環(huán)境生物技術(shù)(CRISPR張鋒)

1、CRISPR“上帝的剪刀” 領(lǐng)軍人物No object is mysterious. The mystery is in our eyes.張鋒張鋒目錄目錄/contents/contents生平經(jīng)歷生平經(jīng)歷基因編輯技術(shù)基因編輯技術(shù)CRISPR 系統(tǒng)系統(tǒng)專利之爭(zhēng)專利之爭(zhēng)生平經(jīng)歷生平經(jīng)歷01011983年出生于河北石家莊，美國(guó)麻省理工學(xué)院年出生于河北石家莊，美國(guó)麻省理工學(xué)院博士，是當(dāng)今最為人所關(guān)注的華人生物學(xué)家之博士，是當(dāng)今最為人所關(guān)注的華人生物學(xué)家之一。從諾貝爾獎(jiǎng)有力得主，福布斯一。從諾貝爾獎(jiǎng)有力得主，福布斯40歲以下最歲以下最有成就的有成就的40人，自然雜志十大科學(xué)人物，人，自然雜志十大科學(xué)

2、人物，到華裔新移民和到華裔新移民和80后。張鋒這個(gè)并不出彩的名后。張鋒這個(gè)并不出彩的名字，因?yàn)樽?，因?yàn)镃RISPR-CAS9站到了時(shí)代和輿論的風(fēng)口站到了時(shí)代和輿論的風(fēng)口浪尖。浪尖。這項(xiàng)被譽(yù)為這項(xiàng)被譽(yù)為“上帝的剪刀上帝的剪刀”的技術(shù)讓人們擁有的技術(shù)讓人們擁有了前所未有的基因編輯能力，讓我們有機(jī)會(huì)以了前所未有的基因編輯能力，讓我們有機(jī)會(huì)以低廉的成本精確的替換掉病變的低廉的成本精確的替換掉病變的DNA片段，從片段，從而達(dá)到治療或者緩解疾病的目的而達(dá)到治療或者緩解疾病的目的。 也許因?yàn)閺氖螺^為前沿的計(jì)算機(jī)行業(yè)，張鋒的父母更能看到國(guó)內(nèi)教育的局限性。為了能讓他得到更好的教育，他的母親在1993年帶他移民到

3、了美國(guó)的愛荷華州。 在一節(jié)課上，老師給學(xué)生們播放了侏羅紀(jì)公園，從小就喜歡編程的他，從這個(gè)電影學(xué)到了，生物也許也是一個(gè)可以被編程的系統(tǒng)。 為此他參加了特長(zhǎng)班，與國(guó)內(nèi)特長(zhǎng)班不同的是，大多數(shù)的公立學(xué)校都會(huì)有自己的課后特長(zhǎng)班，一般面向的都是幼兒園到9年級(jí)的學(xué)生（也就是國(guó)內(nèi)的初中畢業(yè)）。高中之后的特長(zhǎng)班都會(huì)更加的有針對(duì)性也更專業(yè)，這時(shí)候的項(xiàng)目通常是由國(guó)家級(jí)的教育基金支持，并與當(dāng)?shù)卮髮W(xué)或者研究所或者其他教育機(jī)構(gòu)進(jìn)行接軌。 01 正是得益于這個(gè)項(xiàng)目，張鋒的輔導(dǎo)老師把他引薦到了他的第一位人生導(dǎo)師約翰利維（John Levy）的實(shí)驗(yàn)室。在這里，他利用病毒把水母中可以發(fā)光的基因注入到了一個(gè)人體黑素瘤細(xì)胞中，這是他

