細胞培養(yǎng)中常見的問題

1、細胞培養(yǎng)中常見的問題2006-11-23 15:53細胞中的顆粒到底是怎么回事？我的細胞總有顆粒，開始是細胞中有，后來細胞之間也好像有許多顆粒。好像是細胞碎片一樣。是什么東西??？是支原體污染嗎？這可是我剛買回來的細胞啊!我們實驗室也有這種情況，是不是黑的小碎片，有人說是細胞代謝產(chǎn)物，后來拿到高倍鏡下看還會動，就懷疑是污染了，也想問問大家到底是什么是黑色的小碎片。我沒注意到它會動，只是覺得不像是活的微生物。我覺得是由于某種污染或外界因素導致的細胞狀態(tài)變差，裂解出的東西。但是，是什么東西不清楚。 的確很常見在以前帖子見到說是“黑焦蟲”。長時間培養(yǎng)的很容易出現(xiàn)，我根據(jù)自己的經(jīng)驗估計是一種污

2、染，因為隨著黑點增多，本來生長旺盛的細胞逐漸停滯甚至死亡。而且我后來原代培養(yǎng)的幾批細胞并沒有發(fā)現(xiàn)，我懷疑有好多細胞系本身就是污染的。不過增加換液次數(shù)的情況下，好象一般不太嬌氣的細胞生長不是很受影響。以前聽很有經(jīng)驗的老師說黑焦蟲是國產(chǎn)血清的問題，可以有條件換進口血清試試，或者離心一下也可能能解決問題。那么所謂的“黑焦蟲”到底是什么東西啊？有誰知道？我培養(yǎng)的細胞也出現(xiàn)過此中問題，放到高倍鏡下看時有東西在動，但培養(yǎng)液不混濁，估計不是細菌污染，可能是血清問題，是支原體污染。我培養(yǎng)的細胞也出現(xiàn)過這樣的問題，我個人認為是一種支原體污染。國產(chǎn)血清是罪魁禍首，因為只要將細胞饑餓一下，不超過24小時，這種東西就

3、會瘋長我培養(yǎng)的細胞也有出現(xiàn)這中情況。但是并不影響細胞生長。應(yīng)該不是支原體污染最近，我復(fù)蘇細胞細胞的時候也發(fā)現(xiàn)過這樣的東西，盡管我用的是GIBCO的FBS，后來，每天換液之前洗幾遍后，就慢慢變少，現(xiàn)在沒了 細胞培養(yǎng)的細菌污染我們新建的細胞室。每周都會做清潔，用0。2%新潔爾滅消毒，照紫外。實驗前也會照至少30分鐘。培養(yǎng)基中加青霉素，鏈霉素?？墒桥囵B(yǎng)細胞時還是常有細菌污染，有時甚至分析不出原因。用培養(yǎng)瓶還好一點，用多孔板或平皿就更凄慘。我養(yǎng)的是哺乳動物細胞，不知各位有什么好的方法避免污染！謝謝！很可能是超凈臺無效了，或者培養(yǎng)基？  其實嚴格操作箱污染都難我們是新的超凈臺，不可能

4、失效。而且用同一瓶培養(yǎng)基，一瓶傳兩瓶，原始的一瓶污染，新傳的很好。所以我分析不出原因呀那么假如把原始的那瓶換新瓶養(yǎng)可以么？都污染了，我仍還來不及，那還敢換新瓶染菌有很多原因，因為整個細胞操作過程均要求無菌，所以看看操作是否規(guī)范，例如戴手套等。多半是環(huán)境因素，做點平板，操作時放在幾個地方，培養(yǎng)后看看長菌情況。消毒用新潔爾滅好象不是太有用。人是最大的污染源，不知你做好手部的消毒工作以及戴口罩沒有，其實，只要你操作的好，嚴格在靠近火的附近操作，污染的幾率是很小的。從你的描述中可以看出培養(yǎng)基應(yīng)該沒有問題，新的一瓶很好，老的一瓶污染，只有操作不當引起的，還需要加強練手。  求助！關(guān)于

