肝豆?fàn)詈俗冃訲淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的變化

1、肝豆?fàn)詈俗冃訲淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的變化 作者：汪瀚 楊文明 鮑遠(yuǎn)程 陳懷珍 童建兵【摘要】 目的 研究肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson病，WD)患者的T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞亞群變化,并探討其臨床意義。方法 應(yīng)用流式細(xì)胞儀直接免疫熒光染色法測定49例WD患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞亞群,并與健康人組進(jìn)行對照,同時對不同ChildPugh分級患者的T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞進(jìn)行比較分析。結(jié)果 WD組CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+較對照組水平無明顯變化，NK水平較對照組降低(P<0.05)；病情重者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平仍無差異，隨病情加重NK水平

2、顯著降低(P<0.01)。結(jié)論 WD存在NK細(xì)胞免疫失調(diào),而T淋巴細(xì)胞免疫功能正常,病情重的患者NK細(xì)胞免疫功能更低。 【關(guān)鍵詞】 Wilson??；T淋巴細(xì)胞亞群；NK細(xì)胞亞群；流式細(xì)胞儀【Abstract】 Objective To study the changes and its clinical significance of T lymphocyte subsets and natural kill cells in Wilsons disease patients.Methods T lymphocyte subsets and natural kill cells

3、were measured in 49 patients by the FCM direct immunofluorescent staining technique and compared with normal controls. Meanwhile patients were also compared with each other in different ChildPugh rating.Results The levels of CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+ in WD were normal, the levels of natural kill cell

4、s decreased compared with healthy controls(P<0.05). As compared with Child-Pugh rating A, the levels of NK were declined more significantly in severe patients who were ChildPugh rating B and C(P<0.01).The difference of CD3+，CD4+，CD4+/CD8+ levels was not significant.Conclusion T lymphoc

5、yte immune function is not difference and immune disturbance of NK are observed in WD patients. The levels of NK are even significantly lower in severe patients. 【Key words】 Wilsons disease；T lymphocyte；Natural kill cell；FCM 肝豆?fàn)詈俗冃裕╤epatolenticular degeneration, HLD）,也稱Wilson病（Wilsons disease，WD）,是一

6、種常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙性疾病,均存在不同程度的肝功能異常和損害。肝功能損害在肝豆?fàn)詈俗冃灾斜憩F(xiàn)較突出，其中免疫調(diào)控功能紊亂亦是參與慢性肝損傷的重要原因之一,為探討WD病人T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞與機(jī)體細(xì)胞免疫功能紊亂的關(guān)系, 我們采用流式細(xì)胞儀技術(shù)對WD患者進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群及自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell, NK)的測定，分析并探討其在WD病情進(jìn)展過程中的作用及臨床意義,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。1 材料與方法1.1 研究對象 Wilson病組:共49例,為200608200612安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院確診病例，男31例,女18例,年齡859歲,平均(21.1

7、0±10.56)歲。平均病程(7.14±6.74)年, 平均發(fā)病年齡 (13.89±5.30)歲。ChildPugh分級A級16例,B級28例,C級5例。正常對照組:共24例,為健康志愿者,其中男13例,女11例,年齡1246歲,平均(23.57±7.39)歲。排除自身免疫性疾病、腫瘤、急性炎癥、使用免疫抑制劑者,血常規(guī)及肝腎功能正常。1.2 方法 外周血T淋巴細(xì)胞亞群及NK殺傷細(xì)胞檢測使用美國Beckman Coulter EPICS XL4C型流式細(xì)胞儀,采用微量全血直接免疫熒光染色法。全部受檢者均于清晨空腹抽取肘靜脈血1ml,取肝素抗凝血100u，

8、分別加入20u熒光標(biāo)記的FiTcCD3CD16+56、FiTcCD4/CD8單克隆抗體,混勻后置室溫1820孵育15min,加紅細(xì)胞溶解液1ml待紅細(xì)胞溶血后,離心洗滌2次,用流式細(xì)胞儀檢測,以陽性百分率計算結(jié)果。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 成組、成對資料均數(shù)比較采用t檢驗。2 結(jié)果2.1 WD組和對照組性別比較 在WD組、正常對照組中,按性別進(jìn)行比較,T細(xì)胞亞群各項指標(biāo)均無組間差異(P>0.05)。見表1。表1 WD組性別間和對照組性別間的T細(xì)胞亞群分析比較（略）2.2 WD組與對照組T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞測定 WD組和正常對照組中的T細(xì)胞即CD3+、

9、 CD4+、CD8+ 、CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞的百分比差異則無顯著性意義 (P>0.05), WD組患者NK細(xì)胞差異有顯著性意義 (P<0.01)。見表2。表2 WD組與對照組T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞測定比較（略）組間比較：*P<0.012.3 不同ChildPugh分級WD患者T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞之間的比較 當(dāng)肝功能損害達(dá)到ChildPugh分級B、C級時，與A級比較NK細(xì)胞水平差異有顯著性意義(P<0.01)。見表3。表3 不同Childpugh分級WD患者T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞之間的比較（略）B級、A級組間比較：*P<0