4、第一次把一個(gè)物種的基因轉(zhuǎn)移在另一物種上。這時(shí)的他還在讀高二。到斯坦福讀博士的張鋒遇到了他的另外一個(gè)重要導(dǎo)師，卡爾代塞爾羅思（Karl Deisseroth）。張鋒陰差陽(yáng)錯(cuò)的進(jìn)入了這個(gè)剛剛成立的實(shí)驗(yàn)室，成為了他的首個(gè)學(xué)生。就是這樣的一對(duì)組合，在幾年后，創(chuàng)造出了一個(gè)可以用光來精準(zhǔn)的控制腦神經(jīng)的全新技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)因?yàn)槠淇赡軒淼木薮笥绊懚蛔匀浑s志選為年度技術(shù)。斯坦福畢業(yè)的張鋒想要研究一些更廣的問題。在試圖搞清某些疾病原理的時(shí)候，他發(fā)現(xiàn)這些疾病都和人的基因結(jié)構(gòu)有關(guān)。因而張鋒決定要做的是去“快速地，系統(tǒng)的去驗(yàn)證和找到基因病變的因果關(guān)系?！?203張鋒在博德研究所擁有了自己的實(shí)驗(yàn)室。就像眾多其他的實(shí)驗(yàn)室

5、一樣，他們通過使用TALES 和ZFN進(jìn)行著基因編輯研究。通常，他的一個(gè)學(xué)生需要用三個(gè)月的時(shí)間去準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)需要的道具。這對(duì)于張鋒來說，簡(jiǎn)直是不可接受的慢。 在2011年，一個(gè)來自加拿大拉瓦爾大學(xué)的教授在博德研究所進(jìn)行了一個(gè)關(guān)于CRISPR-CAS9技術(shù)的講座。這是張鋒第一次聽說到這個(gè)技術(shù)。敏感的張鋒意識(shí)到，這個(gè)一直被用在酸奶行業(yè)的CRISPR-CAS9技術(shù)具有搜尋和破壞特定DNA的特點(diǎn)，那么同樣的，它是否能被用在人類細(xì)胞的可能性？ 此時(shí)把研究重心轉(zhuǎn)移絕對(duì)算得上是一個(gè)大膽的冒險(xiǎn)，但是對(duì)于張鋒來說，這里卻有他想要的東西：伴隨著高風(fēng)險(xiǎn)的高回報(bào)。當(dāng)他的學(xué)生叢樂聽完張鋒的理由后，他理解了張鋒的激動(dòng)。原

6、來的TALES一直使用蛋白來進(jìn)行基因編輯，但是長(zhǎng)時(shí)間的準(zhǔn)備換來的卻是令人沮喪的高脫靶率，而CRISPR-CAS9所使用的RNA則使得這個(gè)過程變得更加的簡(jiǎn)單可控。 于是他和叢樂便對(duì)它展開了瘋狂的研究。張鋒的冒險(xiǎn)精神和遠(yuǎn)見在這里又一次得到了體現(xiàn)。當(dāng)時(shí)大多數(shù)科學(xué)家都會(huì)從簡(jiǎn)單的細(xì)菌開始熟悉這個(gè)技術(shù)，而張鋒選擇的則是直接在老鼠和人體細(xì)胞中做實(shí)驗(yàn)。他成功了。在2012年，他們?cè)贜ature雜志上發(fā)表了他們的研究成果，成為了CRISPR-CAS9真核細(xì)胞基因編輯領(lǐng)域發(fā)表最早、被引用數(shù)量最多的論文之一。從一名對(duì)有天賦的高中生，到生物實(shí)驗(yàn)室的研究員，到精準(zhǔn)控制神經(jīng)的光遺傳學(xué)創(chuàng)始人，再到CRISPR-CAS9基因

7、編輯的領(lǐng)軍人物。在這個(gè)清晰的成長(zhǎng)脈絡(luò)前,張鋒的成就變得不那么令人驚訝?；蚓庉嫾夹g(shù)基因編輯技術(shù)0202 基因編輯就是通過對(duì)細(xì)胞基因組中目的基因的一段核苷酸序列甚至是單個(gè)核苷酸進(jìn)行替換、切除，增加或者是插入外源的DNA序列，使之產(chǎn)生可遺傳的改變。 與射線或化學(xué)誘變劑導(dǎo)致的DNA隨機(jī)突變不同的是，基因編輯技術(shù)是定向基因編輯技術(shù)是定向改變基因的組成和結(jié)構(gòu)，具有高效、改變基因的組成和結(jié)構(gòu)，具有高效、可控和定向操作的特點(diǎn)?？煽睾投ㄏ虿僮鞯奶攸c(diǎn)。 雖然各種基因編輯技術(shù)的原理及作用方式并不相同，但它們的共同之處是基因編輯都建立在使目標(biāo)基因DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂(Double Strand Breaking, D

