包涵體的處理(論壇整理)

1、關(guān)于包涵體的純化是一個令人頭疼的問題，包涵體的復(fù)性已經(jīng)成為生物制藥的瓶頸，關(guān)于包涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復(fù)性以及純化，內(nèi)容比較龐雜，嘗試整理ing一、菌體的裂解1、怎樣裂解細(xì)菌？ 細(xì)胞的破碎方法 1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。2.玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動物臟器組織。3.超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液

2、，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施，時間以及超聲間歇時間、超聲時間可以自己調(diào)整，超聲完全了菌液應(yīng)該變清亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀察。對超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應(yīng)慎用。4.反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。5.化學(xué)處理法：有些動物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶

3、處理效果更好，我用的濃度一般為1mg/ml。無論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且應(yīng)該在破碎的同時多加幾次；另外，還可通過選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。這是本室的標(biāo)準(zhǔn)配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.59.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100

4、, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在這個pH范圍內(nèi)比較好發(fā)揮作用)但我個人的經(jīng)驗是:如果你裂解細(xì)菌是為了提取蛋白的話,而且蛋白的分子量又小于20kd的話,盡量減少溶菌酶的用量,會引入溶菌酶這種雜蛋白.一般配60ml裂解液用藥匙匙柄盛一點就夠.判斷裂解好壞的標(biāo)準(zhǔn)是,溶液很粘.本室的protocol是10ml-50ml緩沖液(菌體洗滌液,裂解液等)/1g濕菌體.2、表達(dá)重組蛋白時，細(xì)菌裂解方法都有哪些？ 我在表達(dá)重組蛋白時，誘導(dǎo)以后跑SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)表達(dá)都很好，但是在裂解細(xì)胞時遇到問題?？偸遣荒軓氐琢呀饧?xì)胞。首先我采用超聲裂解，可是不管我如何超聲總有部分細(xì)菌沒有裂解。我的超聲條件如下：寧波新芝超

5、聲細(xì)胞破碎儀，功率400W，超5秒，間隔5秒，重復(fù)99次。然后顯微鏡觀察，不徹底時再重復(fù)99次。菌體來自200 ml培養(yǎng)液，用20 ml PBS重懸。然后我又嘗試加溶菌酶，首先加至終濃度100 ug/ml，4C半小時菌液不變粘，加大濃度至1 mg/ml，半小時后仍無明顯變化。因為我用的PBS是pH7.4，我懷疑是pH不合適，換用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小時仍無明顯變粘。因為這次使用的溶菌酶是前一天配好的，擔(dān)心溶菌酶失效，重新稱取凍干粉末，直接加入菌液，仍然沒有明顯變化。真是郁悶。到底出了什么事？請高手解答，并介紹優(yōu)化的方案。同時希望能介紹一下如何選擇細(xì)胞破碎

6、方法，以及如何確定最佳條件。溶菌酶在pH7.4時是否沒有活性了？可否配成濃縮液保存溶菌酶，如果可以，應(yīng)如何保存？請問你是如何知道是沒有裂解完全呢？是不是有目的蛋白的聚集呢？再加上反復(fù)凍融幾次。加入溶菌酶以后，如果細(xì)胞壁已破壞，菌液應(yīng)該變粘吧，因為核酸被釋放出來。而超聲破碎細(xì)胞，我覺得菌液是不會變粘的，因為超聲可以把大分子核酸打碎成小片段。我判斷細(xì)胞破碎不完全是因為，在將破碎后樣品離心分離上清和沉淀跑SDS-PAGE觀察，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞碎片組分中除了經(jīng)常出現(xiàn)的一兩條帶以外，還有菌體總蛋白樣品中的很多帶出現(xiàn)。據(jù)此可以判斷細(xì)胞只是部分破碎。不知我的分析是否正確，請版主和各位高手指教。如果溶菌酶效果還可以

7、，我覺得先用溶菌酶初步裂解細(xì)胞，然后再用超聲進(jìn)一步破碎并斷裂大分子核酸以降低粘度的細(xì)胞破碎策略可能比較好。因為超聲有可能使蛋白變性，但單用溶菌酶不能確定是否完全破碎，還要再加核酸酶降低粘度。這種兩步法策略應(yīng)該還可以減少破碎條件優(yōu)化的時間。我用的溶菌酶放置時間比較長了，有可能失活了。我剛從生工又定了一支，不過得后天到貨，但愿它有用。如何觀察溶菌酶是否已裂解細(xì)胞，通過觀察粘度變化是否可以？只反復(fù)凍融是否可以有效裂解大腸桿菌細(xì)胞？你在-70度多反復(fù)凍融幾次pengkp wrote:如何觀察溶菌酶是否已裂解細(xì)胞，通過觀察粘度變化是否可以？只反復(fù)凍融是否可以有效裂解大腸桿菌細(xì)胞？溶菌酶可能是不好用了，看

8、換成新的如何吧。加了溶菌酶后溶液變粘了，還有一個指標(biāo)就是PH降低了，檢測方法很簡單，用普通的PH試紙粘一下就知道了。菌體胞液的成分是酸的。我們一般還要邊溶菌，邊調(diào)PH，保持PH=8左右酶的最適PH。只反復(fù)凍融對大腸桿菌效果不太好，壁不易破壞?？墒侵魅危煌耆呀獾脑?，PH值也應(yīng)該降低啊，PH要降到什么程度代表完全裂解呢？反復(fù)凍融應(yīng)該對真核細(xì)胞（無細(xì)胞壁）更加有效。我感覺PH是在不斷的降低。比如調(diào)PH到8了，攪一會再試，又到5了，再調(diào)，再攪，PH就又會降低。直到PH不降了，說明裂完了。溶菌酶只有在pH值大于8.0的條件下才能發(fā)揮溶菌作用，請務(wù)必保持PBS的pH8.0，同時溶菌酶的量一定要足！在加

