Illumina光纖微珠芯片技術(shù)

1、 Illumina BeadArray Technology & Application Illumina光纖微珠芯片技術(shù)光纖微珠芯片技術(shù)及應(yīng)用及應(yīng)用 邱亞靜邱亞靜2021-10-29內(nèi)容內(nèi)容第一部分：光纖微珠芯片技術(shù)第一部分：光纖微珠芯片技術(shù)第二部分：基因表達(dá)研究第二部分：基因表達(dá)研究第三部分：基因分型第三部分：基因分型SNP研究研究第四部分：最新技術(shù)第四部分：最新技術(shù)2021-10-29基因芯片的基本原理基因芯片的基本原理基因芯片又稱DNA微陣列（microarray），把大量已知序列探針集成在一個基片上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號來檢測信息2021-10-29*基

2、因芯片的制作基因芯片的制作點(diǎn)樣法原位合成2021-10-29基因芯片制備基因芯片制備原位合成法，原位合成法是基于組合化學(xué)的合成原理,它通過一組定位模板來決定基片表面上不同化學(xué)單體的偶聯(lián)位點(diǎn)和次序。原位合成法制備DNA芯片的關(guān)鍵是高空間分辨率的模板定位技術(shù)和固相合成化學(xué)技術(shù)的精巧結(jié)合。 點(diǎn)樣法?；蛐酒c(diǎn)樣法首先按常規(guī)方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫，然后通過特殊的針頭和微噴頭, 分別把不同的探針溶液，逐點(diǎn)分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不同位點(diǎn),并通過物理和化學(xué)的結(jié)合使探針被固定于芯片的相應(yīng)位點(diǎn)。 2021-10-29Peter J. Russell, iGenetics: Copy

3、right Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.原位合成原位合成 2021-10-29Peter J. Russell, iGenetics: Copyright Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.2021-10-29Peter J. Russell, iGenetics: Copyright Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.2021-10-29原位合成技術(shù)

4、原位合成技術(shù)可達(dá)很高的密度合成過程中大量不完全片斷殘留在基片上探針序列不能太長，一般為25bp2021-10-29點(diǎn)樣法點(diǎn)樣法2021-10-292021-10-292021-10-29點(diǎn)樣技術(shù)點(diǎn)樣技術(shù) 片斷長度不受限制需要預(yù)先準(zhǔn)備大量的核苷酸點(diǎn)的大小，間距較難控制 2021-10-29新一代芯片技術(shù)新一代芯片技術(shù) 光纖微珠芯片光纖微珠芯片 Screening Unlabeled DNA Targets with Randomly Ordered Fiber-Optic Gene Arrays, Steemers, F.J., Ferguson, J.A., Walt, D.R., Natur

5、e Biotechnology,18, 91-94, 2000. Techview: Molecular Biology. Bead-Based Fiber-Optic Arrays, Walt, D.R., Science, 287, 451-452, 2000 Decoding Randomly Ordered DNA Arrays, Kevin L. Gunderson, Genome Research, 14: 870-877, 2004.2021-10-291.微珠微珠3.1 um無孔無熒光硅珠每個微珠單獨(dú)質(zhì)控光纖微珠芯片光纖微珠芯片-技術(shù)原理技術(shù)原理有效的反應(yīng)表面積和體積比有效的反

6、應(yīng)表面積和體積比低低/無背景無背景大小均一大小均一2021-10-29Oligator 合成工廠合成工廠2. 寡聚核苷酸探針寡聚核苷酸探針光纖微珠芯片光纖微珠芯片-技術(shù)原理技術(shù)原理96 孔板全自動化合成LIMS 控制所有過程年生產(chǎn)能力 20 million (20-mer) 嚴(yán)格的 QC 系統(tǒng)OD260 檢測產(chǎn)量MALDI-TOF 質(zhì)譜檢測UV 毛細(xì)管電泳實(shí)時數(shù)碼色彩監(jiān)控2021-10-292. 寡聚核苷酸探針寡聚核苷酸探針3 End5 End50 mer 探針探針合成探針合成探針23 mer 地址序列地址序列光纖微珠芯片光纖微珠芯片-技術(shù)原理技術(shù)原理73mer35合成方向合成方向2021-1

7、0-2923mer50mer 探針探針3 End5 End探針與微珠連接探針與微珠連接光纖微珠芯片光纖微珠芯片-技術(shù)原理技術(shù)原理2. 寡聚核苷酸探針寡聚核苷酸探針每個微珠上連接每個微珠上連接100萬左右萬左右相同相同的探針的探針2021-10-29Key Technology Elements: Bead ChemistryHow do we make our Beads ? A three step process! Raw BeadsSilanization produces a general coupling molecule an amineTrimethoxy amino prop

8、yl silaneVery stable compared to other techniquesActivationPrepares the bead to attach the OligoCyanuric ChlorideImmobilization of DNAComplexityDiscrete reactions96 Well microtiter plateNH2OHNNNNHClCl2021-10-29每種(微珠+探針)單獨(dú)合成并 QC不同種微珠混合在一起形成 微珠池微珠池 (1624 24,000+種微珠)2. 寡聚核苷酸探針寡聚核苷酸探針光纖微珠芯片光纖微珠芯片-技術(shù)原理技術(shù)