8、SB)的基礎(chǔ)上。因?yàn)镈NA分子單鏈斷裂或缺失后容易被細(xì)胞內(nèi)的各種修復(fù)機(jī)制所修復(fù)而不產(chǎn)生任何改變 。 從使基因發(fā)生定向改變這個(gè)角度而言，早期的基因編輯技術(shù)可以追溯到同源重組這種方法?；谕粗亟M的基因編輯被稱為基因打靶或基因靶向技術(shù)(gene targeting)，例如依賴大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的Rec A或酵母的RAD54重組酶，基因靶向技術(shù)可以對(duì)目標(biāo)基因或基因的部分序列進(jìn)行替換、刪除，或在細(xì)胞內(nèi)存在同源序列的情況下插入外源DNA序列。運(yùn)用同源重組對(duì)基因進(jìn)行編輯的方法已經(jīng)在微生物、植物和動(dòng)物中取得了成功缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：該方法的一個(gè)主要局限在于重組頻率低，約為104105。雖然對(duì)微生物及培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞系、甚

9、至對(duì)一些苔蘚植物如小立碗蘚來說，同源重組技術(shù)可以獲得滿意的基因編輯效率，但對(duì)高等植物或動(dòng)物，基于同源重組的基因靶向技術(shù)由于效率太低，在實(shí)踐上難以廣泛應(yīng)用 (Zinc Finger Nuclease, ZFN) 人工核酸酶ZFN可以算是第一種具有普遍適用性的基因編輯技術(shù)。我們知道，分子生物學(xué)中廣泛使用的工具酶主要是II型限制性核酸內(nèi)切酶，絕大多數(shù)情況下這些酶的切割位點(diǎn)位于其DNA識(shí)別序列之中。不過，IIS型的核酸內(nèi)切酶(如Fok I)則不同，其識(shí)別序列和切割序列相距9個(gè)核苷酸，并且切割和識(shí)別功能分別由酶蛋白的不同結(jié)構(gòu)域完成。人工核酸酶正是利用了IIS型核酸內(nèi)切酶的這一特點(diǎn)，在保留它的非特異的酶切

10、割功能結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，將其DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域用能夠識(shí)別特定核苷酸序列的、人工合成的結(jié)構(gòu)域取代，這樣就構(gòu)成了能夠根據(jù)人們的需要而識(shí)別特定DNA序列并進(jìn)行切割的人工核酸酶。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：一個(gè)突出的問題是所謂的脫靶效應(yīng)，即合成的核酸酶并沒有對(duì)預(yù)先設(shè)定的目標(biāo)DNA序列進(jìn)行識(shí)別和切割。出現(xiàn)這種情況的原因在于組成人工核酸酶的各個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)單元之間存在相互影響，即存在所謂上下文依賴(Context-dependant)，也就是說將不同鋅指結(jié)構(gòu)單位連接起來后，其DNA識(shí)別序列并不是它們單獨(dú)存在時(shí)分別識(shí)別的核苷酸組序列的簡(jiǎn)單相加。 (Transcription Activation Like Effector Nuc

11、lease) 在ZFN問世不久，另一種人工核酸酶TALEN也被開發(fā)出來。與ZFN一樣，TALEN也是利用一種對(duì)DNA分子特異識(shí)別的蛋白結(jié)構(gòu)與Fok I的酶切活性結(jié)構(gòu)域組合形成的。與ZFN不同的是，TALEN利用的是黃桿菌(Xanthomonas)的轉(zhuǎn)錄因子激活樣效應(yīng)因子(Transcription Activation Like Effector)中DNA序列識(shí)別模塊作為特異識(shí)別DNA序列的基礎(chǔ)。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：在編輯效率方面，TALEN雖然也還沒有達(dá)到理想的程度，但相對(duì)于ZFN還是有所提高，并且有更好的特異性，使其在醫(yī)療用途中更加安全，不過脫靶效應(yīng)仍然存在。(Clustered Regularl