9、入溶菌酶后，最好放于磁力攪拌器上攪拌30分鐘，再進(jìn)行超聲破菌，我的超聲條件是：功率400W，工作2秒，間隔2秒，重復(fù)199次。菌體來自500 ml培養(yǎng)物，用30 ml PBS重懸，超聲效率還是可以的。哪兒的溶菌酶好用？我用生工的溶菌酶，稱取干粉20mg。200ml菌液用18 ml NaCl重懸，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，將溶菌酶干粉加入體系，混勻，測pH降低到56，加20 ul 2M Tris堿，體系pH升到8。4C放置1小時，菌液上層變澄清，搖動發(fā)現(xiàn)體系沒有變粘。測pH仍在8左右。再37C保溫1小時，還沒有變化，我簡直不知如何才好了。另一瓶200ml培養(yǎng)物，溶菌

10、酶處理1小時后超聲。條件：300W，超5秒停5秒，重復(fù)99次。菌液有變化，但很不明顯。繼續(xù)超聲400次，從外觀來看沒有太大區(qū)別。我簡直要說tmd了。見鬼了。我的操作有什么地方不妥當(dāng)，請各位指正。溶菌酶的廠商要求是否很重要？我的誘導(dǎo)物來自1：20過夜培養(yǎng)物接種，37C生長3小時后30C誘導(dǎo)2小時（0.8mM IPTG）。是否菌液太濃，Pharmacia的說明書200 ml培養(yǎng)物用10 ml重懸，我用20 ml，仍然不夠??？有人告訴我菌液應(yīng)該稀一些，200 ml用3040 ml重懸。但實際操作也不夠理想。SDS-PAGE總是觀察到細(xì)胞破碎效果不夠徹底。超聲那么多次，蛋白都要被超碎變性了。細(xì)菌破碎有

11、什么關(guān)鍵點？我哪兒沒注意到？我只有到DXY求助了。各位快支招啊。超聲效果不太好，冰浴，時間又長，但做到絕對沒有不破的菌是不可能的，只要大部分破就可以了。最好是用壓力勻漿機(jī)，效果非常好，不過好多地方都沒有。還有一種方法，也許可以，請參考美國專利5,760,1891. 溶菌酶在作用時很多大腸桿菌的株系不產(chǎn)生很明顯的溶菌，因只水解胞壁肽聚糖，在壁上打幾個小孔，其實已發(fā)生效果。其特征是菌懸液開始是乳濁狀象牛奶，加入溶菌酶后很快菌體發(fā)生聚集，有細(xì)小顆粒狀物出現(xiàn)。.將表達(dá)載體換至BL21(DE3)pLys這種類型的大腸桿菌中去，不會有難溶菌的問題。它自帶溶菌酶，簡單凍融就徹底溶菌。在收集菌體時你速度慢一點

12、都不行，它已經(jīng)開始溶菌了。放在液氮重反復(fù)凍融幾次，效果很好3、酵母的破碎用什么方法可以快速簡便地裂解酵母細(xì)胞壁？我看到一種用Chloroform/SDS不錯，但不知道詳細(xì)的操作步驟。請各位指點。謝謝！一般應(yīng)用 chloroform /SDS可增大細(xì)胞的通透性（Permeabilization），因此要進(jìn)一步的裂解仍然需要超聲輔助。具體參見：Kevin L. Griffith and Richard E. Wolf, Jr.1，Measuring b-Galactosidase Activity in Bacteria:Cell Growth, Permeabilization, and Enz

13、yme Assays in 96-Well Arrays，Biochemical and Biophysical Research Communications 290, 397402 (2002)，/wolf/b-gal/b-gal.bbrc.pdf另外聽別人介紹過：Y-PER 酵母蛋白抽提試劑 （簡單易用，在20分鐘以內(nèi)溫和破碎酵母細(xì)胞壁，聽起來的確好?。┳饔锰攸c：1.是常規(guī)玻珠研磨法得率的二倍以上 2.避免常規(guī)玻珠研磨法的問題（玻珠靜電、滾落、破碎） 3.也適用于革蘭氏陰性、陽性菌酵母是一類單細(xì)胞真菌的總稱，其成員分別屬于不同的真菌綱

14、，細(xì)胞壁成分是否會有較大差別，這些都是做破碎酵母細(xì)胞前要考慮的。我歸納了一下，做破碎酵母的幾種方法： 1 機(jī)械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超聲，蛋白活性保持較好。2 化學(xué)裂解的方法：10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢柚烈后w狀（希望高手點評）3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0）高壓勻漿。（這個好象也該在方法2中）4 液氮凍融并研磨酵母破壁，我認(rèn)為這種可能在小試中比較合適。5 溫和的酶法，可能不會會破壞酵母

15、原生質(zhì)體具體參見（我稍稍整理了一下，不過是否準(zhǔn)確可信，只有做了才有發(fā)言權(quán)）： 另外，關(guān)于Y-PER破碎酵母細(xì)胞壁，也是以前聽別人講的，希望dlzhkkk 等用過的園友不吝賜教！微生物學(xué)雜志.2002,22(1).-59-59酵母基因組DNA的兩個簡易制備方法中介紹的方法不錯制備基因組用于做PCR的話我感覺還是玻璃珠法最好，也非常簡單；我用其他方法抽到大團(tuán)的GENOME可是PCR拉不出來，如果玻璃珠法抽，沉淀后看不到很明顯的GENOME，但PCR能拉出來（2.3KB），可能質(zhì)量是最關(guān)鍵的吧；菌落法有的能拉出小的非特異性條帶（700BP），有的什么都拉不出來，可能拉小片段還是可以的微生物學(xué)報上那篇

