淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及酶活力測定

1、南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及酶活力測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)習(xí)從土壤中分離微生物的方法；2、學(xué)習(xí)淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選方法3、了解分光光度計(jì)法測定酶活力的原理及方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：土壤中含有大量的微生物，將土壤稀釋液涂在不同類型 的培養(yǎng)基上，在適宜的環(huán)境中培養(yǎng)幾天，細(xì)菌或者是其他的 微生物便能在平板上生長繁殖，形成菌落。將初次篩選得到 的微生物接到淀粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因?yàn)橹挥心軌虍a(chǎn)生淀粉酶 的細(xì)菌才能夠利用培養(yǎng)集中的淀粉成分來完成自身的生命 活動(dòng)，才能夠生存。故在淀粉培養(yǎng)基上長出的菌便是淀粉產(chǎn) 生菌。在培養(yǎng)基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不顯現(xiàn)藍(lán)色， 出現(xiàn)透明圈，可以通過透明圈的大小來初步判斷菌

2、種產(chǎn)淀粉 的能力。淀粉酶是指一類能催化分解淀粉分子中糖苷鍵的酶的總稱，主要包括a淀粉酶和B -淀粉酶等，a -淀粉酶可從 淀粉分子內(nèi)部切斷淀粉的a -1,4糖苷鍵，形成麥芽糖、含有 6個(gè)葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又稱為液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈藍(lán)色。這種淀粉- 碘復(fù)合物在 660nm 處有較大的吸收峰，可用分光光度計(jì)測 定。隨著酶的不斷分作用，淀粉長鏈被切斷，生成小分子的 糊精，使其對碘的藍(lán)色反應(yīng)逐漸消失，因此可以根據(jù)一定時(shí) 間內(nèi)藍(lán)色消失的程度為指標(biāo)來測定a-淀粉酶的活力。三、實(shí)驗(yàn)器材及試劑：1、培養(yǎng)基：（1）分離培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（牛肉膏3g、蛋白胨1

3、0g、NaCI5g、溶于1000mL蒸餾水中，再加入15g瓊脂粉，pH調(diào)至，121C滅菌15min，待冷卻至 50C左 右時(shí)，于超凈工作臺倒平板）（2） 篩選培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基（可溶性淀粉20g, 硝酸 鉀 1g, 磷酸氫二鉀 , 氯化鈉 , 硫酸鎂 , 硫酸亞鐵 , 瓊脂 20g, 水 1000毫升，調(diào)整pH值到。）（3）搖瓶培養(yǎng)：淀粉培養(yǎng)液。2、試劑：碘液、 2%可溶性淀粉、磷酸氫二鈉 - 檸檬酸緩沖液、標(biāo) 準(zhǔn)糊精溶液、 L 乙酸、 %生理鹽水。3、器材： 培養(yǎng)皿、錐形瓶、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫水浴 鍋、分光光度計(jì)。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、淀粉產(chǎn)生菌的篩選：（1）采集土樣，并用無菌水稀釋成

4、菌懸液；（ 2）配置牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基及淀粉培養(yǎng)基，倒 平板備用；（ 3）將制好的菌懸液與超凈工作臺上涂到牛肉膏蛋白 胨平板上，于 37 攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一天；（ 4）挑取整個(gè)菌落，將其移入淀粉培養(yǎng)基中，繼續(xù)放在 37 攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天；（5）將碘液滴在平板上，觀察透明圈的大小。2、酶活力測定：（ 1）選產(chǎn)生透明圈最大的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，將菌溶 于 5ml 無菌生理鹽水中，吸取此培養(yǎng)液加入淀粉培養(yǎng)液中， 30 攝氏度搖瓶培養(yǎng) 72h。（2）酶液稀釋：取發(fā)酵液進(jìn)行 4000r/min 離心 5min ，取上清液， 用緩沖 液適當(dāng)稀釋。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作： 準(zhǔn)備七支試管，按照下表配置混

5、合液。使用分光光度計(jì)策規(guī)定各管溶液在 660nm下的0D值。然后以淀粉濃度為橫 坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）酶活力測定取稀釋的粗酶液也按照下表中七號管 的要求配置混合液，測得吸光度后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的淀粉濃度，求出被酶消耗的淀粉量管號i234567淀粉稀釋液/ml2( 0%2( %2( %2( %2( %2( %2( %緩沖液/ml111111140攝氏度水浴保溫 5min管號1234567蒸餾水/ml1111110粗酶液/ml000000140攝氏度水浴保溫 30min，然后放入沸水浴 5min,每管加入稀碘液1ml(5) 酶活力測定：酶活力以每毫升粗酶液在 40攝氏度，的條件下每小時(shí) 所分解的淀粉毫克數(shù)來衡量。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1淀粉產(chǎn)生菌的篩選：淀粉產(chǎn)生菌透明圈的檢驗(yàn)圖2、酶活力測定：(1)實(shí)驗(yàn)預(yù)測數(shù)據(jù)：管號1234567分解淀粉數(shù)/mg0( 2)計(jì)算：樣品的 OD660= 查標(biāo)準(zhǔn)曲線可得：淀粉含量 =初始淀粉含量=2g/100ml x 2ml=40mg 被消耗的淀粉含量 =40mg =酶活力=(1ml x =(ml h)六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析： 平板菌落水解圈直徑大小受許多因素的影響 , 例如菌