12、y Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Proteins, CRISPR) 整個(gè)CRISPR/Cas9系統(tǒng)使用起來非常簡(jiǎn)單：只需要根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增spacer，再將其整合進(jìn)含有tracRNA和Cas9表達(dá)盒的載體，就完成了基因編輯載體的準(zhǔn)備工作。此外，為適應(yīng)真核生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，一般在設(shè)計(jì)編輯載體時(shí)要在Cas蛋白編碼序列一端或兩端加上核定位信號(hào)。目前很多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了專門用于基因敲除的CRISPR/Cas9載體。 對(duì)生物學(xué)領(lǐng)域的研究者來說，CRISPR的優(yōu)勢(shì)在于它能非常方便的對(duì)感興趣的基因進(jìn)行編輯使之產(chǎn)生突變，

13、從而極大的方便了闡明每個(gè)基因的功能。然而，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的專家更關(guān)注運(yùn)用該技術(shù)進(jìn)行基因治療的潛力。盡管目前還只是處于初始階段，但可以預(yù)料，CRISPR將給生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來難以估量的重要影響。體外治療體外治療為將病人體內(nèi)需要被改造的細(xì)胞取出，在體外進(jìn)行培養(yǎng)與改造，然后將改造后的細(xì)胞導(dǎo)入體內(nèi)。例子：將HIV攜帶者體內(nèi)的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞表面的CCR5受體進(jìn)行突變，然后導(dǎo)入體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這一做法能夠有效提高患者CD4陽(yáng)性T細(xì)胞數(shù)量與減輕HIV惡化程度。體內(nèi)治療為直接將改造材料注入患者體內(nèi)，可以是系統(tǒng)性地改造，也可以是局部的改造。例子：對(duì)于小鼠B型血友病的治療，通過體內(nèi)導(dǎo)入重組因子IX，小鼠病情得到了減輕。

14、體內(nèi)治療 CRISPR CRISPR系統(tǒng)系統(tǒng)0303為了研究某些疾病的原理，科學(xué)家們需要工具把基因拆開來研究，而這也就是基因編輯學(xué)的根本成因。在此之前，科學(xué)家們已經(jīng)成功利用TALES（類轉(zhuǎn)錄活化因子核酸酶）和ZFN（鋅指核酸酶）進(jìn)行基因編輯，然而高昂的成本，冗長(zhǎng)的準(zhǔn)備，和低下的效率讓這個(gè)領(lǐng)域一直處于行業(yè)邊緣。而CRISPR-CAS9技術(shù)的出現(xiàn)，則是徹底的顛覆。WhatWhat？HowHow？WhyWhy？資本的寵兒，疾病的克星，被夸上天的CRISPR系統(tǒng)到底是 ？特殊特殊DNADNA重復(fù)序列家族重復(fù)序列家族 （基因編輯器）（基因編輯器）一種蛋白一種蛋白一種基因一種基因編輯技術(shù)編輯技術(shù)重復(fù)規(guī)律性

15、間隔的短回文序列重復(fù)簇重復(fù)規(guī)律性間隔的短回文序列重復(fù)簇（一種免疫系統(tǒng)）（一種免疫系統(tǒng)）來源來源CRISPR/Cas9 是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA，是一種對(duì)付攻擊者的基因武器。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通過將入侵噬菌體和質(zhì)粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相應(yīng)的 CRISPR RNAs（crRNAs）來指導(dǎo)同源序列的降解，從而提供免疫性?？捎脕韯h除，添加，激活或抑制其它生物體的目標(biāo)基因。應(yīng)用應(yīng)用CRISPR-Cas 技術(shù)是繼鋅指核酸酶（ZFN）、ES 細(xì)胞打靶和 TALEN 等技術(shù)后可用于定點(diǎn)構(gòu)建基因敲除大、小鼠動(dòng)物

