生物化學講義第六章核酸

1、第六章 核 酸核酸是遺傳物質(zhì)1868年瑞士miesher.從膿細胞的細胞核中分離出可溶于堿而不溶于稀酸的酸性物質(zhì)。間接證據(jù)：同一種生物的不同種類的不同生長期的細胞，dna含量基本恒定。直接證據(jù)：t2噬菌體dna感染e.coli用35s標記噬菌體蛋白質(zhì)，感染e.coli，又用32p標記噬菌體核酸，感染e.colidna、rna的分布（dna在核內(nèi)，rna在核外）。第一節(jié) 核酸的化學組成核酸是一種線形多聚核苷酸，基本組成單位是核苷酸。結(jié)構(gòu)層次： 核 酸 核苷酸 磷酸 核苷 戊糖 堿基組成核酸的戊糖有兩種：d-核糖和d-2-脫氧核糖，據(jù)此，可以將核酸分為兩種：核糖核酸（rna）和脫氧核糖核酸（dna

2、） p330 表5-1 兩類核酸的基本化學組成一、 堿基1. 嘌呤堿： 腺嘌呤 鳥嘌呤2. 嘧啶堿： 胞嘧啶 尿嘧啶 胸腺嘧啶p331 結(jié)構(gòu)式 3. 修飾堿基植物中有大量5-甲基胞嘧啶。e.coli噬菌體中，5-羥甲基胞嘧啶代替c。稀有堿基：100余種，多數(shù)是甲基化的產(chǎn)物。dna由a、g、c、t堿基構(gòu)成。rna由a、g、c、u堿基構(gòu)成。二、 核苷核苷由戊糖和堿基縮合而成，糖環(huán)上c1與嘧啶堿的n1或與嘌呤堿的n9連接。核酸中的核苷均為-型核苷 p332 結(jié)構(gòu)式 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脫氧核苷dna 的戊糖是：脫氧核糖rna 的戊糖是：核糖三、 核苷酸核苷中戊糖c3、c5羥基被磷酸酯化，生成核苷酸。1

3、、 構(gòu)成dna、rna的核苷酸p333表5-32、 細胞內(nèi)游離核苷酸及其衍生物核苷5-多磷酸化合物atp、gtp、ctp、ppppa、ppppg在能量代謝和物質(zhì)代謝及調(diào)控中起重要作用。環(huán)核苷酸camp（3，5-camp） cgmp（3，5-cgmp）它們作為質(zhì)膜的激素的第二信使起作用，camp調(diào)節(jié)細胞的糖代謝、脂代謝。核苷5多磷酸3多磷酸化合物ppgpp pppgpp ppapp核苷酸衍生物hscoa、 nad+、nadp+、fad等輔助因子。gdp-半乳糖、gdp-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供體。第二節(jié) dna的結(jié)構(gòu)一級：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列順序。二級：dna的兩條多聚核苷

4、酸鏈間通過氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。三級：dna雙鏈進一步折疊卷曲形成的構(gòu)象。一、 dna的一級結(jié)構(gòu)dna的一級結(jié)構(gòu)是4種脫氧核苷酸（damp、dgmp、dcmp、dtmp）通過3/、5/-磷酸二酯鍵連接起來的線形多聚體。3/、5/-磷酸二酯鍵是dna、rna的主鏈結(jié)構(gòu) 。 p334 圖 5-1書寫方法：5/ 3/：5-papcptpg-3，或5actg3（在dna中，3/-oh一般是游離的）在dna分子中，不變的骨架成分磷酸二酯鍵被逐漸省略，真正代表dna生物學意義的是堿基的排列順序。遺傳信息貯存在dna的堿基排列順序中，生物界生物的多樣性即寓于dna分子4種核苷酸千變?nèi)f化的精確的排列順序中。二

5、、 dna的二級結(jié)構(gòu)1953年，watson和crick根據(jù)chargaff 規(guī)律和dna na鹽纖維的x光衍射數(shù)據(jù)提出了dna的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。1、 watson-crick雙螺旋結(jié)構(gòu)建立的根據(jù)chargaff 規(guī)律 1950年a. 所有dna中，a=t，g=c 且a+g=c+t。p334表54。b. dna的堿基組成具有種的特異性，即不同生物的dna皆有自己獨特的堿基組成。c. dna堿基組成沒有組織和器官的特異性。d. 年齡、營養(yǎng)狀況、環(huán)境等因素不影響dna的堿基組成。 dna的na鹽纖維和dna晶體的x光衍射分析。相對濕度92%，dna鈉鹽結(jié)晶，bdna。相對濕度75%，dna鈉鹽結(jié)晶

