腫瘤組織庫(kù)存標(biāo)本的質(zhì)量控制

1、腫瘤組織庫(kù)存標(biāo)本的質(zhì)量控制 作者：和鋼 孟慶勇 張順 李克強(qiáng) 李旭軍【摘要】 目的：通過(guò)對(duì)庫(kù)存腫瘤標(biāo)本的質(zhì)量控制，為臨床及科研提供有研究?jī)r(jià)值的標(biāo)本。方法：收集已儲(chǔ)存的組織標(biāo)本，采用RTPCR技術(shù)對(duì)其RNA、DNA和蛋白的降解進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。結(jié)果：通過(guò)對(duì)已保存的腫瘤組織標(biāo)本隨機(jī)質(zhì)量檢測(cè)，所儲(chǔ)存的標(biāo)本質(zhì)量符合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。結(jié)論：本組庫(kù)存腫瘤標(biāo)本無(wú)組織降解。 【關(guān)鍵詞】 腫 瘤 標(biāo) 本 質(zhì)量控制隨著臨床腫瘤研究的日益深入，大量有研究?jī)r(jià)值的腫瘤標(biāo)本已被充分利用。而標(biāo)本的庫(kù)存質(zhì)量，對(duì)惡性腫瘤的研究形成了制約?；谀壳皣?guó)內(nèi)建立臨床腫瘤標(biāo)本庫(kù)的經(jīng)驗(yàn)及意義，我實(shí)驗(yàn)室對(duì)庫(kù)存腫瘤標(biāo)本，通過(guò)提取組織mRNA進(jìn)行

2、了RTPCR、RNA、DNA電泳進(jìn)行蛋白降解的質(zhì)量檢測(cè)。1 材料與方法1.1 儀器和試劑 液氮罐、-80低溫冰箱、高速離心機(jī)(細(xì)胞分離)、二氧化氮培養(yǎng)箱、圖像分析系統(tǒng)等;Universal 基因組DNA提取試劑盒、PrimeScript RTPCR 試劑盒、PerfectShot Ex Taq 試劑盒、PrimeSTAR HS DNA Polymerse 、Wide Range DNA Marker 均購(gòu)自TAKARA公司。1.2 標(biāo)本采集與貯存 每例標(biāo)本包括：離體后的瘤組織、癌旁組織和血標(biāo)本。組織離體后(不影響病理診斷)取瘤組織0.5cm×0.5cm×0.5cm/份，35

3、份/例;另取癌旁組織0.5cm×0.5cm×0.5cm/份，23份/例。取靜脈血510ml，分裝兩份進(jìn)行血細(xì)胞分離離心保存。另外，對(duì)于使用新鮮標(biāo)本的，保存于培養(yǎng)液、PBS液及核酸保護(hù)劑內(nèi)。所有標(biāo)本30min內(nèi)置于-80低溫冰箱長(zhǎng)期保存，并登記。1.3 管理與質(zhì)量控制 管理模式：由具體負(fù)責(zé)人對(duì)日常工作的運(yùn)行進(jìn)行獨(dú)立管理。組成結(jié)構(gòu)：腫瘤標(biāo)本庫(kù)、臨床病理資料數(shù)據(jù)庫(kù)、生物樣品庫(kù)、組織庫(kù)、血清庫(kù)、血漿庫(kù);人員資格：專業(yè)培訓(xùn)(取材、轉(zhuǎn)運(yùn)、收藏、編號(hào)、錄入、出庫(kù));質(zhì)量控制：定期按每20個(gè)序號(hào)分析標(biāo)本的DNA、RNA和蛋白質(zhì)，監(jiān)控其質(zhì)量，確保標(biāo)本資源經(jīng)長(zhǎng)期保存不受破壞和降解。2 結(jié) 果2

4、.1 庫(kù)存資源 庫(kù)內(nèi)保存有肺、食管、乳腺、肝、胃、腸等惡性腫瘤血和組織標(biāo)本242例(1210份)，其中全套標(biāo)本137例(包括癌組織、癌旁及血清)。每例組織標(biāo)本都備有切片和相關(guān)的病理診斷，部分標(biāo)本有照片。2.2 質(zhì)量檢測(cè) 標(biāo)本來(lái)源：隨機(jī)(每3個(gè)月)取組織庫(kù)凍存標(biāo)本3份。數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)：G0003(胃癌);C0007(直腸癌);TH0001(甲狀腺癌);實(shí)驗(yàn)編號(hào)：2/5(RNA/總DNA)胃癌;3/6(RNA/總DNA)直腸癌; 4/7(RNA/總DNA)甲狀腺癌。1表示分子量對(duì)照，27代表被檢測(cè)標(biāo)本電泳。引物合成：根據(jù)GenBank資料，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)管家基因GAP

5、DH、actin引物，分析擴(kuò)增產(chǎn)物的含量，通過(guò)Oligo 6.0軟件驗(yàn)證。產(chǎn)物量相對(duì)較少或無(wú)產(chǎn)物，可判斷為不可使用樣本。引物由TAKARA公司合成。將總RNA、基因組DNA進(jìn)行電泳，用RTPCR方法從總RNA中逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增GAPDH、actin檢測(cè)mRNA的完整性，用PCR方法從基因組DNA中擴(kuò)增GAPDH基因檢測(cè)DNA的完整性。提取的3份RNA條帶亮度在2000bp，DNA條帶亮度在10000bp,見圖1。圖1 樣本PCR擴(kuò)增電泳圖 通過(guò)檢測(cè)樣本中actin的蛋白表達(dá)量變化，分析印跡條帶，判斷蛋白量是否有變化，無(wú)條帶或條帶變?nèi)跽邽榘l(fā)生組織降解樣本。本組3份樣本24、57與1的分子量對(duì)比條帶亮