16、有點好笑啊，那么羅嗦還稱為簡單方法我要做耐藥的金黃色葡萄球菌SDS_PAGE,但我沒辦法把細(xì)菌破碎，我試了用超聲和上樣緩沖液都沒成功。請問高手有什么好的辦法將其裂解？酵母是一類單細(xì)胞真菌的總稱，其成員分別屬于不同的真菌綱，細(xì)胞壁成分是否會有較大差別，這些都是做破碎酵母細(xì)胞前要考慮的。我歸納了一下，做破碎酵母的幾種方法： 1 機(jī)械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超聲，蛋白活性保持較好。2 化學(xué)裂解的方法：10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢柚烈后w狀（希望高手點評）3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L

17、,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0）高壓勻漿。（這個好象也該在方法2中）4 液氮凍融并研磨酵母破壁，我認(rèn)為這種可能在小試中比較合適。5 溫和的酶法，可能不會會破壞酵母原生質(zhì)體具體參見（我稍稍整理了一下，不過是否準(zhǔn)確可信，只有做了才有發(fā)言權(quán)）： 另外，關(guān)于Y-PER破碎酵母細(xì)胞壁，也是以前聽別人講的，希望dlzhkkk 等用過的園友不吝賜教！很全面！補(bǔ)充一點：酶法裂解主要用兩種酶：1。蝸牛酶，可以直接從蝸牛的胃液中獲得；2。lyticase，可以從sigma定購。這兩種酶解法都可以和上面的幾種方法結(jié)合使用，尤其是glass beads方法，效

18、果很好。請教各位，有誰了解pichia酵母的破碎方法。我的蛋白是胞內(nèi)表達(dá)的，曾用玻璃珠振蕩破碎，振60秒冰浴60秒重復(fù)10次，裂解液：EDTA+PMSF+磷酸鈉buffer,效果不理想。真菌DNA的提取，真菌學(xué)報上用氯化芐的方法破壁，我做過產(chǎn)率不錯。但是氯化芐有毒，對眼睛的刺激太大了，我在實驗室作實驗時，害的幾個小師妹在旁痛哭流涕，我好內(nèi)疚。忘了告訴大家，我的方法如下：1）取1g菌體樣本加入5ml提取液（100mM Tris-HCl, pH9.0, 40mM EDTA, pH8.0）振蕩混勻；2）加入1ml 10%SDS, 3ml氯化芐，0.5ml蛋白酶K（20mg/ml）, 劇烈震蕩，使管內(nèi)

19、混合物呈乳狀；3）55水浴保溫1h,每15min搖勻一次；4）加3 ml 3M NaAc(pH5.2 )混勻，冰水浴15min; 5) 10000g 4離心15 min; 6) 取上清液加入等體積氯仿10000g 離心10min; 7)取上清，加入等體積異丙醇，-20沉淀30min; 8) 12000g離心15min，沉淀用70%乙醇洗2次，吹干溶于滅菌的雙蒸水。4、超聲破碎的條件選擇請問超聲破碎的最佳條件怎么設(shè)置？我擔(dān)心超聲時間太長、功率太高等等對蛋白活性有影響。謝謝！你應(yīng)該先在右上角的"search"輸入"超聲破碎"的字樣,可以搜到一些舊帖.如:在細(xì)

20、菌超聲破碎時有什么方法能簡單準(zhǔn)確地判斷細(xì)菌已經(jīng)完全破碎？苦于沒有一個標(biāo)準(zhǔn)而無法判斷表達(dá)的蛋白是形成了包含體還是細(xì)胞沒有破碎完全。還有就是超聲破碎會不會使可溶的目標(biāo)蛋白形成沉淀？請各位高手不吝賜教。晚輩不勝感激。另外,最近剛剛有一個關(guān)于超聲破碎的貼.我們實驗室的經(jīng)驗是超聲后菌液不粘稠，可認(rèn)為破碎完全。然后在洗滌包含體的過程中收集各步的樣品，經(jīng)sds-page鑒定目的蛋白是以可溶還是包含體形式表達(dá)。超聲條件合適的話，可溶性蛋白不會沉淀。如果條件太劇烈，如超聲強(qiáng)度太大或時間過長，蛋白可能發(fā)生物理變性。如果破碎不完全的話,你的樣SDS電泳的時候,沉淀跑出來是連續(xù)的,許多地方連成一片,破碎完了,要小心電

21、泳,再用新配的染色液和脫色液,染色和脫色,你的條帶就會很漂亮.一般說來,破碎不回使可溶的蛋白沉淀.超聲包涵體的話，破碎完全后菌液應(yīng)該呈現(xiàn)近似灰白色中透清，不是一開始的黃白色。用槍頭吸一些，一滴一滴滴下來時應(yīng)該沒有粘連。包涵體超聲時間過長會出現(xiàn)焦化，即有些黑色。若包涵體表達(dá)量不高，超聲時間長了可能會使目標(biāo)蛋白溶解。革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)，了解破碎情況。最簡單的方法：涂片-革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘-顯微鏡觀察切記：只用結(jié)晶紫染色別忘了染色后再用水稍沖洗一下染色不一定需要。槍頭滴下來不粘連就可以了任意一種單染色法染色后顯微鏡觀察均可以快速判定細(xì)菌是否已破碎完全。建議預(yù)實驗用染色或測定吸光度的方

22、法確定破碎效果 以后就評經(jīng)驗看看好了 呵呵看那么多高手都很有經(jīng)驗，大家能不能給出幾個實際的超聲條件，我也一直對如何確定超聲是否恰好犯愁。這是一個實驗室的超聲條件：300W, 超2秒，間隔2秒，重復(fù)99次對于以上的討論，我的一點理解：超聲后菌液不可能粘稠，因為核酸都被打斷成小片段了，根據(jù)液體粘稠度變化來判斷超聲效果可能不太合適。同樣的道理，槍頭滴下不粘連可能也不能準(zhǔn)確判斷。超聲以后，菌液外觀確實有變化，一般超聲后菌液感覺變得更透明了，可是經(jīng)常無法準(zhǔn)確判斷透明到何種程度算是可以了，如果沒有標(biāo)準(zhǔn)超聲樣品，實在不好判斷。染色法可能比較準(zhǔn)確，但手頭要有顯微鏡和染液。吸光度法沒試過，從道理來講應(yīng)該可以。染

