié) 果. - 22 -討 論. - 22 -結(jié) 論.

32、- 24 -參考文獻(xiàn). - 25 -i暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文發(fā)表論文. - 36 -.參加會(huì)議 - 36 -致 謝 - 37 -ii暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文前 言脂肪源性干細(xì)胞(a di p o se -der i ve d strom al v a sc ul a r f ract i o n cel ls / st em cel ls ,1a sc s )于 2001 z uk 和他的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)并證實(shí),是存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞,具有自我更新及多向分化潛能等干細(xì)胞特點(diǎn),與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似,而且脂肪源性干細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn):1、脂肪組織分布較廣泛、獲取容易、對病人創(chuàng)傷

33、少, 患者更加容易接受; 2、 分離培養(yǎng)簡單、 增殖能力強(qiáng),不需要體外擴(kuò)增; 3、可分泌多種血管生成因子和抗凋亡因子,促進(jìn)血管再生;4、低免疫原性及免疫調(diào) 2- 4 節(jié)作用。成為目前再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn),具有廣闊的前景 。2009 年日本學(xué)者吉村浩太郎提出自體細(xì)胞輔助脂肪移植技術(shù)(ce l l-as so st edl i p o tr ans f e r ,cal) ,簡稱 cal 技術(shù),即將抽吸所得的自體顆粒脂肪分成兩份, 一份用于患處的填充, 另一份經(jīng)膠原酶消化, 離心后分離出多種細(xì)胞的混合物稱基質(zhì)血管成分(str om al v a sc ul a r f ract i o n,s

34、vf ) ,其中含有大量的脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞 (ascs ) , 吉村浩太郎將兩部分共同注射于受體, 含有豐富的 ascs 的 svf 粘ascs附在脂肪顆粒上, 不僅 可以分化成脂肪細(xì)胞, 促進(jìn)脂肪再生, 還可以促進(jìn)血管化的作用, 營養(yǎng)脂肪細(xì)胞。 提高了脂肪細(xì)胞的數(shù)量, 增加了脂肪細(xì)胞移植的成活 5 率。根據(jù)吉村浩太郎的報(bào)道 40 名受試患者中僅有 4 人出現(xiàn)了纖維囊或者鈣化, 其余患者均表示滿意。 本實(shí)驗(yàn)從臨床吸脂手術(shù)中獲取脂肪中提取出具有干細(xì)胞特性的一類細(xì)胞。自體顆粒脂肪移植是指通過吸脂手術(shù)將患者身體某部位多余的皮下脂肪組織吸出, 經(jīng)過純化、 藥物等相關(guān)處理后選擇完整的顆粒脂肪通過注

35、射的方式移植到需要進(jìn)行脂肪填充的部位, 以治療軟組織缺損或組織容量不足所導(dǎo)致功能障礙和形態(tài)不美, 包括面部萎縮、 乳房增大、 豐唇等。 而用自體顆粒脂肪填充軟組織的缺損或者容量不足, 較傳統(tǒng)的填充物質(zhì)如透明質(zhì)酸化合物等更接近于人體, 不但降低了感染率, 避免了免疫反應(yīng)及排異反應(yīng)的發(fā)生, 而且脂肪顆粒組織來源豐富 , 容易獲得,手術(shù)創(chuàng)傷小, 因而術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率大大降低。 既然自體脂肪組織生物相容性好而且獲取簡便, 是臨床上常用的軟組織填充材料廣泛應(yīng)用于整形修復(fù)和美容為目的的軟組織增大。 那么如何提高移植脂肪組織的成活率是目前最為關(guān)注和需要解決的問- 1 -暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文題。 脂