6、，adna。 zdna。生物體內(nèi)dna均為bdna。franklin 的工作2、 watson-crick雙螺旋結(jié)構(gòu)模型p335 圖52a.兩條反平行的多核苷酸鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條53，另一條35b.嘌呤與嘧啶堿位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸與脫氧核糖在外側(cè)。磷酸與脫氧核糖彼此通過3/、5/-磷酸二酯鍵相連接，構(gòu)成dna分子的骨架。 寬1.2 nm 寬0.6nm 大溝 小溝 深0.85nm 深0.75nmc.螺旋平均直徑2nm 每圈螺旋含10個核苷酸堿基堆積距離：0.34nm螺距：3.4nmd.兩條核苷酸鏈，依靠彼此堿基間形成的氫鏈結(jié)合在一起。堿基平面垂直于螺旋軸。a=t、g=

7、c p336 圖54堿基互補原則具有極重要的生物學意義，dna的復制、轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄等的分子基礎(chǔ)都是堿基互補。3、 穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素堿基堆積力（主要因素） 形成疏水環(huán)境。堿基配對的氫鍵。gc含量越多，越穩(wěn)定。磷酸基上的負電荷與介質(zhì)中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負電荷間的斥力，有助于dna穩(wěn)定。堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。三、 dna二級結(jié)構(gòu)的不均一性和多型性（一） dna二級結(jié)構(gòu)的不均一性1、 反向重復序列（回文序列）dna序列中，以某一中心區(qū)域為對稱軸，其兩側(cè)的堿基對順序正讀和反讀都相同，即對稱軸一側(cè)的片段旋轉(zhuǎn)180°

8、后，與另一側(cè)片段對稱重復。較長的回文結(jié)構(gòu)，在某些因素作用下，可形成莖環(huán)式的十字結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。功能還不完全清楚，但轉(zhuǎn)錄的終止作用與回文結(jié)構(gòu)有關(guān)。較短的回文序列，可作為一種特別信號，如限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點。2、 富含a t的序列高等生物中，a+t與c+g的含量差不多相等，但在它們的染色體的某一區(qū)域，a t含量可能很高。在很多有重要調(diào)節(jié)功能（不是蛋白質(zhì)編碼區(qū)）的dna區(qū)段都富含a t堿基對。特別是在復制起點和啟動的pribnow框的dna區(qū)中，富含a t對。這對于復制和轉(zhuǎn)錄的起始十分重要，因為g c對有三個氫鍵，而a t對只有兩個氫鍵，此處雙鍵易解開。（二） dna二級結(jié)構(gòu)的多型性p339

9、表5-6 a-、b-、z-dna的比較1、 bdna：典型的watson-crick雙螺旋dna右手雙股螺旋每圈螺旋10.4個堿基對每對螺旋扭角36°螺距：3.32nm堿基傾角：1°2、 a-dna在相對濕度75%以下所獲得的dna纖維。a-dna也是右手雙螺旋，外形粗短。rna-rna、rna-dna雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)。3、 z-dna左手螺旋的dna。天然b-dna的局部區(qū)域可以形成z0-dna。4、 dna三股螺旋在多聚嘧啶和多聚嘌呤組成的dna螺旋區(qū)段，序列中有較長的鏡像重復時，可形成局部三股螺旋，稱h-dna。鏡像重復：tat配對c+gc酸對dna的三鏈結(jié)構(gòu)常出

10、現(xiàn)在dna復制、重組、轉(zhuǎn)錄的起始或調(diào)節(jié)位點，第三股鏈的存在可能使一些調(diào)控蛋白或rna聚合酶等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏有關(guān)遺傳信息的表達。四、 環(huán)狀dna生物體內(nèi)有些dna是以雙鏈環(huán)狀dna的形式存在，包括：某些病毒dna某些噬菌體dna某些細菌染色體dna細菌質(zhì)粒dna真核細胞中的線粒體dna、葉綠體dna1、 環(huán)形dna的不同構(gòu)象p340 圖5-8 松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負超螺旋（1）、 松弛環(huán)形dna線形dna直接環(huán)化（2）、 解鏈環(huán)形dna線形dna擰松后再環(huán)化（3）、 正超螺旋與負超螺旋dna線形dna擰緊或擰松后再環(huán)化，成為超螺旋結(jié)構(gòu)。繩子的兩股以右旋方向纏繞，如果在一端使繩子向纏緊的方

