分子診斷技術的應用進展-張健

1、Journal of Cell Science 2003；116 （14）名稱主要用途簡并引物擴增法擴增未知基因片斷巢式PCR提高pcr敏感性、特異性，分析突變多重PCR同時檢測多個突變或病原反向PCR擴增已知序列兩側的未知序列，致產(chǎn)物突變單一特異引物PCR擴增未知基因組DNA單側引物PCR通過已知序列擴增未知cDNA原位PCR研究基因表達錨定PCR分析具備不同末端的序列5 5DNA分子被隨機切割成小片段體內克隆擴增電泳(每次電泳讀取一個堿基信息)第一個堿基是什么？第二個堿基是什么？第三個堿基是什么？芯片循環(huán)測序(每個芯片可以獲得長度超過106 bp的序列)循環(huán)測序模板引物制成polony芯片

2、體外接頭連接DNA分子被隨機切割成小片段ab聚合酶dNTPs熒光標記的ddNTP芯片循環(huán)測序1 芯片循環(huán)測序2芯片循環(huán)測序3圖1 傳統(tǒng)的Sanger測序法及新一代DNA測序技術工作流程圖。（a）高通量鳥槍Sanger測序法。首先基因組DNA被隨機切割成小片段分子，接著眾多小片段DNA被克隆入質粒載體，隨后轉化到大腸桿菌中。最后培養(yǎng)大腸桿菌提取質粒，進行測序。每一個測序反應都在只有幾微升的反應體系中完成。測序后獲得一系列長短不一的末端標記有熒光的片段，最后通過對每一個延伸反應產(chǎn)物末端熒光顏色進行識別來讀取DNA序列。（b）鳥槍循環(huán)芯片測序法。首先將基因組DNA隨機分割成小片段DNA分子，然后在這

3、些小片段DNA分子的末端連接上普通的接頭，最后用這些小片段DNA分子制成polony芯片。每一個polony中都含有一個小片段DNA分子的許多個拷貝。許多這樣的polony集合在一起就形成了polony芯片。這樣一次測序反應就可以同時對眾多的polony進行測序。然后與sanger法中一樣，通過對每一個延伸反應產(chǎn)物末端熒光顏色進行識別來讀取出DNA序列。重復上述步驟就能獲得完整的序列。雖然這些新一代測序儀以及芯片的實際制作過程似乎都和傳統(tǒng)的測序方法有很大的不同，而且各有特點（表3），但實際上它們背后的原理和技術都是非常相似甚至是相同的（圖1b）。新一代測序法首先也是將基因組DNA隨機切割成小片

4、段DNA分子，然后在體外給這些小片段分子的末端連接上接頭制成文庫，也可以使用配對標簽（mate-paired tag）制成跨步文庫（jumping libraries）。隨后可以通過原位polony（in situ polony，小詞典1）、微乳液PCR（emulsion PCR）或橋式PCR（bridge PCR）（圖5）等方法獲得測序模板。上述方法有一個共同點，那就是任何一個小片段DNA分子的PCR擴增產(chǎn)物都是在空間上聚集的：原位9 9一重要課題又再一次擺在了科研人員的面前。這一次，我們找到了一個非常簡單但是又很巧妙地方法。在高密度的反應芯片表面使用層流（laminar flow）加樣方式

5、，反應試劑會通過擴散作用很好地進入每一個反應體系，而且也可以用層流的方式洗去多余的反應試劑?，F(xiàn)在，所有的新一代測序儀都采用了這種層流加樣方法。為了將每個單獨的測序反應都分隔開來，我們一開始使用平板（芯片），不過在平板上平均每一平方厘米的面積上最多只能同時進行數(shù)百至數(shù)千個反應。但我們希望達到的是在每平方厘米的面積上同時進行100萬個測序反應，這樣才能令測序儀小型化，同時節(jié)省試劑并進行快速成像和測序。為了實現(xiàn)更高密度的測序反應，我們在平板上制作了很多小孔，將每個反應體系都安置在這些小孔中，這些小孔都足夠深，足以分隔每個反應體系。雖然這種方法極大提高了測序反應的密度，縮小了平板的面積，但是要達到我們

6、的要求還是需要60mm60mm大小的芯片才行。 針對圖像采集問題使用了商業(yè)化的天文學照相（astrological grade camera）器材，在電荷偶合裝置（CCD）的表面連接上光纖束（fiber-optic bundle）。這些光纖是錐形排列的，這樣可以將大范圍的光信號都傳輸?shù)紺CD表面上很小的一個范圍。采取下面兩個步驟，我們就可以制成含有高密度小孔的芯片：先將光纖束連接到類似于載玻片一樣的一次性芯片上，然后用酸蝕刻（acid etching procedure）技術在玻片的另一面打上小孔。這種酸蝕刻技術是根據(jù)制作生物傳感器的技術改進而來的。454公司制作的每張芯片上可以達到數(shù)百萬個小

