產(chǎn)纖維素酶的篩選

1、主講人：何 園 學(xué) 號(hào)：2014103015 時(shí) 間：2014.11.131. 研究背景研究背景2. 試驗(yàn)?zāi)康脑囼?yàn)?zāi)康?. 技術(shù)路線技術(shù)路線4. 試驗(yàn)方法試驗(yàn)方法5. 預(yù)期效果預(yù)期效果6. 參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)講解內(nèi)容講解內(nèi)容一一.研究背景研究背景纖維素作為地球上最豐富的可再生有機(jī)資源，其轉(zhuǎn)化和利用對(duì)解決能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染等問題具有十分重要的意義。纖維素酶是能夠作用于纖維素底物-1,4葡萄糖苷鍵的一類生物酶的總稱。由于開發(fā)利用木質(zhì)纖維資源對(duì)人類社會(huì)的今后發(fā)展具有重大意義，而纖維素酶對(duì)纖維素資源的開發(fā)起到極為關(guān)鍵的作用，對(duì)其研究一直是國內(nèi)外的熱點(diǎn)。纖維素代謝也是地球生物圈碳素循環(huán)的重要組成

2、部分，尋找和開發(fā)高產(chǎn)纖維素酶菌種，是充分利用纖維素資源的關(guān)鍵。研究進(jìn)展研究進(jìn)展： 該類酶上世紀(jì)40年代首次被發(fā)現(xiàn)。早期發(fā)現(xiàn)的纖維素酶主要由絲狀真菌的木霉、根霉等菌種產(chǎn)生，通常為酸酸性性 酶酶其最適作用pH值在3-5，在堿性條件下基本沒有酶活或活力很低。上世紀(jì)70年代，在嗜堿性的枯草芽孢桿菌(Bacillus sp. N-4 和 Bacillus sp.1139 菌株)中發(fā)現(xiàn)了最適作用pH在堿性范圍的纖維素酶，即堿性纖維素酶。隨后發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬(Bacillus)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的數(shù)十株嗜堿性菌株均能夠產(chǎn)生堿性纖維素酶，此外，動(dòng)物源堿性纖維素酶開始被報(bào)道，并成為開發(fā)堿性纖維

3、堿性纖維素酶素酶的重要方向。二二. .試驗(yàn)?zāi)康脑囼?yàn)?zāi)康哪壳?，酸性纖維素酶主要用于纖維素的水解糖化，而堿性纖維素酶則廣泛用于洗滌工業(yè)。不過，至今所研發(fā)的纖維素酶仍存在酶活力不足等問題，有必要挖掘新的酶資源。三三. 技術(shù)路線技術(shù)路線產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩菌株形態(tài)觀察菌株形態(tài)觀察菌株分子鑒定菌株分子鑒定誘變育種誘變育種產(chǎn)高活性纖維素酶菌株的鑒定產(chǎn)高活性纖維素酶菌株的鑒定菌株生化鑒定菌株生化鑒定優(yōu)化產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件制備酶液制備酶液測(cè)定酶活力測(cè)定酶活力繪制菌株生長曲線和產(chǎn)酶曲線圖繪制菌株生長曲線和產(chǎn)酶曲線圖測(cè)定測(cè)定CMC酶

4、的最適作用條件酶的最適作用條件確定產(chǎn)纖維素酶菌株的屬種確定產(chǎn)纖維素酶菌株的屬種比較兩種菌株酶活力比較兩種菌株酶活力測(cè)其透明圈及酶活力測(cè)其透明圈及酶活力四四. .試驗(yàn)方法試驗(yàn)方法1. 材料和儀器材料和儀器(1).用于菌株分離的樣品采自畜禽堆肥。(2).所用培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、CMC-剛果紅平板篩選培 養(yǎng)基、CMC液體發(fā)酵培養(yǎng)基、Bug培養(yǎng)基 (3).儀器:菌種鑒定96孔板2.方法方法 (1).菌株初篩菌株初篩：取樣品1 g，加10 mL無菌蒸餾水，充分振搖，靜止30 min，取上清液稀釋105倍，涂布接種CMC-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基，30培養(yǎng)72 h至菌落長出，挑取透明水解圈較大的菌落。(2).

5、菌株復(fù)篩菌株復(fù)篩：挑取透明水解圈較大的菌落，接種CMC液體發(fā)酵培養(yǎng)基，37、200rpm搖瓶培養(yǎng)24 h，測(cè)定培養(yǎng)液的堿性CMC酶活力，選取活力最高的培養(yǎng)瓶，取菌液劃線接種CMC-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，純化菌種次，最后得到產(chǎn)堿性纖維素酶的高產(chǎn)菌株，命名，斜面和冷凍干燥保藏。(3).菌株的形態(tài)觀察：菌株的形態(tài)觀察：LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體用革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌株形態(tài)。(4).分子鑒定分子鑒定：提取菌體DNA(CTAB法)，以該基因組DNA為模板，采用通用引物27F/1492R，PCR擴(kuò)增菌株的16SrRNA序列。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、分離，然后用Agarose Gel DNA Pu