11、向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來，會產(chǎn)生一個左旋的超螺旋，以解除外加的旋轉(zhuǎn)造成的脅變，這樣的超螺旋叫正超螺旋。如果在繩子一端向松纏方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來，會產(chǎn)生一個右旋的超螺旋，以解除外加的旋轉(zhuǎn)所造成的脅變，這樣的超螺旋稱負超螺旋。對于右手螺旋的dna分子，如果每圈初級螺旋的堿基對數(shù)小于10.4，則其二級結(jié)構(gòu)處于緊纏狀態(tài)，是正超螺旋。如果每圈初級螺旋的堿基對數(shù)大于10.4，則其二級結(jié)構(gòu)處于松纏狀態(tài)，是負超螺旋。2、 環(huán)形dna的拓撲學特性以260bp組成的線形b-dna為例，螺旋周數(shù)260/10.4=25。p340 圖25-8 松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負超螺旋連環(huán)數(shù)（l）dna雙螺旋中，一條鏈以右

12、手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)，以l表示。松馳環(huán)：l=25解鏈環(huán)：l=23超螺旋：l=23纏繞數(shù)（t）dna分子中的watson-crick螺旋數(shù)目，以t表示松馳環(huán)t=25解鏈環(huán)t=23超螺旋t=25超螺旋周數(shù)（扭曲數(shù)w）松馳環(huán)w=0解鏈環(huán)w=0超螺旋w= -2l=t+w比連環(huán)差（）表示dna的超螺旋程度=（ll0）/l0l0是指松馳環(huán)形dna的l值天然dna的超螺旋密度一般為-0.03-0.09，平均每100bp上有3-9個負超螺旋。負超螺旋dna是由于兩條鏈的纏繞不足引起，很易解鏈，易于參加dna的復制、重組和轉(zhuǎn)錄等需要將兩條鏈分開才能進行的反應。3、 拓撲異構(gòu)酶此酶能改變dna拓撲異構(gòu)體的l

13、值。拓撲異構(gòu)酶酶i（擰緊）能使雙鏈負超螺旋dna轉(zhuǎn)變成松馳形環(huán)狀dna，每一次作用可使l值增加1，同時，使松馳環(huán)狀dna轉(zhuǎn)變成正超螺旋。拓撲異構(gòu)酶酶ii（擰松）能使松馳環(huán)狀dna轉(zhuǎn)變成負超螺旋形dna，每次催化使l減少2，同時能使正超螺旋轉(zhuǎn)變成松馳dna。五、 染色體的結(jié)構(gòu)1、 大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體是由4.2×106bp組成的雙鏈環(huán)狀dna分子，約3000個基因。大腸桿菌dna結(jié)合蛋白： 每個細胞h 兩個28kd的相同亞基 30000個二聚體hu 兩個各9kd的不同亞基 40000個二體聚體hlp1 17kd的亞基 20000個單體p 3kd的亞基 未知這些dna結(jié)合蛋白，使

14、4.2×106bp的e.coli染色體dna壓縮成為一個手腳架形結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中心是多種dna結(jié)合蛋白，dna雙螺旋分子有許多位點與這些蛋白結(jié)合，形成約100個小區(qū)，每個小區(qū)的dna都是負超螺旋，一個小區(qū)的dna有兩個端點被蛋白質(zhì)固定，每個小區(qū)相對獨立。 圖用極微量的dna酶i處理時，只能使少量小區(qū)的dna成為松馳狀態(tài)，而其它小區(qū)仍然保持超螺旋狀態(tài)。2、 真核生物染色體主要由組蛋白和dna組成。組蛋白是富含堿性a.a(lys、arg)的堿性蛋白質(zhì)，根據(jù)lys/arg比值不同，可分為h1、h2a、h2b、h3、h4五種，均為單鏈蛋白質(zhì)，分子量11000-21000。h2a、h2b、h3、h

15、4各兩分子對稱聚集成組蛋白八聚體。146bp長度的dna雙螺旋盤繞在八聚體上形成核小體。核小體間dna長度15-100bp（一般60bp）其上結(jié)合有h1 圖2h2a、2h2b、2h3、2h4組蛋白八聚體 146bpdna 核小體 串聯(lián) 染色質(zhì) 折疊 染色體dna（直徑2nm） 盤繞組蛋白八聚體上，結(jié)合h1，壓縮比1/7 核小體（一級結(jié)構(gòu)） 螺旋化，壓縮比1/6螺線管（二級結(jié)構(gòu)） 再螺旋化，壓縮比1/40超螺線管（三級結(jié)構(gòu)） 折疊，壓縮比1/5染色單體（四級結(jié)構(gòu)） 總壓縮比：1/84001/10000六、 dna的生物學功能首次直接證明dna的遺傳功能的是avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗。 p34