9、原理高雜交特異性高雜交特異性全長序列探針全長序列探針定制靈活定制靈活100%質(zhì)量檢控質(zhì)量檢控QC2021-10-29Key Technology Elements: Bead ProductionSynthesis of OligosActivated Bead Plates+Oligo Plates Gilson 96 Tip RobotOvenPooled Bead SetQC2021-10-29acid etchstrandcladdingstrandcorephoto-resistsiliconwaferplasmaetchingcleaningOptical fiber3 m bea

10、ds in wells3.芯片的組裝芯片的組裝光纖微珠芯片光纖微珠芯片-技術(shù)原理技術(shù)原理2021-10-29Key Elements: Random Bead AssemblyMixture of Different Bead Types6x2 Whole Genome Bead ChipBead Pool is pipetted on the SubstrateNo Information of Bead Identity and location on Array2021-10-29將微珠池內(nèi)微珠倒入蝕刻光纖，微珠無序自組裝 進(jìn)入小孔，每根光纖上帶一個微珠每種微珠大約有 30 個重復(fù)3.芯

11、片的組裝芯片的組裝光纖微珠芯片光纖微珠芯片-技術(shù)原理技術(shù)原理消除系統(tǒng)隨機(jī)誤差消除系統(tǒng)隨機(jī)誤差高重復(fù)性高重復(fù)性微珠之間間距均一微珠之間間距均一2021-10-29光纖束光纖束-微珠微珠3.芯片的組裝芯片的組裝光纖微珠芯片光纖微珠芯片-技術(shù)原理技術(shù)原理傳統(tǒng)芯片圖2021-10-29Decoder hybridization 1Decoder hybridization 22021-10-294.芯片解碼芯片解碼光纖微珠芯片光纖微珠芯片-技術(shù)原理技術(shù)原理2021-10-29 Gunderson et al. (2004) Decoding randomly ordered DNA arrays.Ge

12、nome Research 14, 870-877.4.芯片解碼芯片解碼光纖微珠芯片光纖微珠芯片-技術(shù)原理技術(shù)原理2021-10-29Key Elements: DecodingStrategy Expands Exponentially指數(shù)級解碼指數(shù)級解碼XY = total number of codesX = total number of colors or statesY = total number of hybridization stagesSingle IllumiCode StrategyExample: 38 = 6,561 48= 65,53624 mer ICode2

13、021-10-29每張每張芯片上每個每個微珠每個每個特性都被質(zhì)控(100%QC)位置和強(qiáng)度控制有多少重復(fù)小部分不合格地被撿出是Illumina 出廠前的生產(chǎn)步驟每個芯片在出廠前已通過解碼和質(zhì)控解碼 CD 隨芯片送至用戶處4.芯片解碼芯片解碼光纖微珠芯片光纖微珠芯片-技術(shù)原理技術(shù)原理2021-10-29Key Elements: Decoding Quality Metrics% of Beads Loaded: 98% of Beads Decoded: 98%Bead Type Representation: 30 Error Rate: 0.05%Presence of all Bead

14、TypesDecoding Intensities of each stageFocus MetricsAll parameters monitored in real time2021-10-29Key Elements: Decoding Quality Metrics2021-10-29BeadArray FormatsSentrix Array MatrixSentrix BeadChip Formats Human-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-12021-10-29BeadArray FormatsSentrix Array Matri

15、xSentrix BeadChip Formats Human-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-1GoldenGateTM Genotyping and DASLTM “Universal Array”2021-10-29BeadArray FormatsSentrix Array MatrixSentrix BeadChip Formats Human-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-1Focused GEX Sets(Standard Samplers, Custom BeadPools)2021-10

16、-29BeadArray FormatsSentrix Array MatrixSentrix BeadChip Formats Human-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-1Whole GenomeGene Expression2021-10-29BeadArray FormatsSentrix Array MatrixSentrix BeadChip Formats Human-6HumanRef-8Universal-16Custom-16InfiniumInfiniumTM Whole Genome Genotyping2021-10-29B

17、eadStation掃描系統(tǒng)掃描系統(tǒng) 激光共聚焦掃描系統(tǒng) 高分辨率, 0.8 micron 雙色激光 at 532 & 635 nm光纖微珠芯片光纖微珠芯片-技術(shù)原理技術(shù)原理超高分辨率超高分辨率全自動化定位全自動化定位,掃描掃描2021-10-29BeadArray ReaderConfocal laser scanning systemSub-micron, 0.8 micronTwo lasers 532, 635 nmSupports Cy3 & Cy5 imagingAuto-focusing, centering and tilting without photo bleachingSupports genotyping, gene expression applicationsScans both Array Matrix and BeadChip microarrays2021-10-29Sentrix Bead Chip: Analytical Fluorescent Image2021-10-29User SuppliedDual-block 96-well thermal cycler w/heated lid2 plate centri