23、色法應(yīng)該是比較可靠和準(zhǔn)確的方法，顯微鏡和染液都很容易得到。以染色法確定最佳超聲條件，以后則不需每次都通過染色來判定，只需以摸索得出的最佳條件超聲即可。吸光度法雖理論上可行，但實際應(yīng)用起來并不能達(dá)到最理想的效果。如果你是新手又不太確定，那么染色也可以。我們經(jīng)常做的就憑經(jīng)驗看菌液外觀和粘連度就可以了，沒有什么問題。工作量大的時候，為此再染個色太麻煩。我記得不是600就是640nm（不好意思忘記了）可以檢測破碎程度，當(dāng)然你可以沒隔一斷時間檢測吸光度變化，作個破碎曲線啊。我做過的包含體破碎后都是灰白色，期間摻雜有黑色，煮了離心電泳可以看到很漂亮的帶?？梢愿鶕?jù)感官上判別一下，破碎前和破碎后是有很大的區(qū)別

24、的，能看出來，做幾次后，你可以根據(jù)經(jīng)驗判斷了，其實也沒有一個明確的概念，那種條件是合適的，因為你每次處理的樣品不一樣，所以可以根據(jù)你的經(jīng)驗來定到一種什么樣的程度是合適的我們現(xiàn)在準(zhǔn)備超聲波破碎小鼠胚胎，但是不知道胚胎放到什么混合液中超聲破碎，混合液中應(yīng)該加什么酶抑制劑！我們是準(zhǔn)備定量分析胚胎中的熱休克蛋白我們是準(zhǔn)備定量分析附植前胚胎合成的熱休克蛋白可以使用edit功能對原貼進(jìn)行編輯。irenedeng wrote:如果破碎不完全的話,你的樣SDS電泳的時候,沉淀跑出來是連續(xù)的,許多地方連成一片,破碎完了,要小心電泳,再用新配的染色液和脫色液,染色和脫色,你的條帶就會很漂亮.一般說來,破碎不回使可

25、溶的蛋白沉淀.你的意思是說，沉淀也可以跑出漂亮的一條一條的帶？但為什么破碎不完全，沉淀跑出來的是連續(xù)的？我們在跑全菌的時候，條帶也是一條一條的呀是用破碎后，經(jīng)過離心之后的菌泥做SDS電泳嗎，那樣的話是不是條帶很多？離心后的上清液要跑電泳嗎？即使破碎不完全的話，只要有目的蛋白的話，條帶還是有的，而且可能也很清楚，一條一條的吧。請問樓上：檢測吸光度變化判斷是否破碎完全時，會有什么規(guī)律？若包涵體表達(dá)量不高，超聲時間長了可能會使目標(biāo)蛋白溶解。是真的嗎？我正在做菌體表達(dá)蛋白純化，開始的時候按包含體做的，結(jié)果現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)超聲波破碎后目的蛋白留在上清里面，這次的超聲波時間是長了些，大家給分析一下是原來本來就是融

26、合性蛋白還是包涵體溶化了？有活性就可以了呀，不用在乎那么多sdau wrote:最簡單的方法：涂片-革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘-顯微鏡觀察切記：只用結(jié)晶紫染色用染色法判斷，能不能說的具體一些，謝了！當(dāng)你看了這些帖子,覺得還要疑惑的話再提問,這樣的問題因為具體更有價值,才可能得到更多的應(yīng)助.要更好地從丁香園獲取知識的話,一定要多琢磨應(yīng)該怎樣使用,這樣不光是利己也是利人,利人的人才可能獲得別人更多的更熱忱的幫助啊求助：用超生波破碎細(xì)胞時，怎樣可以不讓溫度超過度？在破碎的時候，準(zhǔn)備一個冰盒，把試管放在里面，超生的時候托著點，這樣就能保證溫度不高了我們這是一個超生波水浴鍋,不是準(zhǔn)備一個可以懸浮的冰

27、盒,裝上冰,把管子放在冰上,把冰盒放在水上,這樣打超聲波可不可以?BACTERIA11 wrote:在破碎的時候，準(zhǔn)備一個冰盒，把試管放在里面，超生的時候托著點，這樣就能保證溫度不高了溫度高冰會融化，注意及時換冰！可以做個支架，托住試管，然后整個放在冰水浴中更好，只需要定時補(bǔ)充冰就可以，首先超聲破碎細(xì)胞不是用你說的超聲水浴鍋的，是用一種帶探頭的超聲細(xì)胞破碎儀，至少我沒有用超聲水浴鍋破碎細(xì)胞過，它主要功能是用來洗滌的。另外，你們有制冰機(jī)嗎？如果沒有的話就要多凍一點冰塊。如果用超聲細(xì)胞破碎儀可以用一個一次性杯子里面裝上碎冰，把試管放入，用手從杯子外捏住試管，超聲15s,間隔幾秒再繼續(xù)。如果是用超聲

28、水浴鍋，直接把碎冰放入其中，加水，制成含冰的水溶液，溫度在0-4度即可，如果過程中產(chǎn)熱過多則要加冰。把樣品放到小燒杯里，然后放入盛碎冰的大點的燒杯中。用架子托住。另外要保證間歇時間大于超聲時間，根據(jù)相應(yīng)的文獻(xiàn)確定這兩個具體的時間。樣品置于冰水混合物中,光用冰達(dá)不到效果!我們那超生波水浴鍋本來是用來洗滌用的，但它就不能用來破碎細(xì)胞嗎？我門也有一個帶探頭的超聲細(xì)胞破碎儀，但它一次只能處理一次樣品，好麻煩。知道的請給點意見！還是用專門的超聲細(xì)胞破碎儀吧。另外，昨天在壇子里看到，有人用乙醇，水的混合物置于冰箱冷凍室，可以代替冰水混合物，更冷。（哈哈，現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用）不知道你破碎什么細(xì)胞，通常都不需要破碎很長

