胚胎冷凍保存專業(yè)知識(shí)

1、胚胚 胎胎 冷冷 凍凍 保保 存存1稻谷課件將胚胎貯存在將胚胎貯存在196196超低溫下長(zhǎng)期保存超低溫下長(zhǎng)期保存的方法。這是的方法。這是2020世記世記7070年代試驗(yàn)成功的一項(xiàng)新年代試驗(yàn)成功的一項(xiàng)新技術(shù)，是胚胎移植技術(shù)的重大突破。技術(shù)，是胚胎移植技術(shù)的重大突破。胚胎冷凍保存的基本概念2稻谷課件胚胎冷凍保存的意義胚胎移植不受時(shí)間和地點(diǎn)的限制，提高了胚胚胎移植不受時(shí)間和地點(diǎn)的限制，提高了胚胎移植技術(shù)的效率；胎移植技術(shù)的效率；長(zhǎng)期保存優(yōu)良母?；蜃羁煽康募夹g(shù)措施；長(zhǎng)期保存優(yōu)良母?；蜃羁煽康募夹g(shù)措施； 便于國(guó)際間交流；便于國(guó)際間交流；替代種畜引種。替代種畜引種。3稻谷課件 滲透性：甘油、乙二醇（甘

2、油、乙二醇（egeg）、丙二醇（）、丙二醇（pgpg）和）和dmsodmso等，防止溶質(zhì)效應(yīng)。等，防止溶質(zhì)效應(yīng)。 非滲透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、pvppvp和聚蔗糖等，和聚蔗糖等，降低胚胎外液的冰點(diǎn)，減少胚胎外冰晶形成，并能促使降低胚胎外液的冰點(diǎn)，減少胚胎外冰晶形成，并能促使胚胎內(nèi)部的水分外流，從而最終減少胚胎內(nèi)部冰晶的形胚胎內(nèi)部的水分外流，從而最終減少胚胎內(nèi)部冰晶的形成。成。基礎(chǔ)液：基礎(chǔ)液： mpbs（改良）、（改良）、 tcm-199、pbs、hepes等，最常用等，最常用mpbs。 抗凍劑的種類及作用特點(diǎn)：分子量小于100，易于滲透特點(diǎn)：分子量大，不進(jìn)入細(xì)胞4

3、稻谷課件玻璃化的概念：玻璃化的概念：是一種物理現(xiàn)象，指通過(guò)快速降溫越過(guò)冰晶形成的階段，是一種物理現(xiàn)象，指通過(guò)快速降溫越過(guò)冰晶形成的階段，不發(fā)生結(jié)晶即可固化，使溶液形成一種無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定玻璃樣固不發(fā)生結(jié)晶即可固化，使溶液形成一種無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定玻璃樣固體，且保持液態(tài)時(shí)正常的分子和離子分布，則胚胎細(xì)胞免受損傷。體，且保持液態(tài)時(shí)正常的分子和離子分布，則胚胎細(xì)胞免受損傷。即高濃度的抗凍劑，急速冷卻后，液體的黏性增加，冰晶不能即高濃度的抗凍劑，急速冷卻后，液體的黏性增加，冰晶不能形成，由液態(tài)變?yōu)橥该靼牍虘B(tài)的現(xiàn)象。形成，由液態(tài)變?yōu)橥该靼牍虘B(tài)的現(xiàn)象。玻璃化溶液（玻璃化溶液（vsvs）：）：細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑：

4、細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑：這種抗凍劑這種抗凍劑分子量小，容易透過(guò)細(xì)胞膜，分子量小，容易透過(guò)細(xì)胞膜，使其內(nèi)使其內(nèi)部迅速達(dá)到玻璃化所需要的濃度，所以稱為細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑。如二部迅速達(dá)到玻璃化所需要的濃度，所以稱為細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑。如二甲基亞砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。甲基亞砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。細(xì)胞外液抗凍劑：細(xì)胞外液抗凍劑：這種抗凍劑這種抗凍劑分子量較大，一般很難透過(guò)細(xì)胞膜，分子量較大，一般很難透過(guò)細(xì)胞膜，所以稱為細(xì)胞外液抗凍劑。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡所以稱為細(xì)胞外液抗凍劑。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（bsab