36、肪組織供體及受體的選擇、 脂肪組織的獲取、 脂肪組織的處理、 保存環(huán)境及時(shí)間對脂肪組織的影響、 注射脂肪組織的方法及注射量等因素均可影響脂肪組織移植的成活率。目前我科已經(jīng)開始廣泛開展自體脂肪來源干細(xì)胞輔助脂肪移植技術(shù), 在具體操作過程中存在著影響其存活的能力的多種因素, 包括顆粒脂肪獲取方式, 抽吸脂肪的壓力、 顆粒脂肪體外的保存及其處理, 添加生長因子等等, 結(jié)合我科開展此項(xiàng)手術(shù)的情況, 本課題主要從顆粒脂肪體外冰凍保存及顆粒脂肪體外處理方法兩方面問題進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。自體顆粒脂肪移植在臨床應(yīng)用中, 常常需要分次移植或者少量多次移植, 特別是脂肪源性干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床后,富集干細(xì)胞需 cg

37、m p 標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室, 這有可能導(dǎo)致提取細(xì)胞和手術(shù)室不在同一單元,這無疑又增加了標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)的時(shí)間, 更增加了抽取脂肪的量和時(shí)間, 這無疑增加了顆粒脂肪體外停留的時(shí)間。 如果顆粒脂肪在體外能夠得到很好的保存而不喪失其絕大部分活力, 一次吸取大量顆粒脂肪后在不影響其活力的情況下分次移植, 或移植手術(shù)分次完成, 這樣不僅減少患者痛苦、手術(shù)室占用時(shí)間、 醫(yī)療的風(fēng)險(xiǎn)及費(fèi)用, 還可減輕醫(yī)生的勞動(dòng)負(fù)荷。 因此如何保護(hù)和提高顆粒脂肪在體外停留移植前的活性顯得非常重要。一般而言對于體外顆粒脂肪的保存, 多數(shù)學(xué)者采取低溫存儲(chǔ)的方法包括普通冰箱、 低溫冰箱及液氮罐的冷藏, 早在 1990 年, f o uri ne

38、r 等人就提出了冷凍后的脂肪組織移植效果與新鮮組織移植效果無明顯的差異, 隨后許多學(xué)者在脂肪顆粒低溫保 6 存這一問題上提出了自己的觀點(diǎn),a t i k 將體外的脂肪顆粒用冷凍干燥、甘油浸入及液氮三種方法保存相同時(shí)間后移植于小鼠頭皮下, 一段時(shí)間后取材進(jìn)行組織學(xué)檢測,甘油浸入及冷凍干燥保存的脂肪顆粒均出現(xiàn)了較多的空泡及纖維變性區(qū)域, 脂肪細(xì)胞明顯減少,而液氮保存的脂肪顆粒和新鮮脂肪顆粒組織學(xué)形態(tài)相近。7y osh i nu ra 等人將吸脂所得的顆粒脂肪在室溫保存 1,2,4,24 小時(shí),4°c 保存gpdh0,1,2,3 天和-80°c 保存 1 個(gè)月后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)、

39、油脂比例、 活性及提取脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞 (a scs ) 的效率進(jìn)行比較, 認(rèn)為室溫保存下 24 小時(shí)脂肪細(xì)胞破壞較前 4 個(gè)小時(shí)增大明顯, 4°c 保存隨著時(shí)間的增加脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞提 8 取效率降低。er di m 對不同溫度下保存體外脂肪顆粒展開研究,發(fā)現(xiàn) 4°c 是脂肪存儲(chǔ)最適合的溫度,其活性與新鮮脂肪顆?；钚韵喈?dāng),而-20°c 及-80°c 存儲(chǔ)的- 2 -暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文脂肪顆粒活性均降低。同時(shí)對于其他溫度的保存也有學(xué)者提出自己的觀點(diǎn),oren 9 等人 就提出-80°c 保存顆粒脂肪組織, 他們將洗滌去除多余

40、水分及脂滴的顆粒脂肪后放入-80°c 冰箱保存 2 周, 2 周后室溫 1 小時(shí)融化后注入裸鼠皮下, 對照組為將洗滌、 去除多余水分及脂滴的顆粒脂肪立即注射入裸鼠皮下, 15 周后處死裸鼠取材, 發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組及對照在重量、 體積及組織學(xué)參數(shù)方面均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, 該實(shí)驗(yàn)認(rèn)為-80°c 可以保存顆粒脂肪組織 2 周。 本研究正是在此基礎(chǔ)之上提出并以前人的工作為依據(jù), 通過組織形態(tài)學(xué)、 、 3-磷酸甘油醛脫氫酶 (gl y c e ral de hy d e-3- ph o spha t edehy d rogen a se gapdh )的活性、及提取脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(a

