酵母各種雜交課件

1、酵母各種雜交酵母雜交技術(shù)2016-7酵母各種雜交相關(guān)知識： 1、順式作用元件：存在于基因旁側(cè)序列中能影響基因表達(dá)的序列。包括啟動子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等，作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控。2、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）：能直接或間接地識別或結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)。3、報告基因：是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因。酵母各種雜交4、cdna文庫：以mrna為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cdna ，各cdna分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆擴(kuò)增。這些在重組體內(nèi)的cdna的集合即cdna文庫。酵母各種雜交基本原理真核生長轉(zhuǎn)錄因子含有兩個結(jié)構(gòu)上可以分開的

2、、功能上也相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成的結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(ad)(activation domain) dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域(bd)(dna binding domain) 轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活因子 bd：識別dna上特定序列，轉(zhuǎn)錄激活域定位調(diào)控 基因的上游。 ad：與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體其他成分作用，從而啟動所調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。酵母各種雜交 兩個結(jié)構(gòu)域分開時仍具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有他們以適當(dāng) 途徑在空間上相互靠近時，才能具有轉(zhuǎn)錄因子活性，激活報告基因的表達(dá)。 酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報告基因的表達(dá)，探測蛋白-蛋白的相互作用。酵母雙雜交原理示意圖xdbdreporter

3、 genepreybaitadyexpressionuas酵母各種雜交酵母各種雜交ndna結(jié)合域（dna-bd）：n端1-147氨基酸,可識別并結(jié)合酵母半乳糖苷酶的上游激活序列(uas) 。n轉(zhuǎn)錄激活域（ad）：c端786-881氨基酸,通過同轉(zhuǎn)錄機(jī)制的其它成分之間的結(jié)合以啟動上游激活序列（uas）下游的基因轉(zhuǎn)錄。酵母轉(zhuǎn)錄因子gal4結(jié)構(gòu)特點 酵母各種雜交酵母各種雜交酵母雙雜交步驟1、構(gòu)建質(zhì)粒（誘餌蛋白不發(fā)生自激活）2、轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（本身不表達(dá)gal4）3、陽性篩選酵母各種雜交1.（1）bd-plasmid 靶基因(蛋白a基因)按正確的讀碼結(jié)構(gòu)和取向克隆在gal4的bd之后。 篩選標(biāo)志：trp

4、（2）ad-plasmid 蛋白b基因按正確閱讀框 克隆到gal4的ad片斷 之后。 篩選標(biāo)志：leu2 酵母各種雜交（1）雙載體轉(zhuǎn)化能合成亮氨酸和色氨酸。trp- -leu- -2. 兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母菌（hf7c）3.篩選觀察 （2）篩選蛋白a和蛋白b能相互作用的雙載體轉(zhuǎn)化子。trp- -leu- -his- -酵母各種雜交酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞cdna文庫文庫 誘鉺蛋白基因誘鉺蛋白基因多克隆位點多克隆位點dna-bd 載體載體 ad 載體載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞篩選平板篩選平板生長菌苔生長菌苔篩選平板篩選平板生長菌苔生長菌苔同一個三重篩選平板同一個三重篩選平板克隆（誘餌與靶蛋

5、白相互作用）克隆（誘餌與靶蛋白相互作用）鑒定鑒定-半乳糖苷酶半乳糖苷酶酵母各種雜交酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用：（1）發(fā)現(xiàn)新蛋白和蛋白的新功能（2）研究抗原和抗體的作用（細(xì)胞內(nèi)）（3）檢測已知蛋白質(zhì)之間的相互作用（4）確定未知蛋白之間的相互作用（5）確定基因治療中多肽類藥物的作用機(jī)理酵母各種雜交應(yīng)用舉例應(yīng)用酵母雙雜交篩選與 fam172a相互作用蛋白的研究實驗步驟：（1）誘餌質(zhì)粒構(gòu)建：擴(kuò)增誘餌蛋白基因與質(zhì)粒載體連接重組載體鑒定誘餌蛋白自我轉(zhuǎn)錄激活檢測：將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌株，若轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒的酵母菌落表達(dá)-半乳糖苷酶，則可使底物x-gal 變藍(lán)，說明存在自激活（假陽性），否則無自激活。酵母各種雜交（2

6、）人胎腦cdna質(zhì)粒構(gòu)建酵母各種雜交（3）酵母雙雜交篩選人胎腦 cdna 文庫人胎腦 cdna文庫轉(zhuǎn)化誘餌酵母菌及初步篩選: 菌液，分別涂布于培養(yǎng)基（a：leu-/trp-、b: leu-/trp- /his-），a平板上的克隆進(jìn)行計數(shù)，根據(jù)稀釋度計算轉(zhuǎn)庫效率（轉(zhuǎn)庫效率只有達(dá)到 1x107-1x108cfu/gdna以上才能進(jìn)行文庫的篩選，以保證不會丟失陽性克隆半乳糖苷酶克隆轉(zhuǎn)移濾紙實驗進(jìn)一步篩選: 從b: leu-/trp- /his-平板上挑取 35 個單克隆進(jìn)行 -半乳糖苷酶克隆轉(zhuǎn)移濾紙實驗，變藍(lán)色的為陽性克隆。酵母各種雜交（3）陽性雜交克隆的質(zhì)粒抽提及一對一驗證: 對上述篩選的陽性克隆