5、sa）等。）等。上述兩種抗凍劑組合后，用基礎(chǔ)液上述兩種抗凍劑組合后，用基礎(chǔ)液mpbsmpbs調(diào)制成各種玻璃化溶液。調(diào)制成各種玻璃化溶液?？箖鰟┑姆N類及作用5稻谷課件 結(jié)晶變化：結(jié)晶變化： 溫度降至冰點(diǎn)時(shí)，冰晶首先在胚胎外液溫度降至冰點(diǎn)時(shí)，冰晶首先在胚胎外液形成。溫度、冰晶和外液的溶質(zhì)濃度，迫使胚胎內(nèi)部形成。溫度、冰晶和外液的溶質(zhì)濃度，迫使胚胎內(nèi)部的水不斷外流，胚胎內(nèi)部溶質(zhì)濃度增加。的水不斷外流，胚胎內(nèi)部溶質(zhì)濃度增加。 溶質(zhì)效應(yīng)：溶質(zhì)效應(yīng)： 降溫速度太慢，胚胎內(nèi)水充分外流，溶降溫速度太慢，胚胎內(nèi)水充分外流，溶質(zhì)濃度極度增加，細(xì)胞膜的脂蛋白復(fù)合物和胞質(zhì)內(nèi)的質(zhì)濃度極度增加，細(xì)胞膜的脂蛋白復(fù)合物和胞質(zhì)

6、內(nèi)的一些其他功能蛋白變性，造成對(duì)胚胎的不可逆損害。一些其他功能蛋白變性，造成對(duì)胚胎的不可逆損害。 機(jī)械效應(yīng)：機(jī)械效應(yīng)： 降溫速度過(guò)快，胚胎內(nèi)部的水來(lái)不及溢降溫速度過(guò)快，胚胎內(nèi)部的水來(lái)不及溢出到胚胎外面而直接在胚胎內(nèi)部形成冰晶，從而對(duì)胚出到胚胎外面而直接在胚胎內(nèi)部形成冰晶，從而對(duì)胚胎造成致命的機(jī)械損傷。胎造成致命的機(jī)械損傷。 胚胎冷凍保存過(guò)程中的變化和損傷6稻谷課件 常規(guī)冷凍法：“植冰植冰”后控制降溫速度，避免過(guò)后控制降溫速度，避免過(guò)快以免胚胎內(nèi)部形成大塊冰晶；避免過(guò)慢，以免胚胎快以免胚胎內(nèi)部形成大塊冰晶；避免過(guò)慢，以免胚胎過(guò)分脫水而產(chǎn)生溶質(zhì)效應(yīng)。過(guò)分脫水而產(chǎn)生溶質(zhì)效應(yīng)。 超速冷凍法：非滲透性防

7、凍劑對(duì)胚胎進(jìn)行凍前脫非滲透性防凍劑對(duì)胚胎進(jìn)行凍前脫水處理，將胚胎平衡一段時(shí)間，而后投入液氮保存。水處理，將胚胎平衡一段時(shí)間，而后投入液氮保存。 玻璃化冷凍法：應(yīng)用高濃度防凍劑，使胚胎內(nèi)外應(yīng)用高濃度防凍劑，使胚胎內(nèi)外液的同源晶核形成溫度與玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度基本接近，液的同源晶核形成溫度與玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度基本接近，控制防凍劑與胚胎的平衡時(shí)間和溫度，使防凍劑對(duì)胚控制防凍劑與胚胎的平衡時(shí)間和溫度，使防凍劑對(duì)胚胎毒性降低到最低程度。胚胎內(nèi)外液能迅速轉(zhuǎn)化形成胎毒性降低到最低程度。胚胎內(nèi)外液能迅速轉(zhuǎn)化形成玻璃體，直接投入液氮保存。玻璃體，直接投入液氮保存。 胚胎冷凍保存方法7稻谷課件 歷史：歷史：19721972

8、年首先獲小鼠胚胎冷凍成功；年首先獲小鼠胚胎冷凍成功；19731973年牛的胚胎冷凍后獲得成功，并產(chǎn)下后代。年牛的胚胎冷凍后獲得成功，并產(chǎn)下后代。 操作流程：操作流程：（1 1）抗凍液中平衡：）抗凍液中平衡：室溫下（室溫下（20202525），在含有），在含有1 12 2摩爾摩爾升抗凍劑的磷酸緩沖液（升抗凍劑的磷酸緩沖液（pbspbs）中，胚胎經(jīng)）中，胚胎經(jīng)1010分鐘平衡，使細(xì)胞內(nèi)部抗凍劑濃度基本達(dá)到飽和。分鐘平衡，使細(xì)胞內(nèi)部抗凍劑濃度基本達(dá)到飽和。常 規(guī) 冷 凍 法8稻谷課件（2 2）植冰（誘發(fā)結(jié)冰）：）植冰（誘發(fā)結(jié)冰）：植冰的概念：植冰的概念：在液氮中冷卻后的鑷子或棉簽夾住塑料細(xì)管上在液氮