29、時間呀！一般都是用冰水浴，工作10S，停10S，就可以維持在較低溫度下。如果你怕溫度高，那就工作時間縮短，停止時間增加。這樣就應(yīng)該可以解決發(fā)熱升溫問題。當(dāng)然，時間就要延長了！dingxinhua wrote:我們那超生波水浴鍋本來是用來洗滌用的，但它就不能用來破碎細(xì)胞嗎？我門也有一個帶探頭的超聲細(xì)胞破碎儀，但它一次只能處理一次樣品，好麻煩。知道的請給點意見！本來就是這樣的啊,都是有一個探頭的,一個一個樣品破碎.你一次同時處理的管數(shù)很多么?不是還要離心的么洗滌用的鍋子的效果恐怕不好吧我們是工作10s,停30-60s聽了各位的意見真是收益非淺,謝謝各位了,我破碎的水稻葉片組織,需要15分鐘.每工作

30、10s,停30-60,那豈不是要很長時間.我的方法源自下面的方法:Protocol for Protein ExtractionGround tissue in a mortar with liquid nitrogen. Collect grounded material in a eppendorff tube (tube weight 1.0 g). Weight the material Add 10 % w/v trichloroacetic acid and 0.07 % v/v 2-mercaptoethanol in COLD (-20 C) acetone (approx.

31、1ml for 0.3 g of tissue Incubate for 2 hs at -20C (Other protocols leave it over night at -20 C) Centrifuge the precipitated proteins in microfuge for 15-20 min. at 14,000 rpm Wash pellet with COLD acetone containing 0.07 % v/v 2-mercaptoethanol (approx. 1 ml) to remove pigments and lipids until the

32、 pellet is colorless. Dry proteins under vacuum (5- 10 min.) Resuspend proteins in the appropriate rehydration buffer Sonicate to extract proteins in a water-bath sonicator, 15-30 min. Centrifuge and collect the supernatant containing predominantly solubleproteins.他用的"water-bath sonicator"

33、,難道不是指的超生水浴鍋嗎?如果用超聲波破碎儀是不是用的 時間要少一些? dingxinhua edited on 2004-05-28 22:08 我認(rèn)為“water-bath sonicator”就是樓上大家討論的“超聲波破碎儀”，只不過是強(qiáng)調(diào)超聲時要水浴而已。"不讓溫度超過度"其實很難達(dá)到。我每次超聲（提包涵體），即使非常小心，也會有很小的一部分變糊。但因為只有不足1/20的一部分是糊的，不要緊。我使用的條件是工作5s,停15s，一共20m.但是不同的超聲波破碎儀功率是不一樣的，僅僅用超聲頻率來描述工作條件是不夠的。你提到的“需要15分鐘”，我認(rèn)為是指工作和停止的時間

34、加起來15分鐘，不是指超聲累計15分鐘。另外，一定要冰水浴，而且水要多于冰，因為水的傳熱強(qiáng)于冰?？傊囟ǖ膬x器，特定實驗對象，別人的意見只能參考，最佳條件還是要靠自己摸索。yangjingsc wrote:我認(rèn)為“water-bath sonicator”就是樓上大家討論的“超聲波破碎儀”，只不過是強(qiáng)調(diào)超聲時要水浴而已。"不讓溫度超過度"其實很難達(dá)到。我每次超聲（提包涵體），即使非常小心，也會有很小的一部分變糊。但因為只有不足1/20的一部分是糊的，不要緊。我使用的條件是工作5s,停15s，一共20m.但是不同的超聲波破碎儀功率是不一樣的，僅僅用超聲頻率來描述工作條件是不

35、夠的。你提到的“需要15分鐘”，我認(rèn)為是指工作和停止的時間加起來15分鐘，不是指超聲累計15分鐘。另外，一定要冰水浴，而且水要多于冰，因為水的傳熱強(qiáng)于冰。總之，特定的儀器，特定實驗對象，別人的意見只能參考，最佳條件還是要靠自己摸索。謝謝yangjingsc提的寶貴意見,破碎細(xì)胞的超升頻率應(yīng)該用多少比較好?需不需要用最大的頻率?對了，這一點也要注意，超聲的功率也不能太大，否則也容易碳化，一般不需要用最大的頻率。本室的超聲波破碎儀很早就不能調(diào)節(jié)和顯示功率了，以前顯示的也不準(zhǔn)，不愿意誤導(dǎo)你啊：）不過，儀器和實驗對象之間的差異都存在，即使別人提供了數(shù)值，不同的實驗?zāi)康模瑓⒖純r值不大。yangjings

36、c wrote:對了，這一點也要注意，超聲的功率也不能太大，否則也容易碳化，一般不需要用最大的頻率。本室的超聲波破碎儀很早就不能調(diào)節(jié)和顯示功率了，以前顯示的也不準(zhǔn)，不愿意誤導(dǎo)你?。海┎贿^，儀器和實驗對象之間的差異都存在，即使別人提供了數(shù)值，不同的實驗?zāi)康?，參考價值不大。知道了,yangjingsc,非常感謝,那我先試試在說!應(yīng)該用帶探頭的超聲細(xì)胞破碎儀,另外功率不能太高!用最大功率的1/2 可以嗎？我們那有兩個旋紐，一個是“power" 一個是"tune",應(yīng)該怎樣設(shè)置比較好？還有一個問題，我的樣品真空干燥的時候，里面的樣品會噴出來，我該怎么解決比較好呀？知道的請