6、rification Kit 試劑盒切膠回收，用T4 ligase連接到Pmd-18T載體上。將帶有目的片段的載體通過轉(zhuǎn)化E.coli DH 5菌株擴(kuò)增培養(yǎng)后，選擇陽性克隆提取質(zhì)粒測(cè)序。將測(cè)序得到的16S rRNA序列用NCBI的BLAST2.0進(jìn)行同源分析，搜索Genebank核酸數(shù)據(jù)庫，根據(jù)比對(duì)結(jié)果對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定。(5).菌株生化鑒定菌株生化鑒定:采用Biolog 微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行。操作按儀器的說明書進(jìn)行。(6).誘變育種誘變育種：制備孢子懸液：取試管斜面，用無菌水洗下孢子，裝入帶玻璃珠的三角瓶中，27振蕩2-3h，用脫脂棉過濾后，以10倍稀釋法作一系列稀釋，挑選一個(gè)稀釋度，用移液管

7、移l ml飽子懸液到小塑料離心管中，待用。紫外(UV)誘變方法：距離紫外燈30cm左右照射60s、70s、80s、90s、100 s，并不斷搖動(dòng)。硫酸二乙酯(DES)誘變方法:分別吸取1ml孢子懸液10ulDES(終濃度為1%)和30ul乙醇溶液于一小塑料離心管中，于30水浴振蕩45min、60min、75min，處理完畢后加入30ul 25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。 UV-硫酸二乙酯(DES)復(fù)合誘變(7) .測(cè)定誘變后菌株的透明圈并將其菌株發(fā)酵測(cè)其酶活測(cè)定誘變后菌株的透明圈并將其菌株發(fā)酵測(cè)其酶活力。力。(8).菌株生長及產(chǎn)酶特性測(cè)定菌株生長及產(chǎn)酶特性測(cè)定:活化菌株接種CMC發(fā)酵培養(yǎng)基，接

8、種量5，30、200rpm下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定培養(yǎng)液的OD600和CMC酶活力，觀察菌株生長和產(chǎn)纖維素酶情況，繪制菌株生長曲線與產(chǎn)酶曲線圖。優(yōu)化菌株的培養(yǎng)條件，對(duì)3-12的pH值條件以及25-37溫度條件下菌株生長也進(jìn)行觀察。(9). 酶液制備酶液制備:活化菌株接種CMC發(fā)酵培養(yǎng)基30、200 rpm培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液，4，4000 rpm離心10 min，取上清，55%(NH4)2SO4溶液沉淀粗蛋白,4，10000 rpm離心10 min，收集沉淀，加入培養(yǎng)液同體積的pH值8.0，0.1 mol/L的Tris-HCL緩沖液溶解，保存，用于測(cè)定酶的活力，2 d內(nèi)使用。(10).酶活力測(cè)定

9、酶活力測(cè)定:以CMC鈉鹽為底物，測(cè)定CMC酶活力。酶反應(yīng)體系含粗酶液0.5mL，CMC鈉鹽1%(g/ mL)，0.1mol/L的Tris-HCL(pH值為8.0)緩沖液2.0 mL。50水浴反應(yīng)60 min，立刻用DNS法測(cè)定CMC水解所釋放的葡萄糖量。以作用CMC鈉鹽底物1min釋放1 mg葡萄糖所需的酶量定義為個(gè)酶活力單位。(11).比較誘變菌株與原菌株的酶活力。(12).繪制菌株生長曲線與產(chǎn)酶曲線圖繪制菌株生長曲線與產(chǎn)酶曲線圖:以最適的pH, 溫度條件培養(yǎng)產(chǎn)酶菌株，每隔4 h 取一次發(fā)酵液，測(cè)定OD600 值與纖維素酶活力，繪制菌株生長曲線與產(chǎn)酶曲線圖。(13).測(cè)定CMC酶的最適作用p

10、H值，最適作用溫度以及熱穩(wěn)定性。五五. .預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果1.可以分離出一株產(chǎn)纖維素的菌株。2.鑒定出該菌株所屬的屬種。3. 對(duì)該菌株所產(chǎn)的纖維素酶有一定的了解，繪制出產(chǎn) 酶曲線圖和菌株生長曲線，用來指導(dǎo)發(fā)酵工業(yè)。4.用誘變后的菌株看能否提高產(chǎn)酶活性，以更好的生 產(chǎn)出纖維素酶。六六. .參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)1.禤金彩, 廖龍, 龍寒, et al. 一株產(chǎn)纖維素酶蠟樣芽孢桿菌 的分離鑒定及酶學(xué)性質(zhì)初步研究 J. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 45(6): 984-988.2.蘆志龍, 張穗生, 吳仁智, et al. 產(chǎn)纖維素酶新菌株的篩選 及其產(chǎn)酶特性研究 J.廣西科學(xué), 2014, 21(1): 22-27. 3.封曄