細(xì)胞周期調(diào)控與血管增生性疾病的干預(yù)

1、細(xì)胞周期調(diào)控與血管增生性疾病的干預(yù)隨著人民生活水平的提高，動脈粥樣硬化、高血壓、高血脂、糖尿病的發(fā)病率逐年上升，因這類疾病引發(fā)的心、腎、腦、四肢血管狹窄、閉塞導(dǎo)致相應(yīng)器官缺血已成為主要的致殘致死原因，嚴(yán)重威脅人類生命和健康，各種介入性血管腔內(nèi)手術(shù)、動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)、動脈旁路轉(zhuǎn)流術(shù)等治療方法在臨床上已廣泛開展，能快速緩解缺血癥狀，大大提高了患者生存率和生活質(zhì)量，術(shù)后近期效果好，但有30%50%的患者會在術(shù)后36個月內(nèi)出現(xiàn)進(jìn)行性再狹窄，直至管腔閉塞，導(dǎo)致這類手術(shù)遠(yuǎn)期效果降低甚至失敗。很多研究表明血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的過度增生是導(dǎo)致管腔再狹窄的關(guān)鍵。國內(nèi)外大量分子生物學(xué)實 驗研究認(rèn)為VSMC的過

2、度增生與多種調(diào)控基因有關(guān)，現(xiàn)將參與血管平滑肌細(xì)胞周期調(diào)節(jié)活動的相關(guān)因子及針對細(xì)胞周期的藥物和基因治療進(jìn)行綜述如下。 1 血管平滑肌細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期 血管增生是血管壁組織對機(jī)械性因素、高血壓、高血脂等損傷所產(chǎn)生的反應(yīng)，可分為3個階段：（1）早期炎癥反應(yīng)、血小板激活和血栓形成：因高壓血流沖擊管壁、高血脂引起的斑塊形成和脫落，以及手術(shù)操作造成的內(nèi)皮細(xì)胞受損脫落，引起局部血小板沉積和激活，白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞單核細(xì)胞向損傷部位聚集，并分泌各類趨化因子和生長因子；（2）SMC聚集形成新生內(nèi)膜：中膜的VSMC受趨化因子吸引向內(nèi)膜層遷移，并在內(nèi)膜層里受各類生長因子的誘導(dǎo)進(jìn)入有絲分裂期，大量增殖超過自然凋亡水平

3、，這樣就形成了新生內(nèi)膜使得管腔發(fā)生狹窄；（3）晚期增生階段：新生內(nèi)膜里的VSMC能分泌大量基質(zhì)成分并沉積下來，使管腔進(jìn)一步狹窄1。 與其他細(xì)胞一樣，SMCs增殖也是DNA復(fù)制和有絲分裂的周期性活動。細(xì)胞周期（cell cycle）指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，所需的時間稱為細(xì)胞周期時間。休眠期里的SMC處于非增生狀態(tài)（G0）；激活的SMC進(jìn)入第一個間期（gap1，G1），在該期里細(xì)胞復(fù)制合成DNA所需要的因子。然后進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，隨后細(xì)胞進(jìn)入第二個間期（gap2，G2），在這期里進(jìn)行必要的檢查及修復(fù)以保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性并為蛋白質(zhì)合成做準(zhǔn)備。接著是有絲分裂期

4、（mitosis，M）完成遺傳物質(zhì)到子細(xì)胞中的均等分配，并使細(xì)胞一分為二，這樣便完成了一個細(xì)胞周期。調(diào)節(jié)G1到S期之間和G2到M期之間的進(jìn)程能保證細(xì)胞周期有序地進(jìn)行或被阻滯。盡管不同物種的上游有絲分裂信號會有所不同，但在細(xì)胞周期活動中主要的細(xì)胞因子是共同的，也是可以檢測的。 2 CDK/CDKI和CyclinI對細(xì)胞周期控制 2.1 CDK/CDKI CDC2是細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(cyclindependent kinase，CDK)，要與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，因此CDC2又被稱為CDK1。目前已知CDK家族有7個成員：即CDK17，這些分子都含一段相似的激酶結(jié)構(gòu)域，這一區(qū)域有一