41、scs )的效率的對常溫不同時(shí)間段及 4保存不同時(shí)間段的顆粒脂肪進(jìn)行比較,從而確定 4保存體外顆粒脂肪的效果及得出脂肪組織有效活力的保存時(shí)間段, 保證了自體脂肪臨床應(yīng)用的有效性。顆粒脂肪純化是將裝有顆粒脂肪組織的 50ml 注射器至于試管架上,反復(fù)加入生理鹽水后靜置沉淀并用長針挑除纖維條索及灰白色脂肪粒, 排去下層水分, 然后置于離心機(jī)中離心, 收集中間層顆粒飽滿純黃色顆粒脂肪備用。 目的是去除多余的腫脹液, 其含有利多卡因、 腎上腺素等藥物, 國內(nèi)有研究證實(shí)利多卡因及 1/50000010腎上腺素均能夠明顯抑制脂肪顆粒的活性 , 同時(shí)去除脂滴及其混雜于脂肪中的纖維組織碎塊, 徹底去除其中的小

42、凝血塊。 具體方法 hl o w 、 ch a j c hi r 認(rèn)為, 在脂肪移植中, 純化抽吸所得的顆粒脂肪組織是必不可少的步驟, 離心后去除多余的腫脹液、纖維條索、 失活脂肪粒及脂滴能提高脂肪顆粒的數(shù)量及質(zhì)量。 而目前國內(nèi)外存在各種不同處理體外脂肪顆粒的方法,具體有洗滌離心法、單純離心法、洗滌靜置法、單純靜置法、洗滌靜置離心法及不純化等方法。離心法是將脂肪顆粒混合物經(jīng)過離心后去除下層多余腫脹液及上層脂滴收集中間層顆粒飽滿、 黃色的顆粒脂肪進(jìn)行移植。 該方法純化程度高, 可以去掉大部分多余液體及油滴, 使獲得的脂肪顆粒更加純凈。 靜置法主要是將顆粒脂肪靜置 1 小時(shí), 可見脂肪混合物分為上

43、、 中、 下三層, 去除上層脂肪細(xì)胞所釋放出的橘黃色脂滴及下層粉紅色的液體, 收集中層顆粒飽滿黃色顆粒脂肪備用。 此方法目前應(yīng)用較11 多,k uri t a m 等人通過研究后認(rèn)為離心速度過快對脂肪源性干細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞的完整性都有一定程度的破壞。 靜置后獲得的脂肪細(xì)胞活性比離心后獲得的脂肪細(xì)胞活性更好, 靜置懸浮法不但可以排除多余的水分等雜質(zhì), 而且更大程度地保護(hù)了- 3 -暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文脂肪顆粒的活性, 省去了顆粒脂肪洗滌步驟, 減少了手術(shù)過程中對其可能的損傷及12其污染。ro se 等人將靜置、洗滌及離心后所得顆粒脂肪組織進(jìn)行碘酸 - 希夫染色分析, 發(fā)現(xiàn)靜置法所得顆粒

44、脂肪組織細(xì)胞完整性均較洗滌及離心所得的好, 但是13 同時(shí)也證實(shí)靜置法純化率低, 時(shí)間長, 析出雜質(zhì)也不完全。 paul 等人將注射器抽吸的脂肪顆粒與吸脂機(jī)抽吸脂肪顆粒分別按體外不同處理方法分為 1)不做任何處理組 2)500g 離心 2m i n 組 3) 林格氏液洗滌組 4) 生理鹽水洗滌組 5) 林格氏液洗滌后 500 g 離心 2m i n 組 6) 生理鹽水洗滌后 500g 離心 2 m i n 組, 將各組處理后的脂肪顆粒分別注入裸鼠背部皮下,12 周后取材進(jìn)行重量、活性及組織學(xué)觀察分析, 認(rèn)為各組之間重量、活性及組織學(xué)觀察并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。盡管脂肪組織抽吸后純化處理是非常重要的