16、2 14 avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗第三節(jié) rna的結(jié)構(gòu)一、 rna的一級結(jié)構(gòu)rna是amp、gmp、cmp、ump通過3/、5/磷酸二酯鍵形成的線形多聚體。p343 圖5-10 rna基本結(jié)構(gòu) 組成rna的戊糖是核糖 堿基中rna的u替代dna中的t，此外，rna中還有一些稀有堿基。 天然rna分子都是單鏈線形分子，只有部分區(qū)域是a-型雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙螺旋區(qū)一般占rna分子的50%左右。二、 rna的類型細胞中的rna，按其在蛋白質(zhì)合成中所起的作用，主要可分為三種類型。核糖體rna rrna 轉(zhuǎn)運 rna trna信使 rna mrna 此外，真核生物細胞中有少量核內(nèi)小rna（small

17、nuclear rna snrna）p344 表5-7 大腸桿菌中的rna沉降系數(shù)：單位離心場中的沉降速度，以s為單位，即10-13秒。如23s rrna ，單位離心場中沉降 23×10-13秒 5s rrna ，單位離心場中沉降 5×10-13秒三、 trna的結(jié)構(gòu) trna約占全部rna的15%主要功能：在蛋白質(zhì)生物合成過程中轉(zhuǎn)運氨基酸。已知一級結(jié)構(gòu)的trna有160種，每種trna可運載一種特定的a.a，一種a.a可由一種或多種trna運載。結(jié)構(gòu)特點分子量在25kd左右，70-90b，沉降系數(shù)4s左右堿基組成中有較多稀有堿基 圖3末端為cpcpa-oh，用來接受活化的

18、氨基酸，此末端稱接受末端。5末端大多為pg或pc二級結(jié)構(gòu)是三葉草形p345 圖5-12 trna的二級結(jié)構(gòu)（三葉草模型）1966年crick對于trna能識別幾種密碼子的現(xiàn)象，提出堿基配對的“擺動學說”：認為除a-u、g-c配對外，還有非標準配對，i-a、i-c、i-u，并強調(diào)密碼子的5端第1、2個堿基嚴格遵循標準配對，而第3個堿基可以非標準配對，具有一定程度的擺動靈活性。四、 mrna的結(jié)構(gòu)mrna是從dna上轉(zhuǎn)錄而來的，其功能是依據(jù)dna的遺傳信息，指導各種蛋白質(zhì)的生物合成，每一種蛋白質(zhì)都由一種相應的mrna編碼，細胞內(nèi) mrna種類很多，大小不一，每種含量極低。從功能上講，一個

19、基因就是一個順反子，原核生物的mrna是多順反子，真核mrna是單順反子。順反子：是由順反試驗所規(guī)定的遺傳單位，相當于一種蛋白質(zhì)的基因。1、 真核mrna（1）、 3-端有一段約30-300核苷酸的polya。 polya是轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)polya聚合酶添加上，polya聚合酶對mrna專一。原核mrna一般無polya。polya與mrna半壽期有關(guān)，新合成的mrna，其polya較長；而衰老的mrna，其polya較短。polya功能：polya是mrna由核進入胞質(zhì)所必需的形式。polya大大提高mrna在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。（2）、 5-帽子帽子5末端的鳥嘌呤n7被甲基化，鳥嘌呤核苷酸經(jīng)焦磷酸

20、與相鄰的一個核苷酸相連，形成5-5-磷酸二酯鍵。p346 帽子結(jié)構(gòu)帽子的功能：可抵抗5核酸外切酶降解mrna?？蔀楹颂求w提供識別位點，使mrna很快與核糖體結(jié)合，促進蛋白質(zhì)合成起始復合物的形成。2、 原核mrna（多順反子）原核mrna由先導區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成。沒有5/帽子和3/polya。舉列：ms2病毒mrna，3569 b，有三個順反子，分別編碼a蛋白、外殼蛋白和復制酶三種蛋白質(zhì)。 圖ms2病mrna5端先導區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5-aggaggu-3，位于起始密碼子aug前約10核苷酸處，此序列由shine和dalgarno發(fā)現(xiàn)，稱sd序列。sd序列和