5、段保守序列，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。激活的CDK家族可將靶蛋白磷酸化而產(chǎn)生相應(yīng)的生理效應(yīng)，如將核纖層蛋白磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失，將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等等。這些效應(yīng)的最終結(jié)果是細(xì)胞周期得以不斷運行。因此，CDK作為正性調(diào)節(jié)因子和其負(fù)性調(diào)節(jié)因子CDKI一起被稱為“細(xì)胞周期引擎”。 CDKI是細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子（CDK inhibitor，CDKI），對細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，目前發(fā)現(xiàn)的CDKI有兩大家族：（1）Ink4(inhibitor of cdk 4)，如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特異性抑制cdk4·cyclin

6、D1、cdk6·cyclin D1復(fù)合物；（2）Kip(kinase inhibition protein)：包括P21cip1(cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等，能抑制大多數(shù)CDK的激酶活性，P21cip1還能與DNA聚合酶的輔助因子PCNA（proliferating cell nuclear antigen）結(jié)合，直接抑制DNA的合成。 在生理條件下，CDKIS通過抑制它們各自的CDKs來調(diào)控細(xì)胞周期里的活動。CDK/CDKI間的表達(dá)失衡也許是造成血管壁細(xì)胞增生的

7、重要因素，因此維持CDK/CDKI間的平衡表達(dá)可能阻止SMC增殖抑制血管壁增厚2。 2.2 周期蛋白(cyclin) 不僅能激活CDK，還決定了CDK的作用時間、部位和底物磷酸化，從而推動細(xì)胞周期的前進(jìn)。目前從芽殖酵母、裂殖酵母和各類動物中分離出的周期蛋白有30余種，在脊椎動物中為A12、B13、C、D13、E12、F、G、H等。不同的cyclin亞型和CDK亞型又組成G1型、G1/S型、S型和M型4種激酶復(fù)合體形式。細(xì)胞在生長因子的刺激下，G1期cyclin D表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄3。 細(xì)胞周期機(jī)制

8、調(diào)控是增生反應(yīng)的最終共同通路，目前各種不同的動物模型研究顯示：血管損傷后Cyclin、CDKs和CDKIs有著很高的相關(guān)性表達(dá)。這就為干預(yù)細(xì)胞周期調(diào)控提供了可能、合理的切入位點。如何使細(xì)胞周期抑制劑安全地進(jìn)入臨床使用，有效地抑制VSMC增生防治再狹窄，同時其副作用又是最小的，這些都已成為目前的研究熱點。 3 現(xiàn)有的細(xì)胞周期干預(yù)方法及效果 3.1 抗細(xì)胞增殖藥物即抗腫瘤藥 3.1.1 抑制CDKs家族的藥物 以細(xì)胞周期作為靶位，因此可通過阻斷CDKs的ATP聯(lián)合位點的方法，用低分子量復(fù)合物特異性地干擾細(xì)胞周期蛋白是一項很有吸引力的藥物性方案。由于CDKs里的ATP聯(lián)合位點在結(jié)構(gòu)上不同于其他激酶，

9、具有特異性。Flavopiridol是一種從印度植物葉和根中提煉的植物堿，是美國第一個針對細(xì)胞周期進(jìn)入臨床試驗的可口服低分子量藥物，能有效地阻斷CDK1，CDK2、CDK4和CDK7的活性，但它對其他激酶有微量副作用。美國得克薩斯醫(yī)學(xué)分部實驗室的研究顯示：在體外Flavopiridol能抑制SMC增生；也能在體內(nèi)大鼠頸動脈球囊損傷后模型中，抑制SMC增生4；CVT-313，是嘌呤類似物olomoucine的衍生物，是另一種藥物性CDKIs家族成員之一，盡管它比flavopiridol的藥效少些但也能抑制CDK2的活性，在大鼠頸動脈球囊損傷后模型局部用藥能抑制損傷后狹窄的形成5。 3.1.2 阻