45、, 但是過多繁瑣的處理會(huì)不會(huì)影響脂肪組織的活性和移植后的成活率, 特別是會(huì)不會(huì)在繁雜的處理過程中增加病原菌污染的可能性, 那么是否可以通過其它更為簡便的處理方法既減少了操作步驟又達(dá)到了純化處理的效果, 同時(shí)還可避免增加病原菌污染的可能。 而對體外顆粒脂肪組織過多的處理必然影響其的活性從而影響手術(shù)后的效果, 所以本著處理少、 操作少、污染少的原則, 本研究通過建立裸鼠模型, 將不同方法處理的體外顆粒脂肪注射入裸鼠皮下, 飼養(yǎng)一段時(shí)間后取材進(jìn)行重量、 組織形態(tài)等研究, 從而得出既簡便又對顆粒脂肪影響較小的純化方法。 使得自體脂肪移植技術(shù)操作更加簡便又不影響手術(shù)后的效果。- 4 -暨 南大 學(xué)碩 士

46、學(xué) 位論 文第 一 部分 : 人 體脂 肪 源 性干 細(xì) 胞 的分 離 培 養(yǎng)及 鑒 定在過去整形及組織再造領(lǐng)域, 吸脂、 腹部整形等手術(shù)中人體脂肪組織常常作為手術(shù)副產(chǎn)品而被丟棄。2001 年,z uk 和他的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)并證實(shí),抽脂術(shù)獲得的脂肪組織中存在一群具有多項(xiàng)分化潛能、 間充質(zhì)來源的成體干細(xì)胞: 脂肪源性干細(xì)胞a di p o se -der i ve d st r om a l /s t em cel ls ,ascs ,隨著對脂肪源性干細(xì)胞的研究,不ascs少研究人員表明 具有來源豐富、 取材容易、 增殖迅速、 多項(xiàng)分化潛能、 低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用。 將脂肪源性干細(xì)胞與脂肪組織

47、一起應(yīng)用在臨床, 在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)采用酶消化法分離培養(yǎng)人脂肪來源干細(xì)胞, 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長方式、 形態(tài)等, 對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面分化抗原檢測, 及其成脂及成骨多向分化的能力。材 料 及方 法一 、實(shí) 驗(yàn)材 料及 試劑1、主要試劑鼠抗人 cd34-pe 美國 bd 生物科技公司鼠抗人 cd45-pe 美國 bd 生物科技公司cd29-pe mi lt eny i鼠抗人 德國 生物科技公司鼠抗人 cd44-f it c 德國 mi lt eny i 生物科技公司鼠抗人 cd59-f ict 德國 mi lt eny i 生物科技公司鼠抗人 cd105-f ict 德國

48、 mi lt eny i 生物科技公司鼠抗人 hl a-dr-pe 德國 mi l t e ny i 生物科技公司胎牛血清 gi bc o 公司,美國dmem 培養(yǎng)液 低糖 gi bc o 公司,美國胰蛋白酶 gi bc o 公司,美國型膠原酶 gi bc o 公司,美國2、主要儀器bd流式細(xì)胞儀 美國 生物科技公司- 5 -暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文co 培養(yǎng)箱 a l p ha 生物公司2細(xì)胞超凈工作臺(tái) 安泰公司ol y mpus倒置顯微鏡 公司3、試劑的配制pbs nac l g k cl g na hpo 1.44g, kh po 0.24g, 加的配制: 8 , 0.2 , 2

