第7章高效液相色譜

1、第第1 1節(jié)節(jié) 概述概述 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLCHPLC）是在經(jīng)典液相色）是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜氣相色譜的理論，在技術(shù)上的理論，在技術(shù)上采用了采用了高壓泵高壓泵、高效固定相高效固定相和高靈敏度和高靈敏度檢測器檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。為了更好地了解高效液相色譜法動化的特點。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進行比較：優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進行比較： 高效液相比經(jīng)典液相的最大優(yōu)點在于高效液相比經(jīng)典液相的最大優(yōu)點在于高速、高效、高速、高效、高靈敏度、高自動化高靈敏度、

2、高自動化。高速是指比經(jīng)典液相色譜法快。高速是指比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料重力加料，流出速度極慢；，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達 10103 3cmcm3 3minmin-1-1。例如分離苯的羥基化合物，。例如分離苯的羥基化合物，7 7個組分只個組分只需需1min1min就可完成。對就可完成。對氨基酸分離氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱，用經(jīng)典色譜法，柱長約長約170cm170cm，柱徑，柱徑0.9cm0.9cm，流動相速度為，流動相速度為30cm30cm3 3h h-1-1，需

3、，需用用2020多小時才能分離出多小時才能分離出2020種氨基酸；而用高效液相色種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需譜法，只需lhlh。又如用。又如用25cm25cm0.46cm0.46cm的柱，采用梯度的柱，采用梯度洗脫，可在不到洗脫，可在不到0.5h0.5h內(nèi)分離出尿中內(nèi)分離出尿中104104個組分。個組分。 （l l）氣相只限于分析氣體和沸點較低的化）氣相只限于分析氣體和沸點較低的化合物，合物，它們僅占有機物總數(shù)的它們僅占有機物總數(shù)的2020。對于占有機對于占有機物總數(shù)近物總數(shù)近8080的那些的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，主要采用高效液相色譜法。質(zhì)量大

4、的物質(zhì)，主要采用高效液相色譜法。 (2)(2)氣相色譜采用流動相是氣相色譜采用流動相是惰性氣體惰性氣體，它不，它不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中譜法中流動相可選用不同極性的液體流動相可選用不同極性的液體，選擇余地，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力。因此，流動相大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力。因此，流動相對分離起很大作用，選擇最佳分離條件更方便。對分離起很大作用，選擇最佳分離條件更方便。東晉名醫(yī)葛洪的著作東晉名醫(yī)葛洪的著作肘后備急方肘后備急方中的中的“青蒿一握，青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之以水二升漬，絞取汁，盡服之”，她意識到

5、常用煎熬和，她意識到常用煎熬和高溫提取的方法可能破壞了青蒿有效成分。高溫提取的方法可能破壞了青蒿有效成分。不出所料，改用乙醚低溫提取后，研究人員如愿獲不出所料，改用乙醚低溫提取后，研究人員如愿獲得了抗瘧效果更好的青蒿提取物。得了抗瘧效果更好的青蒿提取物。 (3)氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。 總之，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)總之，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點。目前高效液相色譜法得到廣泛應(yīng)典液相色譜優(yōu)點。目前高效液相色譜法得到廣泛應(yīng)用，例如蛋白質(zhì)、

6、核酸、氨基酸、多糖類、植物色用，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等的分離和分析。素、高聚物、染料及藥物等的分離和分析。 高效液相色譜法的儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴高效液相色譜法的儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴格，這是它的主要缺點。格，這是它的主要缺點。 高效液相色譜儀一般可分為高效液相色譜儀一般可分為4 4個主要部分：個主要部分： 高壓輸液系統(tǒng)，高壓輸液系統(tǒng)， 進樣系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)， 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng)。檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：此外還配有輔助裝置： 梯度淋洗，梯度淋洗， 自動進樣自動進樣 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理梯度洗脫梯度洗脫通過兩個輸液泵流速的變化，改變流動相的洗

7、脫能力，其作用與氣相色譜的程序升溫類似。ABABCC1高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng) 由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。一般對流動相阻力很大，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中組成，其中高壓輸液泵高壓輸液泵是核心部件。常用的輸液泵分是核心部件。常用的輸液泵分為為恒流泵恒流泵和和恒壓泵恒壓泵兩種。恒流泵特點是在一定操作條兩種。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無件下，輸出流量保持恒定而與