5、細胞培養(yǎng)中的真菌污染！感激！先謝謝大家的幫助！現(xiàn)在細胞培養(yǎng)基里出現(xiàn)了很多白色和黑色的小點，有好長的時間了！細胞的形態(tài)看起來不太好，但是有些細胞也長的很好，如成纖維細胞，但是內(nèi)皮細胞就差很多！加大量的抗生素沒有效果！不知道是不是真菌污染，怎么鑒別！因為培養(yǎng)了很長時間都沒有出現(xiàn)真菌的菌絲，所以不能肯定是真菌！那些白色的小圓點有點象白色鏈球菌或鏈珠菌，但是不能確定！怎么樣才能判斷確定，改用什么辦法解決！謝謝大家的幫助！殺滅真菌聽說用兩性霉素，但從沒試過。真菌污染是件很麻煩的事，可能重新復(fù)蘇細胞是最好的辦法。同時該注意如何防止污染。我覺得如果是真菌污染，培養(yǎng)基會渾濁，是肉眼可見的渾濁。在這種情況下最好

6、趕緊將該瓶細胞扔掉，免得引起培養(yǎng)箱中的大規(guī)摸污染。在顯微鏡下，真菌是成念珠狀的，這時細胞界限不清。這可能是不規(guī)范操作引起的，安全起見還是將細胞室全面打掃一下，用新潔爾滅擦，紫外照！謝謝大家的幫助，因為實驗室以前從來就沒有這樣的污染，所以大家也沒有經(jīng)驗！現(xiàn)在就是不能確定是不是污染。我不可能把實驗室所有的細胞都扔掉，因為有好多人都在一起養(yǎng)不同類型的細胞！現(xiàn)在確實是問題，培養(yǎng)基也沒有渾濁，操作的時候已經(jīng)十二分的小心了！我想問一下，你看到的那些白色或黑色的圓點是在低倍還是高倍顯微鏡下？若培養(yǎng)基不混濁，可能真的是細胞狀態(tài)太差，沒有貼壁還縮成球狀。難道你們實驗室所有細胞都用一瓶培養(yǎng)基？只要將污染的扔掉就行

7、，沒必要都扔掉！兩性霉素！sigma在華美有分裝！但是濃度很小，關(guān)鍵還是環(huán)境問題！黑白圓點在100倍顯微鏡下有多大，是不是酵母菌小黑點和小白點是在200倍的顯微鏡下觀察所見，大小可能是細胞核的1/5到1/4左右！細胞狀態(tài)不好是因為跟以前培養(yǎng)的細胞來比較所得，細胞能貼壁，能生長，但是沒有以前的那么快，而且形態(tài)看的也不好！另外問一下sleevexz，酵母菌是什么樣的，怎么鑒別！還有一個問題就是，實驗室用的雙抗是從Gibco公司買過來的直接使用的液體，具體規(guī)格是100ml一瓶，Pelicillin-Streptomycin 一起，50倍的，要求儲存在20 C，但是有效期只到2002年9月，現(xiàn)在都已經(jīng)

8、差不多過期半年了，但是實驗室的老師都說沒有問題，可以用，現(xiàn)在大家就都是一直用這樣的抗生素在！你們說會不會是抗生素的問題的！  養(yǎng)細胞經(jīng)常無緣無辜的染菌？煩煩煩！我是一個新手，但已養(yǎng)細胞近半年，最近一段時間經(jīng)常染菌，有時是培養(yǎng)基，有時連原因都找不到，在實驗中我也非常小心，但結(jié)果總讓我傷心?，F(xiàn)在都有點神經(jīng)質(zhì)了，請各位指點你這個問題說大不大，說小也不小。說不大呢，七個字就可以回答你：嚴格按照無菌要求。說不小呢，這無菌要求的話匣子一打開太大。還是簡要吧：1.將試驗用品放入超凈工作臺用紫外線照射30分鐘；2. 照射30分鐘后，進入緩沖間，換滅菌的無菌衣，換專用拖鞋；3.手部用5的潔爾

