JA與ET之間的關(guān)系

1、Interaction between MYC2 and ETHYLENE INSENSITIVE3 Modulates Antagonism between Jasmonate and Ethylene Signaling in Arabidopsis賈明珠賈明珠background茉莉酸(jasmonic acid, JA)存在于高等植物體內(nèi)的內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。茉莉酸類(JAs)與抵抗病原侵染有關(guān).都是植物對(duì)外界傷害(機(jī)械、食草動(dòng)物、昆蟲傷害)和病原菌侵染做出反應(yīng),而誘導(dǎo)抗性基因表達(dá)的信號(hào)分子，JAs介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑與植物抗性密切相關(guān)。乙烯能促進(jìn)土中生長的幼苗會(huì)形成頂端彎鉤(apical

2、 hook),保護(hù)子葉和頂端分生組織在出土?xí)r免受機(jī)械損傷,對(duì)頂端彎鉤形成機(jī)制的研究有助于提高植物成功出土的概率,保證幼苗正常生長,進(jìn)而提高作物產(chǎn)量。 2012年的工作揭示了赤霉素與乙烯協(xié)同調(diào)控頂端彎鉤的形成機(jī)制( An et al., 2012. Cell Research ) ,發(fā)現(xiàn)了HLS1是乙烯信號(hào)通路核心轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL1的直接靶基因，為解釋多種激素調(diào)節(jié)頂端彎鉤形成的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 本項(xiàng)工作揭示了另一種植物激素茉莉素拮抗乙烯在頂端彎鉤形成中的作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)因此高劑量的茉莉素處理最終導(dǎo)致植物幼苗中EIN3/EIL1功能顯著下降，從而使得HLS1基因無法表達(dá)，表達(dá)為頂端彎鉤的缺失

3、。 同時(shí)本文還著重研究了茉莉酸與乙烯在調(diào)節(jié)植物抗病性應(yīng)答基因、食草性應(yīng)答基因、防御昆蟲等方面之間的相互作用。CTR1 EIN2 EIN3 乙烯應(yīng)答反應(yīng)乙烯應(yīng)答反應(yīng) 下胚軸生長下胚軸生長 頂鉤彎曲形成頂鉤彎曲形成 根的生長根的生長 開花開花 果實(shí)成熟果實(shí)成熟 葉片衰老葉片衰老 耐寒性耐寒性 抵抗病原菌感染抵抗病原菌感染乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中基因作用順序乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中基因作用順序植物未受到茉莉酸激素刺激時(shí)植物未受到茉莉酸激素刺激時(shí), ,JAZ蛋白和蛋白和MYC2蛋白結(jié)合在一起蛋白結(jié)合在一起, ,抑制抑制MYC2的表達(dá)；的表達(dá)；植物受到茉莉酸類激素刺激時(shí)植物受到茉莉酸類激素刺激時(shí), ,茉莉酸類激素做

4、為信號(hào)分子激活茉莉酸類激素做為信號(hào)分子激活SCFCOI1蛋白復(fù)合蛋白復(fù)合體體,JAZ,JAZ蛋白與蛋白與S SCFCOI1 蛋白復(fù)合體結(jié)合從而使得蛋白復(fù)合體結(jié)合從而使得MYC2蛋白被釋放蛋白被釋放, ,游離的游離的MYC2蛋蛋白能與茉莉酸類響應(yīng)基因白能與茉莉酸類響應(yīng)基因DNA結(jié)合結(jié)合, ,從而調(diào)控相應(yīng)的生理過程從而調(diào)控相應(yīng)的生理過程, ,完成茉莉酸激素刺激響完成茉莉酸激素刺激響應(yīng)應(yīng); ;同時(shí)同時(shí)JAZ蛋白則被蛋白則被26S蛋白酶體識(shí)別而降解。蛋白酶體識(shí)別而降解。 JA and ET signaling synergy in the regulation of root hair develop

5、ment and resistance against necrotrophic fungal infection.JA represses apical hook formation and positively regulates plant defense against insect attack, while ET functions oppositely.The molecular mechanism for such antagonism between JA and ET signaling remains unclear ？轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL1EIN3/EIL1

6、是乙烯與茉莉素的信號(hào)交叉節(jié)點(diǎn)是乙烯與茉莉素的信號(hào)交叉節(jié)點(diǎn), , EIN3/EIL1被茉莉素信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)控因子被茉莉素信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)控因子J JAZ蛋白家族直接抑制蛋白家族直接抑制Results 1 MYC2, MYC3, and MYC4 Function Redundantly to Mediate JA-Inhibited Apical Hook Curvature人們常使用 “三重反應(yīng)”(triple response)作為判斷乙烯反應(yīng)強(qiáng)弱程度的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn):外源乙烯引起黑暗中生的黃化苗出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化, 包括根和下胚軸伸長受制、下胚軸橫向生長加粗、頂端子葉彎曲生長加劇 ethy

7、lene overproducer1 eto1-1 乙烯過量生成突變體 constitutive ET responses (ctr1-1)乙烯信號(hào)組成型活化突變體 deficient in ET signaling (ein2-1 and ein3-1 eil1-3)施加外源乙烯時(shí)，乙烯不敏感突變體 coi1-1 mutant 失去對(duì)JA的調(diào)控能力的突變體 JA represses HLS1 expression to inhibit ET-enhanced hook formation and imply that JA acts upstream of HLS1 to repress h