21、核糖體16s的rrna的3末端富含嘧啶堿基的序列互補，這種互補序列與mrna對核糖體的識別有關(guān)。原核mrna代謝很快，半壽期幾秒至十幾分鐘。五、 rrna的結(jié)構(gòu)rrna占總rna的80%左右。功能：rrna是構(gòu)成核糖體的骨架，與核糖體結(jié)合蛋白一起構(gòu)成核糖體，為蛋白質(zhì)的合成提供場所。大腸桿菌中有三類rrna（原核）5s rrna16s rrna23s rrna真核細胞有四類rrna5s rrna5.8s rrna18s rrna28s rrna 圖 原核核糖體（rrna 部分） 圖 真核核糖體（rrna部分）p346 圖5-14 大腸桿菌 5s rrna 結(jié)構(gòu)第四節(jié) 核酸的性質(zhì)一、 解

22、離性質(zhì)多聚核苷酸有兩類可解離的基團：磷酸和堿基能發(fā)生兩性解離。磷酸是中等強度的酸，堿基的堿性較弱，因此，核酸等電點在較低的ph范圍內(nèi)。dna等電點 44.5rna 等電點 22.5rna鏈中，核糖c2-oh的氫能與磷酸酯中的羥基氧形成氫鏈，促進磷酸酯羥基氫原子的解離。二、 水解性質(zhì)1、 堿水解室溫，0.1mol/lnaoh可將rna完全水解，得到2-或3-磷酸核苷的混合物。 圖在相同條件下，dna不被水解。這是因為rna中c2-oh的存在，促進了磷酸酯鍵的水解。dna、rna水解難易程度的不同具有極為重要的生理意義。dna穩(wěn)定 ，遺傳信息。rna是dna的信使，完成任務后降解。2、 酶水解生物

23、體內(nèi)存在多種核酸水解酶rna水解酶 rnasedna水解酶 dnase核酸外一切酶核酸內(nèi)切酶 最重要的：限制性核酸內(nèi)切酶三、 光吸收性堿基具有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有強烈的光吸收，max=260nm1、 鑒定純度純dna的a260/a280應為1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了rna。純rna的a260/a280應為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則a260/a280比值明顯降低。2、 含量計算1 abs值相當于：50ug/ml雙螺旋dna 或：40ug/ml單螺旋dna（或rna） 或：20ug/ml核苷酸3、 增色效應與減色效

24、應p347 圖5-15 dna的紫外吸收光譜增色效應：在dna的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大減色效應：在dna的復性過程中，摩爾吸光系數(shù)減小。四、 沉降特性（dna）不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用cs-cl密度梯度離心就可以將它們區(qū)分開來，這一方法常用于質(zhì)粒dna的純化。 p348 圖516 cs-cl密度梯度離心純化質(zhì)粒dna相對沉降常數(shù)線型雙螺旋分子 1.00松馳雙鏈閉環(huán) 1.14切刻雙鏈環(huán) 1.14單鏈環(huán) 1.14線型單鏈 1.30正超或負超螺旋雙鏈環(huán)狀 1.41坍縮 3.0五、 變性、復性及雜交變性、復性是核酸的重要的物化性質(zhì)，相對蛋白質(zhì)來說，核酸可以耐

25、受反反復復的變性、復性。這也是核酸研究技術(shù)的基礎(chǔ)。1、 變性（1）、 變性：核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價鍵斷裂。多核苷酸骨架上共價鍵的斷裂稱核酸的降解。dna的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)。p350 圖5-18變性過程 熱變性 因素 酸堿變性（ph小于4或大于11，堿基間氫鍵全部斷裂） 變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛） 260nm吸收值升高。 變性后 粘度降低，浮力密度升高。 二級結(jié)構(gòu)改變，部分失活。 （2）、 熔解溫度（tm）或稱熔點：dna的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時對應的溫度。dna的tm一般在7085之間。濃度50ug/ml時，雙鏈dna a260=1.00

26、，完全變性（單鏈）a260= 1.37當a260增加到最大增大值一半時，即1.185時，對應的溫度即為tm。（3）、 影響dna的tm值的因素dna均一性 均一性高，熔解過程發(fā)生在很小的溫度范圍 內(nèi)。g-c含量與tm值成正比，g-c含量高，則tm越高，測定tm，可推知g-c含量。g-c%=（tm-69.3）×2.44p351圖5-19 圖5-20 tm值與gc含量的關(guān)系介質(zhì)中離子強度其它條件不變，離子強度高，tm高。p351 圖5-212、 復性變性dna在適當（一般低于tm2025）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。變性dna在緩慢冷卻時（快速冷卻可防止復性），可以復性。dna片