10、斷G1期到S期進(jìn)程的藥物 間接抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的藥物可作為血管增生抑制劑。rapamycin雷帕霉素(Rapamune，Sirolimus西羅莫司)，一種可口服的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；還有Paclitaxel(Taxol)泰素，也是一種化療藥物，都能阻斷SMCs細(xì)胞周期的G1期。Paclitaxel能穩(wěn)定聚合的微管并能持久阻斷血管SMC細(xì)胞周期，在動物模型中全身給藥和心包內(nèi)注射給藥后抑制新生內(nèi)膜形成68。Rapamycin還能聯(lián)合細(xì)胞溶質(zhì)免疫球蛋白FKBP12，有效地抑制SMC增生。用Rapamycin包被支架進(jìn)行的初步研究結(jié)果表明它在抑制血管腔內(nèi)治療后再狹窄方面具有很大的潛力。事實上，我們也許正

11、在使用某些細(xì)胞周期活動調(diào)控藥物而不自知，比如體外實驗研究顯示一氧化氮和高劑量的水楊酸類藥物能抑制細(xì)胞周期和SMC增生9，也許在體內(nèi)實驗中也有類似效果。 3.2 基因轉(zhuǎn)入調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程 3.2.1 調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因表達(dá)和活性 內(nèi)源性的基因表達(dá)能通過反義技術(shù)來下調(diào)，這要求反義DNA和RNA分子有連接到mRNA分子的能力，用一個順序特異性方式來增加RNA的降解?；蚧钚砸材芡ㄟ^轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)，該技術(shù)利用轉(zhuǎn)錄因子的單核苷酸一致性連接順序，以完全地保護(hù)它們的功能。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子特異性的反義寡核苷酸細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因包括：周期素B1、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞分裂周期2（CDC-2）激

12、酶和周期素依賴激酶2（CDK2）的基因10。Mann等11的研究認(rèn)為，靜脈移植物在體內(nèi)存在2種主要反應(yīng)：一種是手術(shù)時因操作和缺血引起的損傷，這促進(jìn)了新內(nèi)膜的形成并發(fā)展為動脈粥樣硬化12；另一種是腔內(nèi)壓升高與動脈環(huán)境下靜脈壁承受的高切應(yīng)力，這種力在血管無損傷時可促使血管增生肥厚而無新內(nèi)膜形成，即靜脈的“重塑”動脈化過程13。處于G0/G1期的VSMC可不經(jīng)細(xì)胞周期進(jìn)行細(xì)胞的過度生長并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。因此，阻斷促VSMC進(jìn)入復(fù)制期的必需基因表達(dá)會使移植靜脈的血管壁增厚，同時抑制VSMC的遷移和增殖，從而抑制新內(nèi)膜形成。周期素B1、PCNA、CDC2和CDK2激酶基因特異性反義寡核苷酸正是據(jù)此而

13、設(shè)計的。Mann等11的研究結(jié)果表明，PCNA、CDC2激酶的基因特異性反義寡核苷酸可選擇性地阻斷這些激酶在移植于頸動脈的頸靜脈VSMC中的表達(dá)，從而指導(dǎo)靜脈移植物由新內(nèi)膜增生向中膜肥厚發(fā)展，使移植的靜脈更類似于動脈結(jié)構(gòu)。在新生內(nèi)膜形成的動物模型里，用多聚陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)反義單核苷酸和RNAs，能對抗CDK1和CDK2，Cyclin B1和G1從而得到有效的抑制效果14。更重要的是，這些基因工程化的移植物可抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化，因而有希望提高移植血管的遠(yuǎn)期通暢率。 3.2.2 增加外源性基因表達(dá) 用病毒或質(zhì)粒為載體轉(zhuǎn)入外源性細(xì)胞周期抑制劑基因表達(dá)相應(yīng)分子。用腺病毒技術(shù)使CDKI

14、s P21和P27過度表達(dá)是防止新生內(nèi)膜形成的有效方法，同樣，用裸質(zhì)粒載體使細(xì)胞周期抑制劑轉(zhuǎn)錄因子P53、GAX過度表達(dá)也有此效果15，16。 1995年后，CHANG等學(xué)者用腺病毒載體攜帶CDK抑制劑，即一個KIP/CIP家族成員P21，感染大鼠頸動脈。在損傷后20天，P21的過量表達(dá)能減少內(nèi)膜/中膜比值（I/M）46%17。體內(nèi)分析顯示：P21通過使血管SMCs停止在G0/G1細(xì)胞周期而產(chǎn)生這種抗增生作用。P21基因轉(zhuǎn)染抑制內(nèi)膜增厚的作用已被另一項大鼠和豬動脈損傷模型研究證實18，19。此外LUO等對嚙齒類動物模型中，每個動脈斑塊上用腺病毒P21低倍1×108效價轉(zhuǎn)染，能減少58

