腫瘤組織庫存標本的質(zhì)量控制

1、腫瘤組織庫存標本的質(zhì)量控制 作者：和鋼 孟慶勇 張順 李克強 李旭軍【摘要】 目的：通過對庫存腫瘤標本的質(zhì)量控制，為臨床及科研提供有研究價值的標本。方法：收集已儲存的組織標本，采用RTPCR技術對其RNA、DNA和蛋白的降解進行質(zhì)量檢測。結果：通過對已保存的腫瘤組織標本隨機質(zhì)量檢測，所儲存的標本質(zhì)量符合分子生物學實驗要求。結論：本組庫存腫瘤標本無組織降解。 【關鍵詞】 腫 瘤 標 本 質(zhì)量控制隨著臨床腫瘤研究的日益深入，大量有研究價值的腫瘤標本已被充分利用。而標本的庫存質(zhì)量，對惡性腫瘤的研究形成了制約。基于目前國內(nèi)建立臨床腫瘤標本庫的經(jīng)驗及意義，我實驗室對庫存腫瘤標本，通過提取組織mRNA進行

2、了RTPCR、RNA、DNA電泳進行蛋白降解的質(zhì)量檢測。1 材料與方法1.1 儀器和試劑 液氮罐、-80低溫冰箱、高速離心機(細胞分離)、二氧化氮培養(yǎng)箱、圖像分析系統(tǒng)等;Universal 基因組DNA提取試劑盒、PrimeScript RTPCR 試劑盒、PerfectShot Ex Taq 試劑盒、PrimeSTAR HS DNA Polymerse 、Wide Range DNA Marker 均購自TAKARA公司。1.2 標本采集與貯存 每例標本包括：離體后的瘤組織、癌旁組織和血標本。組織離體后(不影響病理診斷)取瘤組織0.5cm×0.5cm×0.5cm/份，35

3、份/例;另取癌旁組織0.5cm×0.5cm×0.5cm/份，23份/例。取靜脈血510ml，分裝兩份進行血細胞分離離心保存。另外，對于使用新鮮標本的，保存于培養(yǎng)液、PBS液及核酸保護劑內(nèi)。所有標本30min內(nèi)置于-80低溫冰箱長期保存，并登記。1.3 管理與質(zhì)量控制 管理模式：由具體負責人對日常工作的運行進行獨立管理。組成結構：腫瘤標本庫、臨床病理資料數(shù)據(jù)庫、生物樣品庫、組織庫、血清庫、血漿庫;人員資格：專業(yè)培訓(取材、轉運、收藏、編號、錄入、出庫);質(zhì)量控制：定期按每20個序號分析標本的DNA、RNA和蛋白質(zhì)，監(jiān)控其質(zhì)量，確保標本資源經(jīng)長期保存不受破壞和降解。2 結 果2

4、.1 庫存資源 庫內(nèi)保存有肺、食管、乳腺、肝、胃、腸等惡性腫瘤血和組織標本242例(1210份)，其中全套標本137例(包括癌組織、癌旁及血清)。每例組織標本都備有切片和相關的病理診斷，部分標本有照片。2.2 質(zhì)量檢測 標本來源：隨機(每3個月)取組織庫凍存標本3份。數(shù)據(jù)庫編號：G0003(胃癌);C0007(直腸癌);TH0001(甲狀腺癌);實驗編號：2/5(RNA/總DNA)胃癌;3/6(RNA/總DNA)直腸癌; 4/7(RNA/總DNA)甲狀腺癌。1表示分子量對照，27代表被檢測標本電泳。引物合成：根據(jù)GenBank資料，使用Primer Premier 5.0軟件設計管家基因GAP