27、段越大，復性越慢；dna濃度越大，復性越快。復性速度可用co·t衡量。co為變性dna原始濃度mol·l-1，t為時間，以秒表示。 p352 圖5-22，不同dna的復性時間。a1個核苷酸對（a.u）圖上查出cot1/2=4×10-6mol.s/l若濃度為co=1.0m mol/l則復性50%所需時間t=0.004秒若要全部復性，cot=10-4 t=0.1秒be.coli 4.2×106堿基對圖上查出cot1/2=10 mol.s/l若濃度co=1.0 umol/l則復性50%所需時間t=107秒，約115天。復性100%cot=500 mol.s/l

28、t=5×108秒，5758天。對于e.coli ，4.2×106bp，濃度達到umol/l級時，濃度已很高。 復性機制：10-20bp成、拉鏈3、 雜交（dnadna、 dnarna）將不同來源的dna混合加熱，變性后，慢慢冷卻使它復性。若這些異源dna之間，在某些區(qū)域有相同的序列，則復性時會形成雜交分子。第五節(jié) 核酸研究技術(shù)一、 核酸的分離純化要求：盡可能保持其天然狀態(tài)。 條件溫和，防止過酸、過堿。 避免劇烈攪拌，抑制核酸酶。1、 dna分離純化真核dna以核蛋白（dnp）形式存在，dnp溶于水或鹽（1mol/l），但不溶于0.14mol/l nacl中，利用此性質(zhì)，可將

29、dnp與rna核蛋白分開，提取出dnp。dna核蛋白可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。2、 rna的制備（重點介紹mrna的分離、純化）用0.14mol/l nacl使dnp沉淀，上清中即為rna核蛋白（rnp）。去蛋白：鹽酸胍、苯酚等必須防止rna酶對rna的破壞。二、 核酸的凝膠電泳1、 瓊脂糖電泳 核酸分子的大小，遷移率與分子量的對數(shù)成反比 凝膠濃度 dna的構(gòu)象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。 電流，不大于5v/cm2、 page電泳三、 限制性核酸內(nèi)切酶（1979年發(fā)現(xiàn)）1、 限制修飾系統(tǒng) 圖2、 ii型核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶有i、ii、iii三種類型，其中

30、ii型酶在dna克隆中十分有用。ii型酶的特點：限制和修飾活性分開，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是單一成分，輔助因子mg2+，位點序列旋轉(zhuǎn)對稱（反向重復）。ii型酶的切割頻率識別位點 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536not i gcggccgc限制酶的命名：e.cori第一位： 屬名e（大寫）第二、三位： 種名的頭兩個字母小寫co第四位： 菌株r第五位： 羅馬字，從該細菌中分離出來的這一類酶的編號。同裂酶：來源不同的限制酶（名稱自然不同），識別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。bamh： ggatcc 同裂酶 bsti識別位點相同，切割位點相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。同

31、尾酶：來源各異，識別的靶序列不同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端。bamhi：ggatcc同裂酶：bsti ggatcc同尾酶：bcli tgatca bglii agatct mboi gatc sau3a gatc星號活力：在一定條件下（低離子強度，堿性ph，或50%甘油），限制酶的特異性降低。結(jié)果，它的識別與切割所需的典型的核苷酸序列的數(shù)量和種類會發(fā)生變化。例如 hindiii aagctt四、 dna物理圖譜及構(gòu)建（限制酶切圖譜、dna酶切位點圖譜）在研究某一種dna時，弄清該dna分子有哪些限制酶切位點是很重要的。建立物理圖譜是進一步分析此dna的基礎(chǔ)，末端標記法構(gòu)建dna物理圖譜：（1）單酶完全降解和部分降解（2）雙酶降解 圖五、 分子雜交1、 southern blottingp353 圖5-23dna樣品 酶切 電泳 變性 轉(zhuǎn)膜 固定 雜交 洗滌 放射自顯影變性（naoh 0.5mol/l）轉(zhuǎn)膜（nc膜）固定（80，4-6h）雜交（高鹽濃度，68，幾小時）southern blotting可用于dna之間同源性分析，確定特異性dna序列的大小和定位?？捎胐na或rna探針。2、 northern blotting研究對象是mrna檢測可與探針dna同源雜交的mrna分子的存