8、色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差，它們色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差，它們各有優(yōu)缺點。目前各有優(yōu)缺點。目前恒流泵恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機械泵，它又分機械注射泵和機械往復(fù)泵兩種，又稱機械泵，它又分機械注射泵和機械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是應(yīng)用最多的是機械往復(fù)泵機械往復(fù)泵。 高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約530cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展

9、寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術(shù)要求較嚴。進樣技術(shù)要求較嚴。 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限

10、，內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長故金屬管用得較多。一般色譜柱長5 530cm30cm，內(nèi)徑為內(nèi)徑為4 45mm5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑，凝膠色譜柱內(nèi)徑3 312mm12mm，制備往內(nèi)徑較大，制備往內(nèi)徑較大，可達可達25mm 25mm 以上。以上。 一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離柱的性能不受影

11、響中固定相，保證分離柱的性能不受影響。 在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。電導(dǎo)檢測器等。（l l）紫外檢測器紫外檢測器 、二極管陣列檢測器、二極管陣列檢

12、測器（2 2）熒光檢測器熒光檢測器 （3 3）示差折光率檢測器示差折光率檢測器 幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測器是一種通用型檢測器。靈敏度可達檢測器是一種通用型檢測器。靈敏度可達1010-7-7g gcmcm-3-3。主要。主要缺點是對溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。缺點是對溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 （4 4）電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器 （5 5）附屬系統(tǒng)附屬系統(tǒng) 它包括它包括脫氣脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進樣、餾分收集以、梯度淋洗、恒溫、自動進樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀及數(shù)據(jù)處理

13、等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置。中尤為重要的附屬裝置。 （）固定相（）固定相 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為可分為剛性固體剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不為基質(zhì)，可承受高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，就同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，就是是鍵合固定相鍵合固定相，可擴大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使，可擴大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排

14、阻用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。固定色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。固定相按孔隙深度分類，可分為相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型表面多孔型和和全多孔全多孔型固型固定相兩類。定相兩類。 它的基體是它的基體是實心玻璃珠實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。篩、聚酸胺等。表面活性材料為硅膠的固定相如國外表面活性材料為硅膠的固定相如國外的的ZpaxZpax，Corasil ICorasil I和和IIII，Vyd

15、acVydac，PellosilPellosil以及上海以及上海試劑一廠的薄殼玻璃珠等；表面活性材料為氧化鋁的試劑一廠的薄殼玻璃珠等；表面活性材料為氧化鋁的固定相，如固定相，如PelluminaPellumina；為聚酰胺的，如；為聚酰胺的，如PellionPellion。這。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達平衡，較適合做常規(guī)分析。梯度淋洗時能迅速達平衡，較適合做常規(guī)分析。由于由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制多孔層厚度

16、薄，最大允許量受限制。 它由直徑為它由直徑為10nm的的硅膠微粒凝聚硅膠微粒凝聚而成。如國而成。如國外的外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海試劑系列，上海試劑一廠的堆積硅珠，青島海洋化工廠的一廠的堆積硅珠，青島海洋化工廠的YWG系列，天系列，天津試劑二廠的津試劑二廠的DG系列等。也可由氧化鋁微粒凝聚成系列等。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相，如國外的全多孔型固定相，如國外的Lichrosorb ALOXT。這。這類固定相由于類固定相由于顆粒很細顆粒很細（510m），孔仍然較淺，），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)

17、雜混特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。合物分離及痕量分析。 由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與并參與固定相對組分的競爭固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：組分的分離度。對流動相溶劑的要求是： （1 1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性極性和良好的和良好的選擇性選擇性。 （2 2）溶劑要與檢測器匹配溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的意選用檢測器波長比溶

18、劑的紫外截止波長紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻外截止波長指當小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴重干射產(chǎn)生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴重干擾組分的吸收測量。擾組分的吸收測量。 對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達最高靈敏度。溶劑作流動相，以達最高靈敏度。(3)(3)高純度。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生高純度。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰偽峰”。痕量雜質(zhì)將使截止

19、波長值增加。痕量雜質(zhì)將使截止波長值增加50-1OOnm50-1OOnm。(4)(4)化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品反應(yīng)或聚合的溶劑?；瘜W(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品反應(yīng)或聚合的溶劑。(5)(5)低粘度低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等。利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡形成氣泡，影響分離。，影響分離。 （）液（）液-液分配色譜法（液分配色譜法（LLPC）