7、孔，每一個小孔都是一個獨立的“反應站”，互不干擾，測序反應發(fā)出的光被連接在芯片上的光纖傳送到CCD記錄下來（圖4）。這種芯片就好像集成電路一樣一次可以同時處理數(shù)百萬個測序反應。這種芯片同樣也能被其它通過發(fā)光檢測技術的產(chǎn)品所使用。454測序儀也沒有像以前的96孔板焦磷酸測序儀那樣使用液態(tài)的試劑，而是將試劑和模板統(tǒng)統(tǒng)都吸附在一個個微珠上，然后把這些微珠一個個地放到芯片上的小孔中，每孔一個微珠。這種固定步驟不僅保證了每孔測序反應的獨立性，也極大地節(jié)省了試劑消耗費用。圖4 454測序儀技術應用簡介。（a）分離基因組DNA，隨即切割成小片段，每個片段兩端連接上接頭序列，并變性形成單鏈；（b）將（a）中制

8、成的單鏈分子與微珠連接，每個微珠連接上一條單鏈分子，然后將這些微珠在乳液中包裹成一個個油包水的小液滴，每個液滴中包含一個微珠，然后進行乳液PCR擴增，最后每個微珠上都會攜帶有上千萬條待測模板分子；（c）打破液滴，收集微珠，然后將微珠放置到芯片上的小孔中，每個小孔中一個微珠；（d）在每個小孔中置入吸附有焦磷酸測序反應所需酶的小微珠；（e）微珠置入前的芯片圖像；（f）454測序儀主要包括以下幾個部分：（i）液體試劑供應裝置；（ii）反應池；（iii）光線探測成像系統(tǒng)和計算機控制系統(tǒng)。abcdiiiiiief2121最后，需要考慮的當然是價格因素，各個新一代測序儀的費用都不相同，作為消費者，當然希望

9、各個測序儀生產(chǎn)廠家之間的競爭更加激烈一點。單純比較每個堿基的測序費用是一個不錯的選擇方法，不過有時這也會誤導我們，比如準確率更高的方法當然費用會高一些。表11 新一代測序技術的應用應用范圍應用舉例全基因組測序（Complete genome resequencing）人類個體基因組多態(tài)性及突變的全面檢測約化表示測序法（Reduced representation sequencing）大規(guī)模多態(tài)性檢測靶向再測序（Targeted genomic resequencing）靶向多態(tài)性及突變檢測末端配對測序（Paired end sequencing）遺傳及獲得性結構變異檢測環(huán)境基因組測序（Met

10、agenomic sequencing）傳染性及共生菌群檢測轉錄組測序（Metagenomic sequencing）定量基因表達及選擇性剪切；轉錄注釋；轉錄SNPs或體細胞突變檢測小RNA測序（Small RNA sequencing）microRNA表達譜酸性亞硫酸鹽標記DNA測序（Sequencing of bisulfite-treated DNA）基因組DNA中胞嘧啶甲基化模式的測定染色質免疫沉淀測序（ChIP-Seq）全基因組蛋白質與DNA相互作用圖譜核酶片段及測序（Nuclease fragmentation and sequencing）核小體定位分子條碼（Molecular

11、barcoding）多個體來源樣品的多通路測序5. 總結過去幾年間，新一代測序技術獲得了突飛猛進的進展，同時有好幾款使用大規(guī)模平行循環(huán)芯片測序技術的測序儀得到了廣泛的應用。這幾款測序儀雖然使用的技術有所差異，但是在測序數(shù)據(jù)的質量和數(shù)量方面都有著同樣的特征，因此也都面臨著同樣的試驗設計、數(shù)據(jù)分析和注釋的問題。不過，這些新一代測序儀將以往的測序費用降低了好幾個數(shù)量級。鑒于此，以前只有大型測序中心才能夠開展的項目，現(xiàn)在在小型實驗室里也能順利進行了。由于新一代測序儀的出現(xiàn)，測序研究領域也開始升溫，有些研究團隊正在努力開發(fā)新的測序技術希望能夠取代現(xiàn)有的新一代測序儀。按照目前的發(fā)展速度，我們很難估計幾年之后的情況。不過，能夠預計的是，下、下一代或者說是第三代測序儀一定會像十年前的芯片技術一樣，迅速地普及開來，從而成為常規(guī)的技術。希望人們不僅關注測序技術本身的發(fā)展，更加關注如何利用測序技術來揭開生物學和醫(yī)學上的眾多謎團。原文檢索：Jay Shendure & Hanlee Ji. (2008) Next-generation DNA sequencing. Natur