9、滅浸泡2分鐘，進入潔凈區(qū)后，用75的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩；5.操作時盡量靠近火焰；6.裝培養(yǎng)基的瓶子等不要直接口向上，用一個架子斜放，瓶口朝向火焰；7.標準操作，不要讓無菌吸管到處碰來碰去；8.中途出入無菌室，再次操作時，一定要再次用75的酒精棉球消毒。一下也想不了那么多，具體的你再問吧。最好把你怎么操作的過程描述一遍，我們就好針對性的指出錯誤了。建議你把細胞室，好好清理一下，污染是這樣的，出現(xiàn)一次就比較麻煩，千萬別急。還有，你們的紫外燈沒有問題吧？非常感謝樓上的回信，在操作中我也嚴格按照無菌要求去做，因為操作臺是公用的，而其它同學很少染菌，我想主要問題應(yīng)在我身上，但是又

10、找不到主要原因。我一般是這樣操作的：紫外照后，用酒精棉檫拭手部開始操作，基本步驟是吸培養(yǎng)液到方瓶，再在方瓶中吹打混合，按比例傳代，有時吸管頭部碰在培養(yǎng)瓶口，有時吸管口棉花塞的太緊或太松不好用，有時原因都找不到，請各位指點。戴手套試試巴最好是涂片看看是什么菌？注意操作，吸管碰別處立即更換。污染是常有的事，也不必太給自己壓力，熟能生巧。你的滴管吸管進培養(yǎng)液瓶和細胞培養(yǎng)瓶前要在酒精燈上仔細烤一下，滴管不要反復(fù)用。其實無菌操作第一重要的就是你的超凈臺是不是還能用，濾網(wǎng)要及時清洗的。其次就是瓶口、滴管、移液器操作是過火的是否正確。還有一點很重要，手一定不能在任何瓶口上方經(jīng)過！從你操作的步驟來看，你的細胞

11、應(yīng)該是很好操作的。沒看到你要用消化液，這就減少了污染的機會。你用的吸管是自己做的嗎？經(jīng)常練練，熟能生巧，時間長了，你就知道如何控制所塞的棉花量了。（用牙簽或12號針頭等工具來塞比較方便，塞完后用火將露出的部分燒掉再滅菌，這樣就不會在上吸耳球的過程中，出現(xiàn)將棉花弄掉的情況），另外，你要勤剪指甲，不要戴首飾，吸管一周滅一次菌，不要沒用完老用。操作是導致污染的最主要原因根據(jù)本人的經(jīng)驗，操作是導致細菌污染的最主要原因。本人以前曾經(jīng)在一個相當嚴格的實驗室工作過，那里的細胞室的要求是按照外科手術(shù)室要求的，更衣，換鞋，洗手，酒精擦手，戴口罩、帽子，所有培養(yǎng)液中加雙抗，所有細胞操作器械專用；每天紫外燈照射40

12、分鐘后才允許進入。但是，就是這樣的條件，操作不好，一樣要污染?，F(xiàn)在本人工作的實驗室要求比那個實驗室差的天遠地遠，但是只要操作仔細了，一樣可以把最難養(yǎng)的細胞養(yǎng)好。本人曾經(jīng)參觀過一些名人進行細胞操作，也就是換上拖鞋，連工作服都不換就進細胞室，細胞一樣沒有問題。所以，最主要的是：工作服，尤其是袖口，消毒情況如何，袖口是否能夠扎緊。如果不能保證，不如索性把袖口挽起來，把手臂用酒精擦一遍（其實我本人連擦都懶得擦，一樣沒事）。操作時，滴管兩頭都要燒。還有一點很重要，就是滴管頭在加液體的時候，不要深入瓶口太多。在倒培養(yǎng)液的時候，可以拿起培養(yǎng)瓶直接倒，但是注意要倒干凈，瓶口沾的最后一滴液體千萬不可回流倒瓶內(nèi)。