37、給出個點子？是冷凍干燥嗎，如果是液體樣品去凍干，讓液體結(jié)冰時定時旋轉(zhuǎn)一下容器，不要讓液體結(jié)成一大塊，凍成碎冰屑狀，抽真空時就不會因為水的升華將樣品帶出來，開真空時也要慢些打開，一般凍干機(jī)有配墊片，象濾紙一樣，可以加上防止粉末被吸入真空室tune應(yīng)該是調(diào)功率的,我記得以前旋紐的位置是低于1/2的.樣品凍干時,1)首先要將樣品放到EP管里,我們一般用2ml的,在EP管管口包上錫箔紙,用針尖刺出一些小孔,2)然后放進(jìn)-70度冰箱凍實.3)再將凍干機(jī)打開,一直到凍干機(jī)的溫度低于-40度,4)再將在-70度冰箱凍實的樣品取出,置凍干機(jī)里抽干.所謂"凍干",就是將樣品在冷凍的條件下負(fù)壓

38、抽干,使溶劑直接由固態(tài)進(jìn)入氣態(tài)被去除,避免出現(xiàn)從液態(tài)到氣態(tài)的過程產(chǎn)生而致樣品噴出.至于樓上的說的"讓液體結(jié)冰時定時旋轉(zhuǎn)一下容器，不要讓液體結(jié)成一大塊，凍成碎冰屑狀",這點我沒有那么細(xì)致,我的樣品都是凍實成一塊的.不過只要注意封錫箔紙,凍干機(jī)預(yù)冷,樣品維持低溫固體狀態(tài),一定不會出現(xiàn)噴樣的現(xiàn)象. yangjingsc edited on 2004-05-30 21:26 很郁悶呀,你們那都有冷凍干燥機(jī),我門這沒有,怪不得會噴出來、,不過已經(jīng)定了一臺,希望早點到貨.還問一下,你們那 的超聲波細(xì)胞破碎儀,適合幾毫升的離心管,我們這只能用5 毫升的離心管,而且我們這沒有適合5毫升離心

39、管的離心機(jī),我要先用10毫升的離心管脫色,干燥樣品,然后再轉(zhuǎn)到5毫升離心管,超聲波處理后,又要轉(zhuǎn)到2毫升離心管離心.真是好麻煩呀,在轉(zhuǎn)來轉(zhuǎn)去的過程中,損失了不少東西,真是不爽.你們說我該怎么辦呀?超聲時間太長、功率太高對蛋白活性肯定有影響。參照相關(guān)文獻(xiàn)（前人的積累還是很重要哦），再結(jié)合自己的實際情況作適當(dāng)調(diào)整以確定最佳條件。值得一提的是超聲破碎過程中要注意降溫，其次要以破碎過程中不產(chǎn)生氣泡為宜。其實園子里關(guān)于超聲破碎的帖子不少，自己檢索一下吧。先自助再求助，你將會得到更多。祝好運！謝謝各位兄弟，功率800w行不行??？fenghui507 wrote:謝謝各位兄弟，功率800w行不行?。棵總€人得

40、情況都不一樣.我認(rèn)為你不能將別人得方法簡單得套用到自己身上.二樓得戰(zhàn)友說得非常好,希望你多多領(lǐng)會一下其中得要領(lǐng).我看過你發(fā)得帖子,想對你提出幾點建議,希望你能接受:一.多想;遇事多想想自己能否解決,怎么解決,發(fā)帖得時候最好能把自己得思路同時寫出來.說明自己在那個環(huán)節(jié)上遇到了難題,比起你單單就某個問題簡單發(fā)問,效果要好很多.能學(xué)到解決問題得方法比僅僅知道問題得答案有意義很多.二.多動手;你得問題很多屬于共性得.之前很多得帖子中都有深入得討論,善于利用搜索本版得功能,將會使你對dxy得存在有了更深得領(lǐng)悟.她不是僅僅是一個問答平臺,更是一個知識得寶庫,發(fā)掘其中得寶藏才是我們來到這里真正原因.三.多參

41、與;dxy活力以及魅力不斷提高得重要原因是一大批戰(zhàn)友不僅從中獲得了知識,更重要得是大家也充分施展自己得才華,回報dxy! 網(wǎng)絡(luò)提供給每個人很多便利,但我們不能成為她得奴隸,而是要她成為我們手中得利器,這才是網(wǎng)絡(luò)得本質(zhì)!一些小建議,不知道中不中聽.However,希望你在蛋白版過得愉快!超聲破碎的條件不能一概而論，要看你的實驗要求，有的是細(xì)菌破碎，有的是對組織細(xì)胞進(jìn)行破碎，要掌握好功率和每次超聲時間，功率大時，每次超聲時間可縮短，不能讓溫度升高，必要時在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。至于每次超聲時是否起泡沫到不是關(guān)鍵的問題，這與你超聲的量明顯有關(guān)。5、如何鑒定細(xì)菌超聲破碎的程度 在細(xì)菌超聲破碎時有什么

42、方法能簡單準(zhǔn)確地判斷細(xì)菌已經(jīng)完全破碎？苦于沒有一個標(biāo)準(zhǔn)而無法判斷表達(dá)的蛋白是形成了包含體還是細(xì)胞沒有破碎完全。還有就是超聲破碎會不會使可溶的目標(biāo)蛋白形成沉淀？請各位高手不吝賜教。晚輩不勝感激。我們實驗室的經(jīng)驗是超聲后菌液不粘稠，可認(rèn)為破碎完全。然后在洗滌包含體的過程中收集各步的樣品，經(jīng)sds-page鑒定目的蛋白是以可溶還是包含體形式表達(dá)。超聲條件合適的話，可溶性蛋白不會沉淀。如果條件太劇烈，如超聲強(qiáng)度太大或時間過長，蛋白可能發(fā)生物理變性。如果破碎不完全的話,你的樣SDS電泳的時候,沉淀跑出來是連續(xù)的,許多地方連成一片,破碎完了,要小心電泳,再用新配的染色液和脫色液,染色和脫色,你的條帶就會很