9、中冷卻后的鑷子或棉簽夾住塑料細(xì)管上端（棉栓端），使抗凍液迅速通過(guò)端（棉栓端），使抗凍液迅速通過(guò)66左右冰點(diǎn)，強(qiáng)制左右冰點(diǎn)，強(qiáng)制性地使細(xì)胞外液形成冰晶，稱之為植冰。性地使細(xì)胞外液形成冰晶，稱之為植冰。目的：目的：當(dāng)溫度降到抗凍液冰點(diǎn)附近時(shí)，經(jīng)植冰迅速凍結(jié)，以當(dāng)溫度降到抗凍液冰點(diǎn)附近時(shí)，經(jīng)植冰迅速凍結(jié)，以防胚胎細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生冰晶，給胚胎造成物理性的損傷，致防胚胎細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生冰晶，給胚胎造成物理性的損傷，致使胚胎死亡。使胚胎死亡。將胚胎移入事先配置好抗凍液的將胚胎移入事先配置好抗凍液的0.250.25毫升塑料細(xì)管內(nèi)毫升塑料細(xì)管內(nèi)封口后進(jìn)行冷卻。當(dāng)溫度降至封口后進(jìn)行冷卻。當(dāng)溫度降至66左右時(shí)，用上述方法

10、左右時(shí)，用上述方法誘發(fā)結(jié)冰。誘發(fā)結(jié)冰。常 規(guī) 冷 凍 法9稻谷課件（3 3）自動(dòng)降溫儀中緩慢降溫）自動(dòng)降溫儀中緩慢降溫：植冰后的細(xì)管按一定速度緩：植冰后的細(xì)管按一定速度緩慢降溫。慢降溫。 以以0.330.33分鐘降至分鐘降至30303535時(shí)投入液氮；時(shí)投入液氮； 以以1.01.0分鐘的速度降至分鐘的速度降至8080時(shí)投入液氮；時(shí)投入液氮； 以以0.50.5分鐘降至分鐘降至30303535時(shí)投入液氮。時(shí)投入液氮。原理：原理：植冰后使細(xì)胞外液濃度相對(duì)增高，促使細(xì)胞內(nèi)部水分植冰后使細(xì)胞外液濃度相對(duì)增高，促使細(xì)胞內(nèi)部水分充分脫出，因此緩慢降溫是非常必要的。由于脫水使細(xì)胞充分脫出，因此緩慢降溫是非常必

11、要的。由于脫水使細(xì)胞內(nèi)部充分收縮，同時(shí)抗凍劑滲透到細(xì)胞內(nèi)部使內(nèi)部溶液黏內(nèi)部充分收縮，同時(shí)抗凍劑滲透到細(xì)胞內(nèi)部使內(nèi)部溶液黏性增大，這時(shí)投入液氮中，由于過(guò)冷抑制冰晶形成。性增大，這時(shí)投入液氮中，由于過(guò)冷抑制冰晶形成。常 規(guī) 冷 凍 法10稻谷課件（4 4）解凍：）解凍：貯存在液氮中的塑料細(xì)管取出后，迅速浸入室貯存在液氮中的塑料細(xì)管取出后，迅速浸入室溫或溫或3737水浴中解凍。水浴中解凍。（5 5）除去抗凍劑：）除去抗凍劑：原因：原因： 解凍后的胚胎，細(xì)胞內(nèi)部抗凍劑濃度較高，對(duì)胚胎解凍后的胚胎，細(xì)胞內(nèi)部抗凍劑濃度較高，對(duì)胚胎有毒害作用；此外，若直接移入等滲生理溶液中，水分會(huì)有毒害作用；此外，若直接移