8、ook curvature. To genetically verify whether JA acts upstream of HLS1 ? The key components responsible for repression of hook curvature in JA signaling pathway ?JA和ET信號(hào)途徑在頂端彎鉤的形成上的拮抗作用茉莉素激活其通路中重要轉(zhuǎn)錄因子MYC2，而激活后的MYC2通過2種機(jī)制來抑制EIN3/EIL1的功能：一是誘導(dǎo)一個(gè)F-box蛋白（EBF1）的基因表達(dá)，從而加速EIN3/EIL1的泛素化降解；二是直接與EIN3/EIL1蛋白互作，抑

9、制其轉(zhuǎn)錄活性。Resule 2: MYC2 , MYC3, and MYC4 Interact with EIN3 and EIL1實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法1 1：雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecular fluorescence complementation，BiFC) 該方法利用黃色熒光蛋白(YFP)及其突變體的特性作為報(bào)告基因，將熒光蛋白分割成兩個(gè)不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標(biāo)蛋白連接。如果兩個(gè)目標(biāo)蛋白因?yàn)橛邢嗷プ饔枚拷褪沟脽晒獾鞍椎膬蓚€(gè)分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團(tuán)而發(fā)出熒光.在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標(biāo)蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活細(xì)胞生理狀態(tài)的

10、條件下觀察到其相互作用發(fā)生的時(shí)間、位置、強(qiáng)弱、所形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的穩(wěn)定性，以及細(xì)胞信號(hào)分子對(duì)其相互作用的影響等，這些信息對(duì)研究蛋白質(zhì)相互作用有一定意義。 MYC2, MYC3, and MYC4 interact with EIN3 and EIL1實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法2 2Pull-Down技術(shù)是通過蛋白相互作用來研究細(xì)胞通路的有力工具.Pull-Down實(shí)驗(yàn)是確定兩種或更多蛋白之間相互作用的體外方法.可用來檢測已知蛋白的表達(dá)和相互作用條件，并且可用來篩選未知的蛋白相互作用.至少需要一種純化的標(biāo)簽蛋白（誘餌）用來捕獲和“pull-down”靶蛋白（獵物)。MYC2 interacts with

11、EIN3實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法3 3 免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。目前多用精制的proreinA預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的proreinA就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)

12、是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。Flag-EIN3 was indeed coimmunoprecipitated with myc-MYC2 ,but not with the control protein myc-COI1Resule 3: MYC2 Inhibits Transcriptional Activity of EIN3 and EIL1 EIN3 could bind to the promoter of HLS1 to activate its expression, leading to hook curvaturewhether MYC2 a

13、ffects the influence of EIN3 on HLS1 transcription whether MYC2 could repress the effects of EIN3 and EIL1 on the transcription of another target geneResults 4 Disruption of EIN3 and EIL1 Suppresses Exaggerated Apical Hook Formation and Resistance against a NecrotrophicPathogen in myc2MYC2, MYC3, an

14、d MYC4 interact with and attenuate EIN3 and EIL1 to repress hook curvatureMYC2 interacts with and attenuates EIN3 and EIL1 torepress resistance against the necrotrophic pathogen B. cinerea.Results 5 EIN3 and EIL1 Attenuate the Transcriptional Activation Function of MYC2 to Repress Plant Defense agai

15、nstInsect AttackEIN3 and EIL1 attenuate the transcriptional activation function of MYC2DISCUSSION1.Molecular, biochemical, and genetic evidence suggest an antagonistic regulatory model in which interaction between MYC2 and EIN3 and EIL1, modulates the JA-ET signaling antagonism .2.Future research sh

16、ould focus on identifying protein domains essential for the interaction between MYC2 and EIN3 and clarifying whether reciprocal repression between MYC2 and EIN3 occurs on promoters of its target genes or disrupts the binding of MYC2 or EIN3 to its respective target promoters3.JA and ET exhibit oppos

17、ite effects on many other plant responses. 補(bǔ)充補(bǔ)充 瞬時(shí)表達(dá)瞬時(shí)表達(dá)：外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，為整合進(jìn)入受體細(xì)胞基因組而立即轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)基因產(chǎn)物，快速研究基因表達(dá)、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位、基因間互作。LUC基因基因：熒光酶基因，該酶在有ATP、Mg離子、氧氣和熒光素存在下發(fā)出熒光。SDS-PAGE and Immunoblot analysis (Western Blot) Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以

18、非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。免疫印跡法 (Western blotting) 是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù).具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),是檢測蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法.免疫印跡法分三個(gè)階段進(jìn)行.一為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE):抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向原理陽極泳動(dòng),分子量越小,泳動(dòng)速度就越快.此階段分離效果肉眼不可見(只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶).二為電轉(zhuǎn)移：將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（12A),通電45min轉(zhuǎn)移即可完成.此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見.三為酶免疫定位:將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物,使區(qū)帶染色.常用的HRP底物為3,3-二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍(lán)紫色).陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨,并可根據(jù)SDS-PAGE時(shí)加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量.RT-PCR與Q