13、還有一些基本的問題，比如瓶口要多燒一會，懷疑滴管有污染就一定要換。一旦細胞出現(xiàn)污染的跡象了，就一定要扔掉。如果實在想挽救，可以用一些高檔抗生素（醫(yī)院里給病人加藥后的藥瓶，用無菌鹽水涮涮就能用，濃度足夠），但要小心濃度太高細胞也會死亡。對付霉菌通常用飽和的硫酸銅溶液，放在培養(yǎng)箱的裝水盤中，細胞房的空調(diào)要用除濕的功能。如果不幸染上，要用84液擦培養(yǎng)箱，再用75%酒精擦。滅菌操作：在無菌箱內(nèi)每立方米用甲醛810毫升，高錳酸鉀5克，熏蒸45分鐘后接種在無菌箱中每立方米用甲醛810毫升、高錳酸鉀0.25千克，熏蒸45分鐘后接種，栽培種接種量按每瓶二級種接3040袋為宜。（一）常用消毒劑 現(xiàn)將常用的消毒藥

14、品及其配制、使用方法，介紹如下：1 35甲醛水溶液（HCHO）：又名福爾馬林，使蛋白質(zhì)變性。用于培養(yǎng)室、無菌室的滅菌。 20.1的升汞水（HgCL3）：能使蛋白質(zhì)變性，抑制酶類。0.1升汞配制方法是稱取升汞0.1克，    用少許酒精溶解，再加水至100毫升即成。用于無菌箱、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿四周表面以及手指的滅菌。 3石炭酸（C6H5OH），5濃度噴霧后，能使蛋白變性沉淀。石炭酸（苯酚）50毫升，加水950毫升配成。用于 工作服、實驗桌的滅菌。殺菌效果同升汞。 4高錳酸鉀（KMnO4）：氧化劑。0.1濃度能使蛋白質(zhì)與氨基酸氧化，失去酶的活性，用于消毒，能抑制或殺死

15、雜菌。 5乙醇（CH3CH3OH）：又稱酒精。消毒以75濃度的效果最好。它能使蛋白質(zhì)脫水變性。高濃度酒精會使蛋白質(zhì)很快脫水凝固，消毒作用反而減弱。 6新潔爾滅：0.25新潔爾滅用于無菌箱、無菌室的滅菌。一般新潔爾滅5原液50毫升；加水950毫升配成。 7漂白粉水：取漂白粉10克，加水140毫升配成。通常在使用前臨時配制，靜置12小時，取上清液噴射，進 行室內(nèi)消毒，每平方米用1升。 8藥皂：煤酚皂、硼酸皂等各種藥皂的水溶液，均可用于器具、橡皮塞及手指的消毒。 92硫酸銅溶液：用硫酸銅（膽礬）2克，加水至 100毫升加熱溶解配成。用于床架、木架等各種菌種架的消 毒。還可用5硫酸銅溶液。 100.5

16、波爾多液：先用硫酸銅1斤，溶于100斤水， 再用石灰1斤，加水100斤。然后等量混合起來即成。用于菌種架、段木的消毒。 11.多菌靈：用于殺滅真菌、半知茵。1：800倍拌料或 1：500倍噴灑均可。 （二）無菌箱及無菌室的消毒滅菌 無菌箱的消毒滅菌，可采取以下幾種方法： l用甲醛和高錳酸鉀混合熏蒸：一般每平方米需40甲醛10毫升、高錳酸鉀8毫升，進行熏蒸。使用時，先密閉門窗，量甲醛溶液盛入容器中、然后倒入量好的高錳酸鉀，人員隨之離開接種室，關(guān)緊房門，熏蒸2030分鐘即可。 20.1升汞水消毒：用0.1升汞水浸過的紗布或海綿進行指擦，或用噴霧器噴霧滅菌，使箱內(nèi)的上下左右都沾上升汞水，手也可用升汞

17、水消毒，并把袖子卷起來。噴霧后 2030分鐘，箱內(nèi)的雜菌和霧滴一起落到箱底被殺死，內(nèi)部的空氣就變得很清潔。 3紫外線照射滅菌：在無菌箱中裝一支200伏、3O瓦的紫外線燈管；每次開2030分鐘，就能達到空間殺菌的 目的。照射結(jié)束后，罩黑布半小時，以增強殺菌效果。 4石炭酸噴霧：在每次接種之前，用5石炭酸溶液噴霧，可促使空氣中的微粒和雜菌沉降，防止桌面微塵飛揚，并有殺菌作用。 5石灰揩擦：經(jīng)常用藥物熏蒸，易造成酸性環(huán)境，特別用甲醛和高錳酸鉀熏蒸長久，污染往往越來越嚴重，預(yù)防辦法可把各種藥品交替使用，過一段時間（約五周）用石灰擦洗一遍。實踐證明，這樣做效果很好。 無菌室消毒同無菌箱。 （三）無菌室的

