實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)乙肝病毒DNA的臨床意義

1、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)乙肝病毒DNA的臨床意義 摘要 目的：對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定的472例HBVDNA結(jié)果進(jìn)行分析，以探討其臨床價(jià)值。方法：對(duì)472份臨床血清標(biāo)本用ELISA法進(jìn)行定性檢測(cè)，并依據(jù)乙肝兩對(duì)半定性結(jié)果進(jìn)行歸類分組，再用實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)。結(jié)果：92份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)標(biāo)本中有89份HBVDNA為陽性，陽性率為96.7，其PCR定量拷貝數(shù)為(3.23±1.45)×107ml；168份HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)標(biāo)本有118份HBVDNA陽性，陽性率達(dá)到70.2，PCR定量拷貝數(shù)為(4.65±

2、2.10)×105ml；32份HBsAg(+)、HBcAb(+)標(biāo)本中有11份HBVDNA為陽性，陽性率為34.4，PCR定量拷貝數(shù)為(1.92±1.54)×104ml；62份HBsAb(+)的標(biāo)本HBVDNA陽性2例，陽性率為3.2，PCR定量拷貝數(shù)為(5.45±1.14)×103；60份全陰性的標(biāo)本HBVDNA陽性1例，陽性率為1.7，PCR定量拷貝數(shù)為(2.36±1.12)×104ml。結(jié)論：PCR定量測(cè)定HBVDNA可以真實(shí)反映體內(nèi)乙肝病毒感染和復(fù)制及病毒載量情況，更有利于臨床治療和療效觀察。關(guān)健詞 實(shí)時(shí)熒光；PCR

3、；乙肝DNA乙型肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝攜帶者達(dá)5億之多，我國是乙肝攜帶者高于人群的10。急性乙肝中有20%會(huì)轉(zhuǎn)為慢性，進(jìn)而可能發(fā)展為肝硬化和肝癌，因此，準(zhǔn)確、迅速診斷對(duì)乙肝的治療和預(yù)后顯得極為重要。熒光PCR技術(shù)融合了PCR和DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，直接探測(cè)PCR過程中熒光信號(hào)的變化，而且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均在完全封閉的狀態(tài)下進(jìn)行，不需要PCR的后處理和電泳檢測(cè)，解決了PCR定量和防污染等問題，而且具有快速、準(zhǔn)確、特異等優(yōu)點(diǎn)。本文以472例血清標(biāo)本分別用ELISA法和實(shí)時(shí)熒光PCR法分別對(duì)乙肝標(biāo)志物和HBV進(jìn)行檢測(cè)，報(bào)告如下。1資料與方法

4、1.1血清標(biāo)本來源472份血清標(biāo)本均取自2005年1月至2005年10月我院門診及住院的患者。其中，男245例，女227例；平均年齡35.2歲。1.2血清標(biāo)本的采集采用滅菌的一次性帶蓋塑料管，清晨空腹抽取靜脈血5 ml，離心分離血清，-20 凍存?zhèn)溆?，集中檢測(cè)。1.3方法1.3.1試劑采用中山公司生產(chǎn)的乙肝兩對(duì)半試劑盒，用ELISA法分別對(duì)472例血清進(jìn)行HBV兩對(duì)半進(jìn)行檢測(cè)并依據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分組。分組如下：A：HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)(大三陽)；B：HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)(小三陽)；C：HBsAg(+)、HBcAb(+)；D：HBsA

5、b(+)；E：HBeAb(+)、HBcAb(+)；F：HBsAg(-)、HBsAb(-)、HBeAg(-)、HBeAb(-)、HBcAb(-)。1.3.2熒光定量PCR檢測(cè)HBVDNA含量采用深圳匹基公司博日熒光定量PCR系統(tǒng)，按照試劑盒說明書操作程序?qū)ι鲜鲅鍢?biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。1.3.2.1HBVDNA提取血清100 l加DNA提取液1 100 l,13 000 r/min離心10 min棄上清再加提取液 25 l,振搖10 s100 10 min13 000 r/min離心10 min，上清液備用。1.3.2.2擴(kuò)增取上清液2 l，加入盛有擴(kuò)增反應(yīng)液38 l(含引物，dNTPs，Taq酶及PC

6、R緩沖液)的PCR反應(yīng)管中，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為37 5 min；95 1 min；60 30 s。1.3.2.3使用博日實(shí)時(shí)熒光PCR定量DNA分析檢測(cè)儀，并根據(jù)純化HBVDNA建立的直線回歸方程，直接作HBVDNA定量分析和數(shù)據(jù)讀取，結(jié)果1.00×103 copyml為陰性。2結(jié)果實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果，見表1。表1實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果（略）3討論血清HBV標(biāo)志物(HBVM)的檢測(cè)給臨床診斷乙肝病毒感染提供了較便捷的診斷依據(jù)。在臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)由于病情的發(fā)展過程的結(jié)局的多樣性，尤其是肝功正常而體內(nèi)確實(shí)有病毒復(fù)制者的治療中，定量PCR檢測(cè)HBVDNA為HBV感染及其療效的