5、DH、actin引物，分析擴增產(chǎn)物的含量，通過Oligo 6.0軟件驗證。產(chǎn)物量相對較少或無產(chǎn)物，可判斷為不可使用樣本。引物由TAKARA公司合成。將總RNA、基因組DNA進行電泳，用RTPCR方法從總RNA中逆轉錄并擴增GAPDH、actin檢測mRNA的完整性，用PCR方法從基因組DNA中擴增GAPDH基因檢測DNA的完整性。提取的3份RNA條帶亮度在2000bp，DNA條帶亮度在10000bp,見圖1。圖1 樣本PCR擴增電泳圖 通過檢測樣本中actin的蛋白表達量變化，分析印跡條帶，判斷蛋白量是否有變化，無條帶或條帶變?nèi)跽邽榘l(fā)生組織降解樣本。本組3份樣本24、57與1的分子量對比條帶亮

6、度無組織降解樣本。3 討 論注重標本的質(zhì)量控制，應嚴格按照腫瘤組織標本庫及常用技術手冊1的相關要求，使標本對應的臨床病例資料有科學和豐富的信息含量。充分利用計算機信息化管理系統(tǒng)(參考北京大學臨床腫瘤學院腫瘤標本庫資料)，進行信息錄入、儲存、檢索以及數(shù)據(jù)維護、管理等功能，是建立腫瘤標本庫的關鍵。筆者體會，合格腫瘤標本應具備： 標本的采集、處理、保存和使用，腫瘤標本包括組織標本、核酸RNA標本、血清、血漿和淋巴細胞等標本。標本采集強調(diào)在不影響常規(guī)病理或術中切片的條件下留足原始標本，如遇較大標本，可適當放寬采集范圍。各類型標本均應立即行腫瘤庫凍存，要求組織離體后30min內(nèi)將組織置入-196液氮速凍

7、或-80深低溫冷凍保存，血標本離心后分別凍存。組織標本的離體時間對于標本的保存質(zhì)量至關重要，雖然有報道認為正常的乳腺組織在外科切除3小時仍能保持RNA的完整性，但多數(shù)學者推薦標本應在切除后30min內(nèi)取材并保存2，3。技術要求在于取材部位的準確性，包括腫瘤組織和瘤旁組織分界的確定，筆者要求瘤旁0.5cm。為了保證標本的質(zhì)量和完整性，還要避免基因組DNA、RNA和蛋白的降解，對庫存標本定期隨機抽樣進行總RNA 提取鑒定。筆者對庫存標本的檢測表明，規(guī)范的采集和保存，尤其要防止反復凍融，是標本符合研究條件的重要因素。相關信息的儲存、管理和統(tǒng)計。由于標本及信息量大且處于動態(tài)變化之中，整個過程有標本的標

8、記和儲存、信息化管理、組織標本的解凍復蘇以及質(zhì)量控制等。因此，筆者結合腫瘤標本數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)要求，設計了病例資料數(shù)據(jù)庫、標本儲存數(shù)據(jù)庫、提取標本數(shù)據(jù)庫、動態(tài)背景資料數(shù)據(jù)庫，專人管理與錄入。嚴格操作規(guī)程，對潛在、已知的危害進行定義和分類，制定相應書面規(guī)程，如入、出庫的登記，存留標本的數(shù)量等。應具備的條件: 穩(wěn)定的腫瘤標本來源。良好的臨床病理診斷條件,以保證庫存標本的科學性和可用性。對一時尚未確診者可先立另冊,等確診后再行入庫。有經(jīng)驗的臨床或檢驗人員具體負責和操作。具備-80以下的低溫冰箱或液氮保存裝置。規(guī)范化腫瘤標本入庫，貼有牢固的標簽。按規(guī)定程序?qū)齑鏄吮具M行有關生化、細菌和真菌等方面的常規(guī)檢查,以了解標本有無變質(zhì)和受到污染。應用信息化管理系統(tǒng)對腫瘤庫存標本進行管理?！緟⒖嘉墨I】 1 季加孚,袁志宏,步召德.腫瘤組織標本庫常用實驗技術手冊.北京:科學出版社，2006.20272 Isabelle M，Teodorovic I，Morente MM，et al.TuBaFrost 5: multifunctional central database application for a European Tumor Bank.Eur J Cancer，2006,42(18):310331093 Mager SR，Oomen MH，