18、使用規(guī)程 無菌室無固定程序，但按一般操作應(yīng)遵循如下規(guī)程： 1接種室內(nèi)和緩沖室內(nèi)使用前，用5石炭酸溶液噴霧。把所需要的器材搬入緩沖室清洗，等曬干后搬入接種 室，打開紫外線燈，照射殺菌。 2穿上工作服及無菌工作帽、鞋，然后用煤皂液洗手2 分鐘。進人接種室后，查驗器械是否放在一定位置。然后用 5石炭酸溶液重點在工作臺的上方和附近的地面上噴霧。然后退回緩沖室。還可給接種室門口地面灑一層石灰，進門時踩石灰可使鞋底保持無雜菌狀態(tài)。 3接種操作前，用70的酒精棉球擦手。進行無菌操作時，要嚴格認真，動作輕捷，盡量減少空氣流動。 4工作結(jié)束后，立即將臺面收拾干凈，不留殘物。然后用5石炭酸全面噴灑。 5操作時，注

19、意安全。如棉塞著火，用手緊握即可熄滅。如打破菌瓶，可用抹布沾5石炭酸，收拾到廢物桶 內(nèi)。每次的污染物應(yīng)小心放在盤內(nèi)，蓋嚴拿出室外深埋或燒掉。 （四）無菌室空氣污染情況的檢驗 定期檢驗無菌室空氣污染情況，對改進滅菌措施，提高成品率是非常必要的。常用方法步驟如下： 1平板檢驗法：用常規(guī)培養(yǎng)基，倒成平板，收入接種室。在事先熏蒸好的接種室，使用前半小時或1小時把供試的培養(yǎng)皿或試管打開，按預(yù)定時間蓋好培養(yǎng)皿或試管。留對照皿不打開。然后一起放入30的溫箱中培養(yǎng)48小時，檢查有無菌殖生長，并由菌落形態(tài)，判斷雜菌種類。一般要求平板培養(yǎng)基開蓋5分鐘，菌落不超過3個；敘面培養(yǎng)基開塞 30分鐘者，以不出現(xiàn)菌落為合格

20、。 2斜面檢驗法：將常用的瓊脂斜面培養(yǎng)基各取二管， 放入接種室，按無菌操作各將其中的一管的棉塞取出，放在滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)。經(jīng)過一定時間后，再將棉塞通過火焰，塞回試管，連同對照一起培養(yǎng)。經(jīng)48小時后，檢驗無雜菌生長。和上邊方法同。 3空氣污染情況檢驗：在接種過程中，人員的出過、器材的搬放、接種操作的動作等原因造成空氣污染，檢驗方法是在準備工作結(jié)束后，接種操作開始時，按上述方法打開培養(yǎng)皿蓋子或試管塞，經(jīng)5分鐘、30分鐘或直到工作結(jié)束時再蓋好，以檢驗在不同的使用時間內(nèi)，空氣污染的程度。 如霉菌較多時；可先用5石炭酸全面噴射后，再用甲醛熏蒸。如細菌較多時，可采取用乳酸和甲醛交替熏蒸的辦法加以殺滅。黑膠蟲

21、 1、 黑膠蟲概況： 在細胞培養(yǎng)的時候，有時會在400倍顯微鏡下看到小黑點在動，小黑點有時呈點狀，有時呈小的片狀，運動形式為在原地振動（類似布朗運動），這種小黑點既不是細菌、霉菌，也不是支原體（我們曾經(jīng)請周守長用血平板培養(yǎng)過，沒有菌落出現(xiàn)），目前業(yè)內(nèi)人士稱其為“黑膠蟲”。 黑膠蟲到底是否為生物？這個一直是業(yè)內(nèi)人士的疑惑。黑膠蟲一般是存在血清里的，而血清通常是經(jīng)過0.1m濾膜過濾的,所以血清里不可能存在細菌、霉菌及支原體等微生物。如果說黑膠蟲不是生物，它會不斷增多，達到一定數(shù)量時會與細胞競爭性生長，與細胞競爭培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，從而使得細胞營養(yǎng)不足而死亡。 不管對于黑膠蟲的爭論如何,但有幾個是目前大