15、%的新生內(nèi)膜形成20。另一個CDK抑制劑的KIP/CIP家族成員是P27，它在大多數(shù)細(xì)胞里有持續(xù)表達(dá)。在大鼠頸動脈里過度表達(dá)P27也能減少I/M 49%15。所以，過度表達(dá)自身細(xì)胞周期抑制物能阻遏細(xì)胞周期，抑制SMC增生，最終起到限制內(nèi)膜增厚的作用。 在細(xì)胞遭受非常嚴(yán)重的損傷和DNA破壞后，DNA修復(fù)或激活凋亡病理過程時，腫瘤抑制物P53基因就會被誘導(dǎo)和啟動以阻止細(xì)胞周期過程。這些P53的特性使其成為一個具有吸引力的血管基因治療后備基因。Yonemitsu等21報道：日本血細(xì)胞凝集病毒（HVJ）作為介質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)P53到球囊損傷的兔頸動脈能顯著地抑制內(nèi)膜增厚。組織學(xué)上檢測這類經(jīng)P53處理過的血管顯示

16、：細(xì)胞增生被抑制，同時SMC分化也被削弱。還有，Scheinman等22報道：腺病毒將野生型P53轉(zhuǎn)導(dǎo)到損傷的大鼠頸動脈會產(chǎn)生劑量依賴的新生內(nèi)膜形成減少，在8×109、1.6×1010、8×1010PFUm/L分別能減少內(nèi)膜厚度47%、51%和96%。 GAX過度表達(dá)已至少在3種不同的血管增生模型里顯示出有效23，24，GAX過度表達(dá)的檢測是基因治療血管疾病領(lǐng)域里最嚴(yán)格精密的檢測之一。還有促使一氧化氮合酶異構(gòu)體過度表達(dá)，在動物模型里也能減少新生內(nèi)膜形成，其機(jī)制可能是一氧化氮和細(xì)胞周期機(jī)制間的相互作用25。Smith等26報道腺病毒攜帶GAX到損傷的大鼠頸動脈，能減

17、少69%的新生內(nèi)膜。Maillard等27學(xué)者的報道也顯示了同樣的結(jié)果，即能使兔髂動脈的I/M減少69%。另一項類似GAX的轉(zhuǎn)錄因子GATA-6也能在嚙齒類動物抑制50%的內(nèi)膜增厚28。 但是SMC對不同的細(xì)胞周期抑制劑的反應(yīng)并不一致。例如，P16 INK4在阻斷CDK2活性方面不如P21或P27有效，它是一個弱的血管增生反應(yīng)抑制劑29。 SMCS細(xì)胞周期抑制劑不僅使SMC處于持續(xù)的靜息狀態(tài)，凋亡也是細(xì)胞周期抑制的可能結(jié)果，比如，在大鼠頸動脈里過度表達(dá)GAX在抑制增生同時還會引起凋亡30。而且SMC的凋亡存在于整個基因治療的效應(yīng)期。 要強(qiáng)調(diào)的是，用腺病毒和質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的外源性基因的表達(dá)，大多也是暫

18、時性的，由于腺病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)阻止了該技術(shù)的重復(fù)應(yīng)用，因而大大降低了實用性。用基因方法防止血管增生性疾病的動物研究結(jié)果雖然說明基因治療具有臨床應(yīng)用潛力，還存在著很多問題。除了與種系相關(guān)的明顯差異外，還有在動物研究里的基因類物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)通常是通過直接灌注到手術(shù)取下的血管里，這個方法遠(yuǎn)不同于目前人體以導(dǎo)管為基礎(chǔ)的操作。當(dāng)考慮將基因治療作為臨床心血管治療方案時，在安全性、免疫遺傳學(xué)或基因表達(dá)穩(wěn)定性方面都要求理想31，因此也必須提高關(guān)于病毒為基礎(chǔ)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法學(xué)，或開發(fā)其他基因攜帶物，比如殼聚糖納米等可備選的方法。 4 討論 綜上所述，用抑制細(xì)胞周期的方法防治血管增生性疾病與抗腫瘤治療雖然有著相似