20、在液在液-液色譜中，流動相和固定相都是液體，液色譜中，流動相和固定相都是液體，它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。的和非離子型的化合物。1. 分離原理分離原理 液液分配色譜的分離原理與液液分配色譜的分離原理與液液萃取液液萃取相同，都是相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同。根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同。液液色譜的分配是在柱中反復(fù)多次進行，提高了液液色譜的分配是在柱中反復(fù)多次進行，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組

21、分。分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。 2. 固定相固定相 由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強極性固定液解決分離問題。例如，最常用的強極性固定液,-氧二氧二丙腈丙腈，中等極性的，中等極性的聚乙二醇聚乙二醇，非極性的，非極性的角鯊?fù)榻酋復(fù)榈取５取?為了解決固定液為了解決固定液流失流失問題。產(chǎn)生了問題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定化學(xué)鍵合固定相相。它是將有機基團通過它是將有機基團通過化學(xué)反應(yīng)化學(xué)反應(yīng)鍵合到鍵合到載體表面載體表面。它

22、。它不是機械涂漬。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。約不是機械涂漬。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。約有有3/4以上是在以上是在化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相上進行的。上進行的。3流動相流動相 在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的要求是盡可能不與固定相互溶，而且相的要求是盡可能不與固定相互溶，而且極性差別越極性差別越顯著越好顯著越好。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為將其分為正正相分配色譜相分配色譜和和反相分配色譜反相分配色譜。 如果采用流動相的極性小于固定相的極性，稱為如果采用流動相的極性小于固定

23、相的極性，稱為正相分配色譜正相分配色譜，它適用于，它適用于極性化合物的分離極性化合物的分離。其流出。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。順序是極性小的先流出，極性大的后流出。 如果采用流動相的極性大于固定相的極性，稱為如果采用流動相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。出順序與正相色譜恰好相反。 采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合液相色譜采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合液相色譜法，簡稱鍵合液相色譜。由于鍵合固定相法，簡稱鍵合液相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定非常穩(wěn)定，在使用中

24、在使用中不易流失不易流失，適用于，適用于梯度淋洗梯度淋洗，特別適用于分，特別適用于分離容量因子離容量因子k k值范圍寬的樣品。值范圍寬的樣品。1鍵合固定相類型鍵合固定相類型 用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠硅膠。利用硅膠表面的硅醇基。利用硅膠表面的硅醇基(Si(Si一一OH)OH)與有機分子可與有機分子可成鍵成鍵, ,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類即可得到各種性能的固定相。一般可分三類（1 1）疏水基團）疏水基團 如不同鏈長的烷烴（如不同鏈長的烷烴（C C8 8和和C C1818）和苯基等。）和苯基等。（2 2）極性基團）極性基團 如氨丙基，氰乙

25、基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3 3）離子交換基團）離子交換基團 如作為陰離子交換基團的胺基，季鍍鹽；如作為陰離子交換基團的胺基，季鍍鹽； 作為陽離子交換基團的磺酸等。作為陽離子交換基團的磺酸等。2鍵合固定相的制備鍵合固定相的制備（l l）硅酸酯（）硅酸酯（SiSi一一OROR）鍵合固定相）鍵合固定相, ,它是最先用于它是最先用于液相色譜的健合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生液相色譜的健合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反酯化反應(yīng)應(yīng)： SiSi0H0HROHSiROHSiORORH H2 20 0由于這類鍵合固定相的有機表面是一些單體，具有良由于這類鍵合固定相的有機表面是一些單體，具有良好的

26、傳質(zhì)特性好的傳質(zhì)特性, ,但這些酯化過的硅膠填料但這些酯化過的硅膠填料易水解易水解且且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動相。受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動相。（2 2）SiSiC C或或SiSi一一N N共價鍵合固定相共價鍵合固定相 制備反應(yīng)如下制備反應(yīng)如下 共價鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅共價鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點是格氏反應(yīng)不方便；當使用水溶液時，酸酯好。缺點是格氏反應(yīng)不方便；當使用水溶液時，必須限制必須限制PH在在48范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。OHSiSOCl2ClSi+HgBrSiSiNHCH2CHNH2H2NCH2CH2NH2（3）硅烷化（）硅烷