22、家公認的： 與細胞競爭性生長，對細胞生長有不利影響。 “黑膠蟲”會增殖，增殖多時，視野下一大片都為“黑膠蟲”。 “黑膠蟲”與血清有關(guān)，與血清質(zhì)量有很大關(guān)系。 2、目前對“黑膠蟲”的定論：有2種解釋： 第一， 黑膠蟲為生物。它是小于細菌的生物，直徑小于0.1m，大多國外血清中多見，可能是國外牛血清中含有的某種原蟲。只要它是生物，那么在培養(yǎng)基中一定會對細胞有影響。 第二， 黑膠蟲不是生物。國內(nèi)的血清中，通常滅活之后都會有絮狀沉淀出現(xiàn)，而黑膠蟲出現(xiàn)時，所使用的血清被反復(fù)凍融過多次。所以推測，所謂的“黑膠蟲”其實就是血清中的某些蛋白成分的物質(zhì)，經(jīng)過滅活之后喪失活性，在培養(yǎng)基中，鏡檢見到的運動其實是這些

23、物質(zhì)在溶液中做“布朗運動”。隨著細胞消耗培養(yǎng)基，這些物質(zhì)越來越多，最后細胞所用的營養(yǎng)消耗完，細胞容易死亡。 3、對于“黑膠蟲”的處理方法： 首先，血清買回來滅活前凍融應(yīng)逐級凍融，即按照-204完全融化后，再置入水浴中，與室溫一起升高到56度，這樣的目的是避免溫度驟變，導致血清中的營養(yǎng)物質(zhì)喪失活性。 第二，血清滅活后分裝保存。按照每次用血清的量分裝，盡量減少血清凍融的次數(shù)。分裝時注意無菌。 第三，細胞培養(yǎng)時血清濃度稍大一些。通常細胞培養(yǎng)血清濃度為10%-15%，但如果血清凍融次數(shù)過多，那營養(yǎng)物質(zhì)喪失活性，按15%的濃度配制事實上達不到15%的營養(yǎng)成分，故培養(yǎng)基配置時一般用18%-20%的血清。

24、這種黑膠蟲，在國外稱其為- 納米細菌，現(xiàn)將我看到的一些資料轉(zhuǎn)述如下，希望對大家有所幫助： 1.納米細菌的發(fā)現(xiàn) 芬蘭的一個科學家Ciftcioglu et al 在其細胞培養(yǎng)過程中, 發(fā)現(xiàn)在胎牛血清中存在一種直徑50-500 nm的微粒; 這種顆粒物對伽瑪射線具有很強的耐受性; 針對包括支原體在內(nèi)的所有已知微生物的特異性檢測實驗均為陰性; 這種顆粒物在血瓊脂培養(yǎng)基以及支原體培養(yǎng)基中無法生長, 通常的細菌染色方法難以著色. 因此, Kajander判定這是一種新的微生物, 根據(jù)其體型微小并且棲息在血液中的特點, 將其命名為Nanobacterium sanguineum, 簡稱Nanobacter

25、ia, 中文譯名納米細菌, 并將菌種保存于德國微生物存儲中心 (DSM No: 5819-5821, the GermanCollection of Micro-organisms, Braunschweig, Germany). 2 納米細菌的生物學特性 2.1 納米細菌哺乳動物體內(nèi)最小的細菌 細胞培養(yǎng)時所使用的血清通常采用過濾法達到無菌的目的, 通常采用直徑0.1 m的濾膜過濾除菌. Kajander研究發(fā)現(xiàn), 0.1 m 的濾膜過濾并不能有效地清除血清中的納米細菌, 但是血清經(jīng)過0.05 m的濾膜過濾則能有效清除納米細菌污染. 細胞培養(yǎng)條件下的納米細菌經(jīng)過0.2 m的濾膜過濾后約有3%的