49、24 4去離子水至 1l,調(diào)節(jié) ph 值至 7.2,容量瓶定容至 l000ml,分裝入瓶,經(jīng) 1.0345×10 pa 高壓蒸 汽滅菌 20min,冷卻后 4保存?zhèn)溆谩?.1% i 型膠原酶溶液:0.001g i 型膠原酶,1g dmem 培養(yǎng)液低糖,消化脂肪組織前 36水浴預(yù)熱 10 分鐘預(yù)備。4%甲醛:將工業(yè)用 40%甲醛與蒸餾水以 1:9 配制成 4%濃度甲醛。4、實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科,再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。二 、實(shí) 驗(yàn)方 法1. 細(xì)胞分離1脂肪組織獲取: 5 例腹部及大腿內(nèi)外側(cè)吸脂術(shù)女性 (24-38 歲) 患者。 脂肪組織獲取后無菌條件下密封后送無菌細(xì)胞

50、操作房。2去除脂肪組織中肉眼可見的血管及纖維條索成分。33眼科剪將體積超過 1 m m 的脂肪組織剪碎。4 無菌 pbs 液反復(fù)沖洗脂肪組織 3-5 次,直至脂肪組織呈金黃色。5 1:1 加入已預(yù)熱的 0. 1% i 型膠原酶, 37恒溫?fù)u床下消化, 直至脂肪組織呈乳糜狀取出。6 300g 離心力下離心 10 分鐘, 棄上清及未完全消化完的脂肪組織, 留試管底部貼壁細(xì)胞,加入 10%fb s 的 dm em 培養(yǎng)液(低糖)輕輕吹打后再次 300g離心力下離心 10 分鐘,棄上清留試管底部貼壁細(xì)胞。7 用含 10%fb s 的低糖 dm em 重懸細(xì)胞沉淀。8 100 目尼龍篩網(wǎng)過濾。9 用含

51、10%fb s 的 dm em 培養(yǎng)液(低糖)原代培養(yǎng)。- 6 -暨 南大 學(xué)碩 士學(xué) 位論 文10 48h 后首次更換培養(yǎng)液,以后每隔一天更換一次培養(yǎng)液,用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況。1 1 80% 0.25%待細(xì)胞 以上匯合后, 胰酶消化后傳代培養(yǎng)。2. 細(xì)胞培養(yǎng) :dm em p0以 液 (低糖) 體外培養(yǎng)細(xì)胞, 此細(xì)胞為原代細(xì)胞 ( ) , 分別于培養(yǎng)后第 2d、5d 更換培養(yǎng)液,培養(yǎng)至細(xì)胞 80% 融合后以 0. 25% 胰酶消化,傳代。3. 流式細(xì)胞儀( f luor escence-activat ed cel l sor tin g ,f a cs )細(xì)胞表型檢測 :分別選取第

52、 1 代 (p1 ) 細(xì)胞進(jìn)行 f a cs 檢測。 選取 cd44 、 cd45 、 cd59 、 cd105 、cd34 、 cd29 、 hl a-dr 進(jìn)行檢測。 0. 25% 胰酶將貼壁細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞。 室溫下離心(400g,5m i n ) 。pbs 重懸細(xì)胞。1 號(hào)管加入 20l 對照試劑,其余試管分別加入 cd44 、 cd45 、cd59 、cd29 、hl a-dr 各 20 l ,每管分別加入細(xì)胞懸液100 l (106 細(xì)胞) , 室溫下孵育 30m i n 。 然后用 pbs 洗滌 2 次, 室溫下離心 (400g,5m i n 300l pbs 10, 000) ,去上清后加入 后上機(jī)。計(jì)算 個(gè)細(xì)胞,記錄標(biāo)本中陽性細(xì)胞百分比。4.細(xì)胞成骨誘導(dǎo)與細(xì)胞染色觀察 :細(xì)胞培養(yǎng)至第二代細(xì)胞(p2 )時(shí),培養(yǎng) 7d 后去除原培養(yǎng)液,換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(低糖 dm em 液、1m 地塞米松、10%fb s 、50m 抗壞血酸、100m- 甘油磷酸鈉) 。 連續(xù)培養(yǎng) 2 周, 去除上清, pbs 洗滌 3-5 次, 4% 多聚甲醛固定 10m i n ,pbs 洗滌 2 次, 以 10m g/m l 茜紅素染色 10m i n , 去染液, pbs