43、漂亮.一般說來,破碎不回使可溶的蛋白沉淀.超聲包涵體的話，破碎完全后菌液應(yīng)該呈現(xiàn)近似灰白色中透清，不是一開始的黃白色。用槍頭吸一些，一滴一滴滴下來時應(yīng)該沒有粘連。包涵體超聲時間過長會出現(xiàn)焦化，即有些黑色。若包涵體表達(dá)量不高，超聲時間長了可能會使目標(biāo)蛋白溶解。革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)，了解破碎情況。最簡單的方法：涂片-革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘-顯微鏡觀察切記：只用結(jié)晶紫染色別忘了染色后再用水稍沖洗一下染色不一定需要。槍頭滴下來不粘連就可以了任意一種單染色法染色后顯微鏡觀察均可以快速判定細(xì)菌是否已破碎完全。建議預(yù)實驗用染色或測定吸光度的方法確定破碎效果 以后就評經(jīng)驗看看好了 呵呵看那么多高手都

44、很有經(jīng)驗，大家能不能給出幾個實際的超聲條件，我也一直對如何確定超聲是否恰好犯愁。這是一個實驗室的超聲條件：300W, 超2秒，間隔2秒，重復(fù)99次對于以上的討論，我的一點理解：超聲后菌液不可能粘稠，因為核酸都被打斷成小片段了，根據(jù)液體粘稠度變化來判斷超聲效果可能不太合適。同樣的道理，槍頭滴下不粘連可能也不能準(zhǔn)確判斷。超聲以后，菌液外觀確實有變化，一般超聲后菌液感覺變得更透明了，可是經(jīng)常無法準(zhǔn)確判斷透明到何種程度算是可以了，如果沒有標(biāo)準(zhǔn)超聲樣品，實在不好判斷。染色法可能比較準(zhǔn)確，但手頭要有顯微鏡和染液。吸光度法沒試過，從道理來講應(yīng)該可以。染色法應(yīng)該是比較可靠和準(zhǔn)確的方法，顯微鏡和染液都很容易得到

45、。以染色法確定最佳超聲條件，以后則不需每次都通過染色來判定，只需以摸索得出的最佳條件超聲即可。吸光度法雖理論上可行，但實際應(yīng)用起來并不能達(dá)到最理想的效果。如果你是新手又不太確定，那么染色也可以。我們經(jīng)常做的就憑經(jīng)驗看菌液外觀和粘連度就可以了，沒有什么問題。工作量大的時候，為此再染個色太麻煩。我記得不是600就是640nm（不好意思忘記了）可以檢測破碎程度，當(dāng)然你可以沒隔一斷時間檢測吸光度變化，作個破碎曲線啊。我做過的包含體破碎后都是灰白色，期間摻雜有黑色，煮了離心電泳可以看到很漂亮的帶?？梢愿鶕?jù)感官上判別一下，破碎前和破碎后是有很大的區(qū)別的，能看出來，做幾次后，你可以根據(jù)經(jīng)驗判斷了，其實也沒有

46、一個明確的概念，那種條件是合適的，因為你每次處理的樣品不一樣，所以可以根據(jù)你的經(jīng)驗來定到一種什么樣的程度是合適的我們現(xiàn)在準(zhǔn)備超聲波破碎小鼠胚胎，但是不知道胚胎放到什么混合液中超聲破碎，混合液中應(yīng)該加什么酶抑制劑！我們是準(zhǔn)備定量分析胚胎中的熱休克蛋白我們是準(zhǔn)備定量分析附植前胚胎合成的熱休克蛋白可以使用edit功能對原貼進(jìn)行編輯。irenedeng wrote:如果破碎不完全的話,你的樣SDS電泳的時候,沉淀跑出來是連續(xù)的,許多地方連成一片,破碎完了,要小心電泳,再用新配的染色液和脫色液,染色和脫色,你的條帶就會很漂亮.一般說來,破碎不回使可溶的蛋白沉淀.你的意思是說，沉淀也可以跑出漂亮的一條一條

47、的帶？但為什么破碎不完全，沉淀跑出來的是連續(xù)的？我們在跑全菌的時候，條帶也是一條一條的呀是用破碎后，經(jīng)過離心之后的菌泥做SDS電泳嗎，那樣的話是不是條帶很多？離心后的上清液要跑電泳嗎？即使破碎不完全的話，只要有目的蛋白的話，條帶還是有的，而且可能也很清楚，一條一條的吧。請問樓上：檢測吸光度變化判斷是否破碎完全時，會有什么規(guī)律？若包涵體表達(dá)量不高，超聲時間長了可能會使目標(biāo)蛋白溶解。是真的嗎？我正在做菌體表達(dá)蛋白純化，開始的時候按包含體做的，結(jié)果現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)超聲波破碎后目的蛋白留在上清里面，這次的超聲波時間是長了些，大家給分析一下是原來本來就是融合性蛋白還是包涵體溶化了？有活性就可以了呀，不用在乎那么

48、多sdau wrote:最簡單的方法：涂片-革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘-顯微鏡觀察切記：只用結(jié)晶紫染色用染色法判斷，能不能說的具體一些，謝了！6、細(xì)菌裂解的DNaseI我在做細(xì)菌裂解是，參考文獻(xiàn)用的DNA酶是mg/ml用量，但我買的DNA酶卻是活性單位，我想知道這兩個單位之間怎么換算呀？請遇到過這種情況的高手賜教。難道沒人遇到這個情況嗎?主任呢?救救我呀!這個問題版子里有過多次討論，下次再遇到這種情況可以先自己用關(guān)鍵詞找一下。 icesugar75 edited on 2004-05-17 21:45 不同純度的酶換算標(biāo)準(zhǔn)不同，所以你最好查查是哪個公司的酶？仔細(xì)看說明書，可能會有換算說明。