26、納米細菌可以通過濾膜, 而在加壓過濾的情況下, 約有50%的納米細菌可以通過0.2 m的濾膜. 剛剛經(jīng)過過濾的納米細菌在相差顯微鏡下無法發(fā)現(xiàn), 但在不含血清添加劑的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后, 即可以用相差顯微鏡觀測到. 電子顯微鏡觀察顯示, 納米細菌的平均直徑為200 nm, 而子代納米細菌的最小直徑僅50 nm. 傳統(tǒng)的觀點認為, 只有當細胞直徑在不低于140 nm時, 才能維持其最基本的新陳代謝. Kajander認為, 納米細菌可能是地球形成早期、在原始大氣條件下的一種最原始的生命形式, 因此不能用衡量已經(jīng)經(jīng)過幾十億年進化的生命形式的觀點去衡量這種古老的生命形式, 并且推測, 納米細菌

27、遭受不良因素的侵害后可以形成許多的體形微小的碎片, 并將其釋放到環(huán)境中, 每一個碎片都可能攜帶部分遺傳信息, 在特定條件下, 這些"基本"顆粒聚集在一起形成群落, 當足夠數(shù)量的"基本"顆粒提供完整的遺傳信息時, 則可以形成新的納米細菌. 2.2 納米細菌緩慢的增殖周期 微生物學家通常是通過對某種微生物進行培養(yǎng), 進而了解該種微生物的特性. 然而, 并非每種微生物都是可以在實驗室中進行培養(yǎng)的,主要原因在于這些微生物的培養(yǎng)條件我們并不清楚, 其生存環(huán)境以及是否與其他微生物存在共生關(guān)系我們并不十分了解. 納米細菌就是一種對生長環(huán)境要求非常苛刻的微生物, 其新陳

28、代謝率極為緩慢, 僅為普通細菌的1/10 000. 研究發(fā)現(xiàn), 納米細菌主要利用環(huán)境中的氨基酸而不是葡萄糖來提供能量, 谷氨酰胺、天冬酰胺以及精氨酸均可被其利用. 在37 有50-10 mL/L的二氧化碳及900-950 mL/L的空氣存在的潮濕環(huán)境下, 并且在含有100 mL/L胎牛血清和適量谷氨酰胺的pH值7.4的細胞培養(yǎng)基中, 納米細菌能夠緩慢生長, 平均倍增時間為3 d,而在無血清的細胞培養(yǎng)基中, 其增殖速度變慢, 細菌倍增時間可延長至5-6 d, 在添加適量促納米細菌生長因子BGF(一種桿菌培養(yǎng)上清的超濾液)或N3(納米細菌培養(yǎng)上清的超濾液)的條件下, 其增殖速度加快, 倍增時間可縮

29、短至0.6-1 d. 在有促納米細菌生長因子BGF存在的條件下, 納米細菌甚至可以在固體培養(yǎng)基中生長, 并形成直徑l mm大小的細菌集落. 2.3 納米細菌獨特的生物礦化現(xiàn)象 當在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納米細菌被轉(zhuǎn)移至不含血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)時 (DMEM或RPMI-1640), 在1 a之內(nèi)就可以觀察到納米細菌出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象, 在1 wk之內(nèi), 就可以在納米細菌的周圍形成幾微米厚的生物被膜 (biofilm), 并且緊緊貼附于培養(yǎng)瓶底部, 而納米細菌棲息其中(這與在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納米細菌的形態(tài)明顯不同), 此時其大小接近于一個酵母細胞, 2-3 wk以后, 由于生物被膜的增厚, 其直徑

30、已近似于一個紅細胞的大小. 用EDX法對這種生物被膜的化學組成進行分析, 顯示其鈣磷的峰值與羥基磷灰石極其相似, 電子顯微鏡觀察以及傅立葉轉(zhuǎn)換紅外頻譜(fourier transform IR spectroscopy, FTIR)分析顯示其主要成分為碳酸羥基磷灰石(carbonate hydroxyapatite), 而且,不論在有無血清作為添加劑的情況下, 都可以見到這種被羥基磷灰石包繞的納米細菌, 這種情況甚至可以在處于分裂期的納米細菌中見到. 納米細菌并不產(chǎn)生尿激酶和堿性磷酸酶, 并且即便經(jīng)過長達數(shù)周的培養(yǎng), 其培養(yǎng)基的pH值也不會出現(xiàn)明顯的變化, 一直穩(wěn)定在7.4左右, 這表明在納米