27、化（SiOSiC）鍵合固定相）鍵合固定相制備反應(yīng)如下：制備反應(yīng)如下： OHSiClSiR3+SiO(ROSiR3)SiR3+ HCl 這類鍵會固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有這類鍵會固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機溶劑的優(yōu)點。能在機溶劑的優(yōu)點。能在70以下，以下，PH=28范圍內(nèi)正常范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛。工作，應(yīng)用較廣泛。 此法的固定相是采用極性此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相較小的鍵合固定相，如，如硅硅膠膠C18H37、硅膠、硅膠苯基等；流動相是采用極性較強的溶劑，苯基等；流動相是采用極性較強的溶劑，如如甲醇（乙腈）甲醇（乙腈）水水（水和無機鹽的緩沖溶液）等。它多用（水和無

28、機鹽的緩沖溶液）等。它多用于分離于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物多環(huán)芳烴等低極性化合物；若采用含一定比例的甲醇；若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動相，也可用于分離極性化合物；若采或乙腈的水溶液為流動相，也可用于分離極性化合物；若采用水和用水和無機鹽無機鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱品，如有機酸、有機堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無效高，能獲得無拖尾拖尾色譜峰的優(yōu)點。色譜峰的優(yōu)點。 此法是以極性的有機基團，此法是以極性的有機基團，CN、NH2、雙羥基雙羥基等鍵合在等鍵合在硅

29、膠硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇等）為流動相，氯仿、醇等）為流動相，分離極性化合物分離極性化合物。此時，。此時，組分的分配比組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動值隨其極性的增加而增大，但隨流動相極性的增加而降低。相極性的增加而降低。 這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。 當以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子當以

30、薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團，如交換基團，如一一SOSO3 3H H 一一CHCH2 2NHNH2 2、C00HC00H、一一CHCH2 2N N（CHCH3 3）2 2等時，就等時，就形成了形成了離子性鍵合離子性鍵合相色譜的固定相；流動相一般采用緩沖溶液。相色譜的固定相；流動相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。其分離原理與離子交換色譜類同。 鍵合相色譜的最大優(yōu)點是：通過改變流動相的組成和種類，鍵合相色譜的最大優(yōu)點是：通過改變流動相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。此外，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）

31、。此外，由于鍵合到載體上的基團不易流失，特別適用于由于鍵合到載體上的基團不易流失，特別適用于梯度淋洗梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)。據(jù)統(tǒng)計，在高效液相色譜法中，約有計，在高效液相色譜法中，約有8O8O的分離問題是用鍵合相色譜的分離問題是用鍵合相色譜法解決。此法的最大缺點是不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑法解決。此法的最大缺點是不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動相的體系。的緩沖溶液作流動相的體系。 液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些吸附劑通常是些多孔多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物

32、質(zhì)在表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的固定相上的吸附作用吸附作用不同來進行分離的。不同來進行分離的。1分離原理分離原理 當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（X）被）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓钟茫┯谑?，在要取代?shù)目相當?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓钟茫┯谑?，在固定相表面發(fā)生競爭吸附固定相表面發(fā)生競爭吸附: X + nSad = X

33、ad + nS達平衡時達平衡時,有有 nadnadadSXSXK其中其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強，難于洗脫。強，難于洗脫。Kad值小值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。 吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的弱不等的吸附劑吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機械由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機

34、械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多硅膠用得最多。 在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小?？籽\的優(yōu)點，能極大地提高均勻、粒度小?？籽\的優(yōu)點，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是最廣泛使用的還是全多孔全多孔型微粒填料。型微粒填料。 一般把吸附色譜中流動相稱作一般把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑洗脫劑。在吸附色譜

35、中對在吸附色譜中對極性大的試樣極性大的試樣往往采用往往采用極性極性強的洗脫劑強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強弱可用溶劑強度參洗脫劑。洗脫劑的極性強弱可用溶劑強度參數(shù)（數(shù)（0）來衡量。）來衡量。0越大，表示洗脫劑的極越大，表示洗脫劑的極性越強。在硅膠吸附劑中性越強。在硅膠吸附劑中0值的順序相同，值的順序相同，數(shù)值可換算（數(shù)值可換算（0硅膠硅膠=0770氧化鋁）。氧化鋁）。 利用利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)離子交換原理和液相色譜技術(shù)的的結(jié)合來測定溶液中結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子陽離子和陰離子的方法的方法。凡在溶液中凡在溶液中能夠電離能夠