16、的第四種方法，且有效率高、速度快、生殖系轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)及簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，在動(dòng)物模型構(gòu)建的應(yīng)用前景將非常廣闊，是一種可以廣泛使用的生物技術(shù)。CRISPR-CAS9的來源及應(yīng)用px458載體crispr/ cas9 系統(tǒng) 質(zhì)粒 定點(diǎn)切割定點(diǎn)切割 CRISPR/Cas9通過對(duì)預(yù)設(shè)的DNA位點(diǎn)進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂（DSB, double strand break）。這種DNA的損傷可以啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制同源介導(dǎo)的修復(fù)同源介導(dǎo)的修復(fù)（HR,HR, homology-directed repairhomology-directed repair）基于同源重組的修復(fù)機(jī)制保真性高，但是發(fā)生概率低。在提供

17、外源修復(fù)模板的情況下，靶向核酸酶對(duì)DNA的切割可以將同源重組發(fā)生的概率提高約1000倍非同源末端連接途徑非同源末端連接途徑（NHEJNHEJ，Non-homologous end joiningNon-homologous end joining）此修復(fù)機(jī)制非常容易發(fā)生錯(cuò)誤，導(dǎo)致修復(fù)后發(fā)生堿基的缺失或插入（Indel），從而造成移碼突變，最終達(dá)到基因敲除的目的。CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，使得無需再使用相應(yīng)物種的ES細(xì)胞系就可以制備基因敲除模式生物010302優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 在構(gòu)建和使用時(shí)非常簡(jiǎn)單、方便 利用其可以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行打靶的優(yōu)勢(shì)，可以逐條甚至批量檢測(cè)人類或動(dòng)物基因組中的基因表達(dá)和

18、互作情況，以明確基因的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 彌補(bǔ)了傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)的諸多不足，使得基因的“任意編輯”變得越來越容易 成本較低缺點(diǎn)缺點(diǎn) 質(zhì)粒仍然較大，轉(zhuǎn)染難度相對(duì)較大 具有堿基識(shí)別偏好性，局限了基因編輯的運(yùn)用范圍 會(huì)導(dǎo)致不同基因位點(diǎn)編輯效率不同。篩選仍然需要較大工作量。CRISPR-CAS9技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)一優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)二二三四四五五CRISPR-Cpf1只需一個(gè)協(xié)助只需一個(gè)協(xié)助RNA分子。分子。Cas9系統(tǒng)需要系統(tǒng)需要2個(gè)個(gè)RNA分子協(xié)助，分子協(xié)助，Cpf1只需要一個(gè)只需要一個(gè)RNA分子。分子。Cpf1酶分子量比酶分子量比Cas9小，進(jìn)入細(xì)胞更容小，進(jìn)入細(xì)胞更容易，編輯成功率會(huì)提高。易，編輯成功率會(huì)提高。Cpf1系統(tǒng)不同的識(shí)別序列令其基因編系統(tǒng)不同的識(shí)別序列令其基因編輯效果更好。輯效果更好。剪切位置與剪切位置與Cas9不同，選擇余地更大。不同，選擇余地更大。產(chǎn)生黏性末端，便于新產(chǎn)生黏性末端，便于新DNA序列插入。序列插入。專利之爭(zhēng)專利之爭(zhēng)0404美國(guó)總統(tǒng)奧巴馬簽署批準(zhǔn)美國(guó)發(fā)明法案，正式確定了美國(guó)專利法系統(tǒng)于2013年3月16日轉(zhuǎn)向誰(shuí)先申請(qǐng)誰(shuí)獲得專利的系統(tǒng)。加州大學(xué)伯克利分校向美國(guó)專利與商標(biāo)局提交了與CRISPR相關(guān)的專利申請(qǐng)。六月，杜德納和其合作伙伴卡彭蒂耶報(bào)告可以在試管中使用CRISPR-Cas9切割DNA的任意位置。20