10、.01；C級、A級組間比較：#P<0.013 討論 WD是以銅代謝障礙為特征的常染色體隱性遺傳病,由于基因(13q14.1)突變,其編碼的蛋白(ATP7B)發(fā)生改變,導(dǎo)致血清銅藍(lán)蛋白合成減少和膽道排銅障礙,銅離子在肝、腦(尤其是基底節(jié))、腎、角膜等沉積,表現(xiàn)為肝硬化、錐體外系癥狀、腎功能損害、角膜KF環(huán)等。1目前對于WD患者T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞指標(biāo)的檢測，迄今國內(nèi)外報道較少。 人類白細(xì)胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)系列單克隆抗體可識別T淋巴細(xì)胞表面抗原決定簇,其中CD3+代表T細(xì)胞總數(shù),CD4+和CD8+代表T輔助誘導(dǎo)亞群(ThTy)和抑

11、制殺傷亞群(TsTc)。CD4+細(xì)胞主要指Th細(xì)胞,可促進(jìn)B細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)及其他免疫細(xì)胞增殖和分化。CD8+細(xì)胞中Ts細(xì)胞可對抗Th細(xì)胞功能,Tc細(xì)胞則能特異性地殺傷攜帶抗原的靶細(xì)胞。正常情況下,這些免疫細(xì)胞相互制約,形成機(jī)體的免疫網(wǎng)絡(luò),維持機(jī)體的正常免疫功能。某一淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量或功能發(fā)生異常時,機(jī)體免疫平衡紊亂,可發(fā)生一系列病理損傷2。一般認(rèn)為CD4+與CD8+之比應(yīng)為1.32.1:1，臨床上常用Th/ Ts比值來判斷病人的免疫狀態(tài)。 NK約占循環(huán)淋巴細(xì)胞的15%,能迅速產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子,且無需預(yù)先致敏即能殺傷腫瘤和被病毒感染的靶細(xì)胞, 在早期抗腫瘤和早期抗病毒或胞內(nèi)寄

12、生菌感染的免疫過程中起重要作用,所以NK細(xì)胞是非特異性免疫系統(tǒng)的主要組分之一3。從檢測發(fā)現(xiàn)肝豆?fàn)詈俗冃曰颊逤D3+、CD4+、CD8+，CD4+CD8+比值均無明顯變化，而NK細(xì)胞則具特異性變化。肝豆?fàn)詈俗冃訬K細(xì)胞減少，主要原因可能與NK細(xì)胞多分布于外周血和脾臟，在淋巴結(jié)和其他組織中只有少量存在4。而銅沉積于WD患者肝臟造成肝細(xì)胞灶性壞死和纖維增生，最終導(dǎo)致結(jié)節(jié)性壞死性肝硬變，往往同時繼發(fā)脾功能亢進(jìn)，以致檢測外周血NK含量減少，說明WD患者存在一定程度的非特異性免疫功能下降缺陷。 外周血T淋巴細(xì)胞及其亞群分析是公認(rèn)的反映機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的較好指標(biāo)。ChildPugh分級法是評價肝功能儲備、肝

13、硬化程度的良好指標(biāo)。檢測發(fā)現(xiàn)，在ChildPugh分級B、C級與A級比較，NK細(xì)胞有統(tǒng)計學(xué)差異顯著性意義，而CD3+、CD4+、CD8+，CD4+CD8+比值均無明顯變化。正常情況下, T淋巴細(xì)胞在淋巴器官及外周血的數(shù)目和亞群的比例相對恒定,機(jī)體得以維持正常的免疫狀態(tài)。NKC是不同于T、B淋巴細(xì)胞而具有直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)的一個特殊淋巴細(xì)胞系,是機(jī)體免疫監(jiān)視的主要成分,具有細(xì)胞免疫和免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,不同程度的肝損害WD患者外周NK細(xì)胞有著不同程度的降低。T細(xì)胞亞群變化不明顯,可能主要因肝臟是體內(nèi)銅中毒的原發(fā)靶器官和銅主要沉積的部位5；過量銅在肝細(xì)胞內(nèi)沉積,導(dǎo)致肝細(xì)胞的變性壞死，而肝臟的損

14、害可通過對體內(nèi)抗原肝處理能力減弱、細(xì)胞因子紊亂、腸源性內(nèi)毒素血癥、門脈高壓癥以及物質(zhì)代謝、生物轉(zhuǎn)化功能障礙等多方面因素對免疫系統(tǒng)有著廣泛影響,使得NKC計數(shù)及活性降低等。故肝功能損害加重到ChildPugh分級B、C級時，非特異性免疫功能出現(xiàn)進(jìn)一步紊亂，這表明患者免疫監(jiān)視功能的下降。 綜上所述, WD患者存在一定程度的非特異性免疫功能缺陷，免疫狀態(tài)紊亂，表現(xiàn)為NKC功能低下，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能未見減弱，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測外周血T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等指標(biāo)可用于臨床WD患者的細(xì)胞免疫狀態(tài)監(jiān)測，這對于深入研究WD的病理生理機(jī)制有一定意義。以上臨床觀察結(jié)論限于病例數(shù)有限，尚需進(jìn)一步研究總結(jié)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 中華神經(jīng)病學(xué)分會.肝豆?fàn)詈俗冃缘脑\斷與治療指南J.中華神經(jīng)科雜志，2008，41(4)：566.2 朱曉玲,王軍,林宜,等.流式細(xì)胞儀檢測中國人外周血淋巴細(xì)胞亞群正常值J.中國醫(yī)學(xué)檢驗雜志,2003,4(2):100