49、另外看一下參考文獻(xiàn)所用的酶是哪個公司的，到該公司的主頁也可能有收獲。我用過華美和TAKARA的DNA酶，華美的是用mg/ml。華美也有RNase free的DNA酶，定量用活性單位。TAKARA的兩種酶都是用活性單位定量的。我在超聲裂解細(xì)菌時加入一些DNA酶，一般用超聲液加不同量的酶做一個預(yù)實驗，選取符合你需要的酶量。其實根據(jù)目的和方法的不同，所需要的酶量也是可調(diào)節(jié)的，比如酶切溫度（16度或37度）。如果是固體的，直接配置20 mg/ml 如果是華美DNA酶：6080 U/ml相當(dāng)于20 mg/ml (Code No D2210)具體的你可參照下面的詳細(xì)降解脫氧核糖核酸酶 I (DNase I

50、)制品名TaKaRa Code 包裝量 價格(人民幣元) Deoxyribonuclease I(DNase I)D22103,000 U120脫氧核糖核酸酶 I (RNase Free)制品名TaKaRa Code 包裝量 價格(人民幣元) DNase I (RNase Free)D22151,000 U120  酶濃度   6080 U/ml, 20 mg/ml (Code No D2210)5 U/ml (Code No D2215)  貯存溶液 20mMTris-HCl(PH7.5)50mMNaCl0.1mMCaCl250%Glycer

51、ol  保存   -20 10×反應(yīng)緩沖液400 mMTris-HCl (pH7.5)80 mMMgCl250 mMDTT  酶稀釋液組成150 mM NaCl  起源 Bovine pancreas  概述 本酶是將單鏈或雙鏈DNA同等程度地隨機(jī)分解，生成具有5'-P末端寡核苷酸的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶。在Mg2+存在時，能在雙鏈DNA上隨機(jī)地產(chǎn)生切口；而在Mn2+存在下能將雙鏈DNA同時切斷，使DNA片段化。由于DNase I (RNase Free) 酶已經(jīng)完全除去

52、了Protease及RNase，從而提高了在中性區(qū)域的穩(wěn)定性，可以安全地用于RNA的制取。  一般性質(zhì)分子量已知有約31,000道爾頓左右的4種分子量，但酶的性質(zhì)不能區(qū)分。最適pH在pH7.0附近，在pH56區(qū)域穩(wěn)定。輔因子Ca2+活化劑Mg2+抑制劑EDTA (可逆的)穩(wěn)定性80、10分鐘熱處理后不可逆失活  活性定義以小牛胸腺DNA為底物，在25、pH5.0的條件下，1分鐘內(nèi)使反應(yīng)液的260 nm吸光度增加0.001所需要的酶量定義為1個活性單位 (Kunitz Unit)。純度Code No D22102 U的本酶和2 mg的5S rRNA在37、

53、pH7.5的條件下反應(yīng)24小時，RNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。Code No D221510 U的本酶和1 mg的16S, 23S rRNA在37，pH7.5的條件下反應(yīng)4小時，RNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。  使用注意稀釋后立即使用,稀釋的酶液不能保存。   用途 使用T7或SP6 RNA Polymerase進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄 (In vitro transcription) 合成RNA后，不必更換Buffer，使用DNase I (RNase Free) 即可將模板DNA降解。與DNA Polymerase I一起用于切口平移 (Nick translati

54、on)。在Mn2+存在的條件下，為鳥槍法測序 (Shot gun sequencing) 制作DNA文庫。用于足跡法 (Foot printing) 分析DNA-蛋白質(zhì)相互作用。PROTOCOLS & APPLICATIONApplication: 切口平移反應(yīng)體外轉(zhuǎn)錄后模板DNA的分解去除 (RNase Free DNase I)參考資料Kunitz, M. (1950) J. Gen. Physiol. 33, 349-377. Moore, S. (1981) The Enzymes 14, 281-296. Anderson, S. (1981) Nucleic Ac

55、ids Res. 9. 3015-3027. Galas, D. J. and Schmitz, A. (1978) Nucleic acids Res. 5, 3157-3170. 7、超聲裂解細(xì)菌是否完全？在細(xì)菌超聲破碎時有什么方法能簡單準(zhǔn)確地判斷細(xì)菌已經(jīng)完全破碎？苦于沒有一個標(biāo)準(zhǔn)而無法判斷表達(dá)的蛋白是形成了包含體還是細(xì)胞沒有破碎完全。還有就是超聲破碎會不會使可溶的目標(biāo)蛋白形成沉淀？請各位高手不吝賜教。晚輩不勝感激。我們實驗室的經(jīng)驗是超聲后菌液不粘稠，可認(rèn)為破碎完全。然后在洗滌包含體的過程中收集各步的樣品，經(jīng)sds-page鑒定目的蛋白是以可溶還是包含體形式表達(dá)。超聲條件合適的話，可溶性蛋

56、白不會沉淀。如果條件太劇烈，如超聲強(qiáng)度太大或時間過長，蛋白可能發(fā)生物理變性。如果破碎不完全的話,你的樣SDS電泳的時候,沉淀跑出來是連續(xù)的,許多地方連成一片,破碎完了,要小心電泳,再用新配的染色液和脫色液,染色和脫色,你的條帶就會很漂亮.一般說來,破碎不回使可溶的蛋白沉淀.超聲包涵體的話，破碎完全后菌液應(yīng)該呈現(xiàn)近似灰白色中透清，不是一開始的黃白色。用槍頭吸一些，一滴一滴滴下來時應(yīng)該沒有粘連。包涵體超聲時間過長會出現(xiàn)焦化，即有些黑色。若包涵體表達(dá)量不高，超聲時間長了可能會使目標(biāo)蛋白溶解。革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)，了解破碎情況。最簡單的方法：涂片-革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘-顯微鏡觀察切記：只用結(jié)晶紫染色別忘了染色后再