7、進(jìn)行質(zhì)粒抽提，再次進(jìn)行抗性篩選和質(zhì)粒抽提后，一對一與誘餌質(zhì)粒 p gb-fam172a共轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞 y190 驗證。（4）再次陽性者抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序及生物信息學(xué)分析: 利用 ncbi 對測序所得到的序列進(jìn)行 blast 比對分析。酵母各種雜交結(jié)果對 10個陽性克隆相應(yīng)的質(zhì)粒進(jìn)行測序后，通過 blast在 genbank數(shù)據(jù)庫中對應(yīng) 6個不同的基因，編碼6種已知的蛋白質(zhì)： rtcd1、 mocs2、a2m、kcnip1、btbd2和tox2，根據(jù)genbank數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)獲得了它們的功能信息。其中 a2m與糖尿病血管病變密切相關(guān)，也進(jìn)一步提示 fam172a參與了糖尿病大血管病變的發(fā)病。酵母

8、各種雜交n（1）用體內(nèi)實驗來研究蛋白質(zhì)的相互作用，方法精確，不受外界影響，易于操作; n（2）所有操作均在核酸水平進(jìn)行，無需純化大量的蛋白質(zhì)，可以精確測定蛋白質(zhì)的弱相互作用；n（3）運用范圍較大：酵母雙雜交系統(tǒng)中的誘餌蛋白可以是完整的蛋白質(zhì)，也可以是蛋白質(zhì)的一個功能區(qū)，可以大到一個完整的腫瘤抑制蛋白，也可以小到一個約22個氨基酸的多肽。酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點酵母各種雜交局限性1、它并非對所有蛋白質(zhì)都適用。 有其原理決定，融合蛋白的相互作用激活報告基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的，而表達(dá)的融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)能否正確折疊并運至核內(nèi)是檢測的前提條件。2、假陽性較多： 某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)。 如ad融合

9、靶蛋白有dna的特異 結(jié)合，則可單獨激活報告基因的表達(dá)。 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過其它的實驗手段來驗證。酵母各種雜交局限性3、陰性干擾：兩個蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測不出來。 蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。 某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確定位到胞核內(nèi)。4、融合蛋白的表達(dá)對細(xì)胞有毒性，應(yīng)選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。酵母各種雜交在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了酵母單雜交、酵母三雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究。酵母各種雜交酵母單雜交 酵母單雜交體系是借鑒酵母雙雜交體系

10、的基本原理，通過觀察酵母細(xì)胞內(nèi)報告基因的表達(dá)狀況，研究dna與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 酵母各種雜交酵母各種雜交酵母單雜交步驟n設(shè)計含目的基因（誘餌）和下游報告基因的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中。n 將文庫蛋白的編碼基因片段與gal4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cdna文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入同一酵母細(xì)胞中。n 若文庫蛋白與目的基因相互作用，可通過報告基因的表達(dá)將其篩選。酵母各種雜交酵母各種雜交單雜交優(yōu)點n實驗過程簡單，耗時短：能直接識別并找出與特異順式作用元件相結(jié)合的蛋白質(zhì)及其編碼序列，而不需通過制備純化蛋白或抗體等繁瑣的生化手段來建立這種相互作用關(guān)系；n酵母屬于真核生物，且蛋白質(zhì)處于自然構(gòu)象，避免了體外研究的不足

11、。酵母各種雜交單雜交局限性n與內(nèi)源性的表達(dá)激活因子發(fā)生相互作用；n假陽性：插入的靶元件有可能不需要轉(zhuǎn)錄激活因子就可以直接激活報道基因的表達(dá)；n假陰性：融合蛋白有毒性、不能穩(wěn)定地表達(dá)，錯誤折疊不能準(zhǔn)確定位于酵母細(xì)胞核內(nèi)、dna 結(jié)合位點被封閉；n酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白修飾缺乏；酵母各種雜交tf: 介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的第三種因子， 可以是蛋白質(zhì),dna,rna或小分子配體。兩個蛋白之間通過第三者發(fā)生相互作用，用來檢測蛋白質(zhì)與rna、蛋白、小分子配體間相互作用酵母三雜交技術(shù)酵母各種雜交應(yīng)用1、研究rna-蛋白質(zhì)間相互作用酵母各種雜交應(yīng)用2、研究小分子受體與蛋白質(zhì)受體間相互作用酵母各種雜交 在該系統(tǒng)中, 第三個雜交小分子為dex(地塞米松)-fk506 偶聯(lián)體, 利用已知的地賽米松受體和fk506 受體fkbp12 分別構(gòu)建ad 和bd 融合蛋白, 三種分子相互作用后, 成功的激活了報道基因的表達(dá);而當(dāng)單體fk506 分子引入時, 由于競爭性結(jié)合fkbp12 , 導(dǎo)致三元復(fù)合物無法形成, 幾乎完全抑制了報道基因的表達(dá)。舉例酵母各種雜交3、研究復(fù)雜的蛋白-蛋白間相互作用應(yīng)用酵母各種雜交 不能用來研究位于細(xì)胞核外的rna分子；