6、度無(wú)組織降解樣本。3 討 論注重標(biāo)本的質(zhì)量控制，應(yīng)嚴(yán)格按照腫瘤組織標(biāo)本庫(kù)及常用技術(shù)手冊(cè)1的相關(guān)要求，使標(biāo)本對(duì)應(yīng)的臨床病例資料有科學(xué)和豐富的信息含量。充分利用計(jì)算機(jī)信息化管理系統(tǒng)(參考北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院腫瘤標(biāo)本庫(kù)資料)，進(jìn)行信息錄入、儲(chǔ)存、檢索以及數(shù)據(jù)維護(hù)、管理等功能，是建立腫瘤標(biāo)本庫(kù)的關(guān)鍵。筆者體會(huì)，合格腫瘤標(biāo)本應(yīng)具備： 標(biāo)本的采集、處理、保存和使用，腫瘤標(biāo)本包括組織標(biāo)本、核酸RNA標(biāo)本、血清、血漿和淋巴細(xì)胞等標(biāo)本。標(biāo)本采集強(qiáng)調(diào)在不影響常規(guī)病理或術(shù)中切片的條件下留足原始標(biāo)本，如遇較大標(biāo)本，可適當(dāng)放寬采集范圍。各類型標(biāo)本均應(yīng)立即行腫瘤庫(kù)凍存，要求組織離體后30min內(nèi)將組織置入-196液氮速凍

7、或-80深低溫冷凍保存，血標(biāo)本離心后分別凍存。組織標(biāo)本的離體時(shí)間對(duì)于標(biāo)本的保存質(zhì)量至關(guān)重要，雖然有報(bào)道認(rèn)為正常的乳腺組織在外科切除3小時(shí)仍能保持RNA的完整性，但多數(shù)學(xué)者推薦標(biāo)本應(yīng)在切除后30min內(nèi)取材并保存2，3。技術(shù)要求在于取材部位的準(zhǔn)確性，包括腫瘤組織和瘤旁組織分界的確定，筆者要求瘤旁0.5cm。為了保證標(biāo)本的質(zhì)量和完整性，還要避免基因組DNA、RNA和蛋白的降解，對(duì)庫(kù)存標(biāo)本定期隨機(jī)抽樣進(jìn)行總RNA 提取鑒定。筆者對(duì)庫(kù)存標(biāo)本的檢測(cè)表明，規(guī)范的采集和保存，尤其要防止反復(fù)凍融，是標(biāo)本符合研究條件的重要因素。相關(guān)信息的儲(chǔ)存、管理和統(tǒng)計(jì)。由于標(biāo)本及信息量大且處于動(dòng)態(tài)變化之中，整個(gè)過(guò)程有標(biāo)本的標(biāo)

8、記和儲(chǔ)存、信息化管理、組織標(biāo)本的解凍復(fù)蘇以及質(zhì)量控制等。因此，筆者結(jié)合腫瘤標(biāo)本數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)要求，設(shè)計(jì)了病例資料數(shù)據(jù)庫(kù)、標(biāo)本儲(chǔ)存數(shù)據(jù)庫(kù)、提取標(biāo)本數(shù)據(jù)庫(kù)、動(dòng)態(tài)背景資料數(shù)據(jù)庫(kù)，專人管理與錄入。嚴(yán)格操作規(guī)程，對(duì)潛在、已知的危害進(jìn)行定義和分類，制定相應(yīng)書面規(guī)程，如入、出庫(kù)的登記，存留標(biāo)本的數(shù)量等。應(yīng)具備的條件: 穩(wěn)定的腫瘤標(biāo)本來(lái)源。良好的臨床病理診斷條件,以保證庫(kù)存標(biāo)本的科學(xué)性和可用性。對(duì)一時(shí)尚未確診者可先立另冊(cè),等確診后再行入庫(kù)。有經(jīng)驗(yàn)的臨床或檢驗(yàn)人員具體負(fù)責(zé)和操作。具備-80以下的低溫冰箱或液氮保存裝置。規(guī)范化腫瘤標(biāo)本入庫(kù)，貼有牢固的標(biāo)簽。按規(guī)定程序?qū)?kù)存標(biāo)本進(jìn)行有關(guān)生化、細(xì)菌和真菌等方面的常規(guī)檢查,以了解標(biāo)本有無(wú)變質(zhì)和受到污染。應(yīng)用信息化管理系統(tǒng)對(duì)腫瘤庫(kù)存標(biāo)本進(jìn)行管理。【參考文獻(xiàn)】 1 季加孚,袁志宏,步召德.腫瘤組織標(biāo)本庫(kù)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè).北京:科學(xué)出版社，2006.20272 Isabelle M，Teodorovic I，Morente MM，et al.TuBaFrost 5: multifunctional central database application for a European Tumor Bank.Eur J Cancer，2006,42(18):310331093 Mager SR，Oomen MH，