36、電離的物質(zhì)，通常都可用離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行分離。適用無機和有機離子交換色譜法進行分離。適用無機和有機離子混合物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白子混合物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。 1離子交換原理離子交換原理 利用不同待測利用不同待測離子對固定相親和力離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與

37、樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換：的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換：陽離子交換：陽離子交換： 陰離子交換：陰離子交換： RNR3+Cl-+X-RNR3+X-+ Cl-SO3H + M+ SO3M + H+ 對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的K KB/AB/A值按以下值按以下順序：順序：CsCs+ +RbRb+ +K K+ +NHNH4 4+ +NaNa+ +H H+ +LiLi+ +二價離子的順序為：二價離子的順序為： Ba2+Ba2+Pb2+Pb2+Sr2+Sr2+Ca2+Ca2+Cd2+Cd2+Cu2+Cu2+，Zn2+Zn2

38、+Mg2+Mg2+對于季鋁型強堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序為：對于季鋁型強堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序為： ClOClO4 4- -I I- -HS0HS04 4- -SCNSCN- -NONO2 2- -BrBr- -CNCN- -ClCl- -BrOBrO3 3- -OHOH- - HCOHCO3 3- -H H2 2P0P04 4- -IOIO3 3- -CHCH3 3COOCOOF F2 2固定相固定相 作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽樹脂（聚苯乙烯）、

39、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強弱離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強弱之分。之分。 常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種： （l l）多孔型離子交換樹脂）多孔型離子交換樹脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為5 520m20m，有微孔型和大孔型之分。，有微孔型和大孔型之分。（2 2）薄膜型離子交換樹脂）薄膜型離子交換樹脂 是在約對是在約對30m30m的固體的固體惰惰性核上，凝聚性核上，凝聚1 12m2m厚的樹脂層。厚的樹脂層。（

40、3 3）表面多孔型離子交換樹脂）表面多孔型離子交換樹脂 它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂。一層很薄的離子交換樹脂。（4）離子交換鍵合固定相）離子交換鍵合固定相 它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團鍵合到惰性載體表面。它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。 離子交換色譜法所用流動相大都是一定離子交換色譜法所用

41、流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。 一般，對于陰離子交換樹脂來說，各種陰離子的滯留次序為：一般，對于陰離子交換樹脂來說，各種陰離子的滯留次序為：檸檬酸離子檸檬酸離子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN- Cl-HCOO-CH3C00

42、-OH-F-所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。陽離子的滯留次序大為：所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。陽離子的滯留次序大為： Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十十 但差別不如陰離子明顯。關(guān)于但差別不如陰離子明顯。關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的變流動相的pH值來控制。增大值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低堿的電

43、離度減少；降低PH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。 尺寸排阻色譜法又稱尺寸排阻色譜法又稱凝膠凝膠色譜法，主要用于較色譜法，主要用于較大分子的分離。它是基于試樣分子的大分子的分離。它是基于試樣分子的尺寸和形狀尺寸和形狀不不同來實現(xiàn)分離的。同來實現(xiàn)分離的。 尺寸排阻色譜被廣泛用來分析大分子物質(zhì)相對尺寸排阻色譜被廣泛用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。特點：（分子質(zhì)量的分布。特點：（1 1）保留時間是分子尺）保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。寸的函數(shù)，有可能提供

44、分子結(jié)構(gòu)的某些信息。(2)(2)保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器（的檢測器（3 3）固定相與分子間作用力極弱，趨于）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強保留分子，因此柱壽命長。零。由于柱子不能很強保留分子，因此柱壽命長。（4 4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差別必須大于質(zhì)量差別必須大于1010才能得以分離。才能得以分離。1分離原理分離原理 尺寸排阻色譜是按分子大小順序進尺寸排阻色譜是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法。其行分離的一種色譜方法。其固定相固定相為化為

45、化學(xué)情性多孔物質(zhì)學(xué)情性多孔物質(zhì)凝膠凝膠，孔徑比分子，孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。2固定相固定相 排阻色譜固定相可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。排阻色譜固定相可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。 凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。 （1）軟性凝膠）軟性凝膠 如葡聚糖