12、入等滲生理溶液中，水分會(huì)伸入細(xì)胞內(nèi)引起膨脹，使細(xì)胞受損傷。伸入細(xì)胞內(nèi)引起膨脹，使細(xì)胞受損傷?？箖鲆海嚎箖鲆海赫崽侨芤海徽崽侨芤?；操作：操作：解凍后胚胎由解凍后胚胎由濃度高的抗凍液濃度高的抗凍液中移向中移向濃度低的抗凍液，濃度低的抗凍液，進(jìn)行梯度稀釋進(jìn)行梯度稀釋；即將胚胎先移入高滲蔗糖溶液中，再移入；即將胚胎先移入高滲蔗糖溶液中，再移入低滲蔗糖溶液中，在脫水的同時(shí)脫出抗凍劑，而后移入等低滲蔗糖溶液中，在脫水的同時(shí)脫出抗凍劑，而后移入等滲生理溶液中洗凈，待胚胎基本復(fù)原后進(jìn)行移植或繼續(xù)培滲生理溶液中洗凈，待胚胎基本復(fù)原后進(jìn)行移植或繼續(xù)培養(yǎng)。養(yǎng)。常 規(guī) 冷 凍 法11稻谷課件 從培養(yǎng)液中吸取胚胎，并放

13、置在冷凍液中: 1.5m 乙二醇 + 蔗糖 + pbs + aa + fcs 裝入細(xì)管 (編號(hào)預(yù)先準(zhǔn)備好) 放入冷凍容器 -6.0 seeding ice 每分鐘降低 0.5 ，一直到-30為止 放入液氮容器常 規(guī) 冷 凍 程 序12稻谷課件玻璃化的概念：玻璃化的概念：是一種物理現(xiàn)象，指通過(guò)快速降溫越過(guò)冰晶形成的階段，是一種物理現(xiàn)象，指通過(guò)快速降溫越過(guò)冰晶形成的階段，不發(fā)生結(jié)晶即可固化，使溶液形成一種無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定玻璃樣固不發(fā)生結(jié)晶即可固化，使溶液形成一種無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定玻璃樣固體，且保持液態(tài)時(shí)正常的分子和離子分布，則胚胎細(xì)胞免受損傷。體，且保持液態(tài)時(shí)正常的分子和離子分布，則胚胎細(xì)胞免受損傷

14、。即高濃度的抗凍劑，急速冷卻后，液體的黏性增加，冰晶不能即高濃度的抗凍劑，急速冷卻后，液體的黏性增加，冰晶不能形成，由液態(tài)變?yōu)橥该靼牍虘B(tài)的現(xiàn)象。形成，由液態(tài)變?yōu)橥该靼牍虘B(tài)的現(xiàn)象。玻璃化溶液（玻璃化溶液（vsvs）：）：細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑：細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑：這種抗凍劑這種抗凍劑分子量小，容易透過(guò)細(xì)胞膜，分子量小，容易透過(guò)細(xì)胞膜，使其內(nèi)使其內(nèi)部迅速達(dá)到玻璃化所需要的濃度，所以稱為細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑。如二部迅速達(dá)到玻璃化所需要的濃度，所以稱為細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑。如二甲基亞砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。甲基亞砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。細(xì)胞外液抗凍劑：細(xì)胞外液抗凍劑：這種抗凍劑這種抗凍劑分子量較大，一

15、般很難透過(guò)細(xì)胞膜，分子量較大，一般很難透過(guò)細(xì)胞膜，所以稱為細(xì)胞外液抗凍劑。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡所以稱為細(xì)胞外液抗凍劑。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（bsabsa）等。）等。上述兩種抗凍劑組合后，用基礎(chǔ)液上述兩種抗凍劑組合后，用基礎(chǔ)液mpbsmpbs調(diào)制成各種玻璃化溶液。調(diào)制成各種玻璃化溶液。胚胎玻璃化冷凍13稻谷課件幾種常見(jiàn)的玻璃化冷凍方法：幾種常見(jiàn)的玻璃化冷凍方法：（1 1）rallrall等（等（19851985）玻璃化冷凍保存法：）玻璃化冷凍保存法：是最初發(fā)明的玻是最初發(fā)明的玻璃化冷凍保存方法，他們采用的璃化冷