31、細菌細胞膜表面所生成的羥基磷灰石結(jié)晶是源自于生物大分子的, 即生物礦化現(xiàn)象, 而并非是由于pH值改變所導致的簡單的物理結(jié)晶現(xiàn)象.納米細菌利用培養(yǎng)體系中的鈣、磷合成羥基磷灰石作為其生物被膜的主要成分, 這種生物礦化過程受到生長環(huán)境中某些因素的調(diào)控, 從而使其呈現(xiàn)不同的外觀, 如羥基磷灰石形、細菌被膜形、沙粒形、結(jié)石形和類似腫瘤的外形. （這也許就是國內(nèi)的一些研究者們認為其是一些磷酸鹽類的無機物的部分原因吧?。?。在含有新鮮血清的培養(yǎng)基中納米細菌的生物礦化現(xiàn)象程度較輕微, 這是由于血清中含有強效羥基磷灰石合成抑制因子, 骨鈣素 (osteocalcin) 和胎球蛋白(fetuin), 由于這些抑制蛋

32、白的存在, 所以在有血清存在的情況下, 納米細菌的生物礦化作用受到明顯抑制. 當血清濃度降低時, 納米細菌的生物礦化現(xiàn)象增強, 在不含血清的培養(yǎng)體系中, 生物礦化現(xiàn)象劇烈而迅速. 盡管改良的Loeffler固體培養(yǎng)基中含有750 mL/L血清成分, 但血清蛋白成分在滅菌過程中受到破壞, 所以在此培養(yǎng)基中的納米細菌的礦化作用并不受抑制, 在此培養(yǎng)基中生長的納米細菌其菌落直徑可達1-5 mm. 另外, 當有乙二胺四乙酸(EDTA)存在時, 納米細菌的生物現(xiàn)象會受到明顯的抑制.由于礦化生物被膜的保護作用以及極其緩慢的新陳代謝率, 使納米細菌能夠耐受各種不利的物理條件和化學損傷因素以及多種抗生素的打擊

33、. 2.4納米細菌的檢測方法 由于納米細菌在標準微生物培養(yǎng)基中無法生長, 并且即便是在最適宜其生長的細胞培養(yǎng)環(huán)境中, 納米細菌的生長也極為緩慢, 其新陳代謝率僅為普通細菌的萬分之一, 這使得許多基于檢測細菌新陳代謝的微生物學方法無法檢測納米細菌的存在. 由于納米細菌難以用傳統(tǒng)的火焰法和乙醇法固定, 并且大多數(shù)染料無法穿透其細胞壁, 而且不能用普通顯微鏡對其進行觀察, 因此常規(guī)的細菌學染色法并不能檢測到納米細菌的存在. 通過Kajander et al 的研究, 發(fā)現(xiàn)70干烤10 min, 可以將其有效固定; 另外, 用茜素紅S、剛果紅以及硝酸銀染料可以使納米細菌著色; 而培養(yǎng)狀態(tài)下的納米細菌可以在放大400倍的相差顯微鏡下清晰地觀察其生長情況; 用DNA熒光染料 (Dapi或Hoechst) 按普通細菌DNA染色的條件對納米細菌DNA進行染色均不成功, 而當按照線粒體DNA以及病毒DNA染色條件, 對納米細菌DNA進行染色時, 熒光顯微鏡下可以觀察到特征性的熒光; 用納米細菌特異性抗體進行熒光染色也可以清晰地顯示納米細菌的存在; 利用電子顯微鏡對經(jīng)過負染的納米細菌進行觀察, 可以清晰的顯示80-350 nm大小、單獨或聚集成簇的納米細菌以及其表面的生物被膜(biofilm)結(jié)構(gòu); 而用透射電鏡對納米細菌的超薄切片進行觀察, 可以清晰的顯示其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 可以發(fā)