7、判定提供了一項(xiàng)重要指標(biāo)。診斷乙型肝炎及了解病毒復(fù)制狀態(tài)的檢測(cè)指標(biāo)主要包括兩部分：病毒DNA的表達(dá)物及其抗體應(yīng)答系統(tǒng)；病毒DNA。ELISA方法一直是臨床診斷HBV感染的傳統(tǒng)手段，它實(shí)際就是檢測(cè)病毒DNA的表達(dá)物及應(yīng)答系統(tǒng)1，直接探測(cè)PCR過程中熒光信號(hào)的變化，結(jié)果特異、準(zhǔn)確。本研究對(duì)92份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)標(biāo)本中有89份HBVDNA為陽性，陽性率達(dá)到96.7，其PCR定量拷貝數(shù)為(3.23±1.45)×107/ml，文獻(xiàn)報(bào)道有些出入2；168份HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)標(biāo)本有118份HBVDNA陽性，陽性率為70.

8、2，PCR定量拷貝數(shù)為(4.65±2.10)×105/ml，文獻(xiàn)報(bào)道基本一致3；32份HBsAg(+)、HBcAb(+)標(biāo)本中有11份HBVDNA為陽性，陽性率為34.4，PCR定量拷貝數(shù)為(1.92±1.54)×104/ml；62份HBsAb(+)的標(biāo)本HBVDNA陽性2例，陽性率為3.2，PCR定量拷貝數(shù)為(5.45±1.14)×103/ml；60份全陰性的標(biāo)本HBVDNA陽性1例，陽性率為1.7%，PCR定量拷貝數(shù)為(2.36±1.12)×104/ml。一般來說，乙型肝炎患者血清中HBsAg、HBeAg、HB

9、eAb(+)、HBsAg、HBcAb(+)和HBsAg、HBeAb、HBcAb(+)3種不同情況，其血清HBVDNA載量不同，反映體內(nèi)HBV復(fù)制的活躍程度不同，因而HBVDNA的含量變化與HBV血清標(biāo)志物的變化基本相一致。有些HBsAb陽性的血清標(biāo)本能檢出HBVDNA，這可能是體內(nèi)的HBV成為免疫或疫苗逃逸株，使體內(nèi)的HBsAb不能完全清除血中的HBV，提示這些患者體內(nèi)仍有HBV復(fù)制。由于HBVDNA的定量采用了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法，即使存在很微量的HBVDNA也能測(cè)出。本文同時(shí)發(fā)現(xiàn)有3例大三陽患者，其血清PCR為陰性，這種情況應(yīng)考慮是否HBV基因的S區(qū)發(fā)生有意義的點(diǎn)突變或插入、缺失突變4，而

10、導(dǎo)致PCR結(jié)果為陰性。有些單項(xiàng)HBeAb和HBcAb陽性的患者，可能其血中HBsAg濃度處于不能被檢出的低水平(低于ELISA法的檢測(cè)下限)或S區(qū)基因發(fā)生變異使HBsAg未被檢出，而PCR法具有很高的靈敏度，因此在這些標(biāo)本中HBVDNA有較高的檢出率。當(dāng)HBV的X區(qū)發(fā)生變異使HBV處于低水平復(fù)制5，患者的體液免疫對(duì)HBV處于低應(yīng)答狀態(tài)，血清中的HBsAg和HBcAb處于較低水平而未被檢出等情況下，也可引起HBV血清學(xué)標(biāo)志物陰性而HBVDNA陽性的結(jié)果。從上表結(jié)果還可看出，大三陽、小三陽患者血清中PCR結(jié)果拷貝數(shù)均較高，而HBsAb陽性或HBsAg陰性的標(biāo)本，即便PCR結(jié)果陽性，但其拷貝數(shù)也是很

11、低。綜上所述，大部分乙肝患者定量PCR檢測(cè)HBVDNA的結(jié)果與HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果一致，但由于受到HBV基因包括S區(qū)、前C區(qū)等部X發(fā)生變異的影響，可引起HBV呈低水平復(fù)制，血清中HBsAg未能被檢出或HBsAb不能有效清除血清中的HBV,血清中HBVDNA載量處于很低水平等，造成少數(shù)患者兩種檢測(cè)結(jié)果的不一致。本文檢測(cè)結(jié)果表明，定量PCR檢測(cè)HBVDNA在判斷體內(nèi)HBV是否在復(fù)制、復(fù)制的程度、HBV是否被清除，以及對(duì)HBV血清學(xué)標(biāo)志陰性肝炎患者的診斷等方面，均優(yōu)于HBV血清學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)，值得臨床應(yīng)用。參考文獻(xiàn)：1Saito T,Shinzawa H,Uchida T,et al.Quantitative DNA analysis of lowlevel hepatitis Bviremia in two patients with serologically negative chronic hepatitis BJ.J Med Virol,1999,58:325.2賴宏芳，付曉野，董玉琳，等.熒光探針定量PCR檢測(cè)HBVDNAJ.上海：上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)雜志，2000，15(1)：1819.3周美霞，張鈞，王田春.乙肝病毒DNA、前S1抗原及e抗原在慢性乙肝中的臨床意義J.臨床薈萃，2004，24(19)：13941396