19、之處，但并不完全相同，而且還有許多問題需要進(jìn)一步研究探索。 4.1 兩者給藥方式不同 抗腫瘤治療已經(jīng)形成臨床常規(guī)，常在術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后全身用藥，術(shù)后用藥多為長期比如612個月，以靜脈給藥為主，也有口服給藥的方式。而針對血管增生性疾病的抗增殖治療還處于科研探索階段，一般對動物模型的給藥方式為手術(shù)操作中局部進(jìn)行反義基因的轉(zhuǎn)染或放置包被抗增殖化療藥物的支架，大多為一次性局部用藥。關(guān)于藥物包被支架的應(yīng)用雖能延長給藥時間，但當(dāng)藥效消失后支架放置本身也會引起巨單核細(xì)胞聚集在支架周圍引發(fā)一系列肉芽腫性增生反應(yīng)，所以現(xiàn)在也有研究可溶性藥物支架，這類支架應(yīng)用的前景有待進(jìn)一步研究。也有實驗研究用微泵固定于實驗動物

20、身上的給手術(shù)部位持續(xù)性血管內(nèi)給藥，以達(dá)到抗術(shù)后血管增殖作用，但這屬于有創(chuàng)性治療要在臨床上推廣有一定限制。而臨床上人體的再狹窄常開始于術(shù)后612個月，并在更長的時間內(nèi)進(jìn)展直至管腔完全閉塞，在這么長的時間內(nèi)術(shù)中給的藥或反義基因是否已被代謝，或當(dāng)初轉(zhuǎn)染反義基因的細(xì)胞凋亡，該基因又未傳代下去，使得防治再狹窄的作用失效或效力不足？但也可能術(shù)中給藥能抑制增生的起始，使得增生能一直處于一個較低的狀態(tài)從而使再狹窄發(fā)生推遲或不再發(fā)生，所以是術(shù)中一次用藥還是需要多次用藥，如果需要術(shù)后持續(xù)用藥，那么該方式又必須是損傷最小的，這需要進(jìn)一步的動物和臨床研究。 4.2 用藥劑量問題 臨床上腫瘤的抗增殖藥劑量一般已定，而使

21、用抗增殖藥防治血管增生性疾病還處于實驗階段，沒有一個可循的用量范圍，因為在靜脈移植術(shù)后靜脈發(fā)生的增殖也是對血流動力學(xué)環(huán)境改變后的適應(yīng)，只是它發(fā)生的不是“動脈化”而是偏離動脈功能的變化；在動脈粥樣硬化斑塊中增生的VSMC能穩(wěn)定斑塊不易破裂，如果VSMC凋亡過多斑塊就會變得不穩(wěn)定導(dǎo)致更嚴(yán)重的后果；還有手術(shù)中會造成一定的內(nèi)皮損傷，不完整的內(nèi)皮會引起血栓形成直接導(dǎo)致早期的血管手術(shù)失敗。所以如果抗增殖用藥量過大是否會引起移植的靜脈壁薄弱易造成動脈瘤甚至破裂，或使得動脈粥樣硬化斑塊易破裂，或因內(nèi)皮修復(fù)也受到了抑制更易形成血栓等這類適得其反的結(jié)果。所以必須要研究出各抗增殖藥物有效和安全的劑量范圍，在這個范圍

22、內(nèi)既能達(dá)到最大抗增殖效果，又不會出現(xiàn)上述副作用。 4.3 抗增殖的副作用 眾所周知，抗腫瘤藥會有一定副作用，如胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)、白細(xì)胞減少等。防治血管增生疾病的抗增殖治療雖多為局部用藥，但畢竟是在血管腔內(nèi)用藥，藥物是否會隨著血液循環(huán)到身體各處引起類似的副作用，還有作為載體的病毒顆粒引起的免疫反應(yīng)和質(zhì)粒如何安全排出體外等問題都需進(jìn)一步研究。既可靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)，又無毒、無免疫源性，還可示蹤定量檢測的載體也將成為研究的熱點。 參考文獻(xiàn) 1 Clowes AW，Reidy MA，Clowes MM.Kineties of cellular proliferation after arterial injur

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