16、凍保存方法，他們采用的vs1vs1玻璃化溶液，是以透玻璃化溶液，是以透過(guò)性抗凍劑二甲基亞砜過(guò)性抗凍劑二甲基亞砜（dmsodmso）為主體溶液）為主體溶液，為緩和其化，為緩和其化學(xué)毒性，添加了乙酰胺學(xué)毒性，添加了乙酰胺(aa)(aa)、丙二醇、丙二醇(pg)(pg)和非透過(guò)性抗凍和非透過(guò)性抗凍劑聚乙二醇劑聚乙二醇(peg)(peg)。pegpeg具有促進(jìn)玻璃化形成的作用。胚胎具有促進(jìn)玻璃化形成的作用。胚胎在玻璃化溶液中平衡時(shí)，濃度由低到高（在玻璃化溶液中平衡時(shí)，濃度由低到高（25255050100100vs1vs1）；平衡溫度由高到低（）；平衡溫度由高到低（22224 444）三步完）三步完成，

17、計(jì)成，計(jì)3535分鐘平衡后投入液氮中冷凍保存。分鐘平衡后投入液氮中冷凍保存。胚胎玻璃化冷凍14稻谷課件（2 2）scheffenscheffen等玻璃化冷凍保存法：等玻璃化冷凍保存法：主體抗凍劑：主體抗凍劑：丙三醇（丙三醇（g g）和丙二醇）和丙二醇(p)(p)；玻璃化溶液：玻璃化溶液：上述兩種抗凍劑各含上述兩種抗凍劑各含2525混合而成混合而成(pg25)(pg25)，兩者混合后可降低溶液的化學(xué)毒性，無(wú)需添加細(xì)胞非透兩者混合后可降低溶液的化學(xué)毒性，無(wú)需添加細(xì)胞非透過(guò)性抗凍劑。過(guò)性抗凍劑。方法：方法：室溫下（室溫下（20202525），胚胎于），胚胎于1010丙三醇溶液中平丙三醇溶液中平衡衡1

18、010分鐘，然后在分鐘，然后在pg25pg25中平衡中平衡3030秒鐘，然后投入液氮中秒鐘，然后投入液氮中冷凍保存。冷凍保存。15稻谷課件（3 3）kasaikasai等玻璃化冷凍保存法：等玻璃化冷凍保存法：抗凍劑：抗凍劑：乙二醇（乙二醇（egeg）為細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑（透過(guò)性保護(hù)）為細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑（透過(guò)性保護(hù)劑），其具備分子量小、溶液滲透壓高、細(xì)胞膜透過(guò)性劑），其具備分子量小、溶液滲透壓高、細(xì)胞膜透過(guò)性強(qiáng)的特點(diǎn)；聚蔗糖（強(qiáng)的特點(diǎn)；聚蔗糖（ficollficoll）為細(xì)胞外液抗凍劑，有利）為細(xì)胞外液抗凍劑，有利于促進(jìn)玻璃化形成；蔗糖于促進(jìn)玻璃化形成；蔗糖(sucrose)(sucrose)是為了冷

19、凍前胚胎是為了冷凍前胚胎細(xì)胞的脫水，細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞的脫水，細(xì)胞內(nèi)部egeg的調(diào)整及解凍后的的調(diào)整及解凍后的egeg的脫出。的脫出。玻璃化溶液：玻璃化溶液：上述三種抗凍劑經(jīng)上述三種抗凍劑經(jīng)mpbsmpbs調(diào)整成調(diào)整成efsefs玻璃化溶玻璃化溶液；液；方法：方法：室溫胚胎在室溫胚胎在efsefs玻璃化溶液中玻璃化溶液中2 25 5分鐘平衡后，即分鐘平衡后，即投入液氮。投入液氮。胚胎玻璃化冷凍16稻谷課件（2 2）zhuzhu等玻璃化冷凍保存法：等玻璃化冷凍保存法：主體抗凍劑：主體抗凍劑：乙二醇、甘油和二甲基亞砜；乙二醇、甘油和二甲基亞砜；玻璃化溶液：玻璃化溶液：efsefs、gfsgfs和和edfsedfs；方法：方法：室溫下，將胚胎在室溫下，將胚胎在1010乙二醇或乙二醇或1010甘油或甘油或1010乙乙二醇二醇1010二甲基亞砜中平衡二甲基亞砜中平衡5 5分鐘，再移入分鐘，再移入efsefs或或gfsgfs或或edfsedfs玻璃化溶液中平衡玻璃化溶液中平衡3030秒鐘，即兩步法冷凍保存。秒鐘，即兩步法冷凍保存。此方法重復(fù)性較