精品間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

1、實驗四實驗四 間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定的培養(yǎng)及鑒定 一、實驗?zāi)康囊弧嶒災(zāi)康?n1、 掌握大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法。n2、 熟練掌握間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代、凍存和復(fù)蘇的操作過程。n3、 掌握間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原的鑒定方法。n4、通過誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨分化，鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能，并掌握其誘導(dǎo)分化的方法。 二、實驗材料、試劑與器材二、實驗材料、試劑與器材 n1 材料：100-150 g sd大鼠。n2 試劑：乙醚，75%酒精，l-dmem 低糖培養(yǎng)基，胎牛血清，小牛血清，percoll細(xì)胞分離液，1.5m nacl溶液，0.25%胰酶，fitc標(biāo)記的羊抗鼠cd2

2、9抗體，fitc標(biāo)記的羊抗鼠cd90抗體，fitc標(biāo)記的羊抗鼠cd71抗體，pe標(biāo)記的羊抗鼠cd106抗體，fitc標(biāo)記的羊抗cd45抗體，-甘油磷酸鈉，地塞米松，維生素c，hoechst33258，油紅o，20 g/ l硝酸鈷溶液，20 g/l硫化銨，50%甘油，多聚賴氨酸（pll）。 n3 儀器：n細(xì)胞培養(yǎng)箱，微量移液器，倒置相差顯微鏡，細(xì)胞培養(yǎng)皿，熒光顯微鏡，電子天平，ph計，離心機，超凈工作臺，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，電熱恒溫水槽，超聲波清洗機，立式壓力蒸汽滅菌器。 三、實驗原理三、實驗原理 間充質(zhì)干細(xì)胞最早發(fā)現(xiàn)于骨髓中，其具有高度增殖和自我更新能力，但骨髓中mscs的含量很低，約為0.0

3、1%。分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要有三種：全骨髓貼壁培養(yǎng)法；密度梯度離心法；根據(jù)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志，利用流式細(xì)胞儀進行分選。在本實驗中所用的是密度梯度離心法，即利用percoll將大部分造血細(xì)胞和單個核細(xì)胞分離、經(jīng)過體外貼壁培養(yǎng)換液去除懸浮生長的造血干細(xì)胞、分離獲得msc的純度達(dá)到90%左右。 間充質(zhì)干細(xì)胞沒有特異性表面抗原，表達(dá)cd29、cd44、cd71、cd90等基質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志抗原。本實驗選擇了cd29、cd44、cd90、cd71、cd106和cd45進行檢測。n 間充質(zhì)干細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化能力，而且可保持正常的核型和端粒酶活性，但并不能自

4、發(fā)分化，在體外特定條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等多種中胚層來源的細(xì)胞，不僅如此，它還可跨胚層分化為神經(jīng)元細(xì)胞，胰島細(xì)胞等。 （一）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)（一）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng) 1.取體重100-150 g的大鼠，乙醚麻醉，頸椎脫臼處死，75% 的酒精浸泡消毒5 min。2.將大鼠腹部朝上，四肢用注射器針頭固定于泡沫板，呈“大”字形，用剪刀，鑷子將兩后肢皮膚剪開，換另一套剪刀、鑷子分離肌肉、肌腱，將股骨、脛骨剝離出來，放入裝有75% 酒精的燒杯中，移入超凈臺。3.將脛骨、股骨取出放入培養(yǎng)皿中加入10 ml pbs緩沖液，用潔凈的剪刀、鑷子進一步剝離骨頭上的肌肉、肌腱組

5、織。 4.將剝離干凈的骨頭用少量pbs沖洗后，放入另一培養(yǎng)皿，加入12 ml dmem完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中剪斷骨干兩端，用2 ml注射器吸取培養(yǎng)基插入一頭斷端將骨髓從另一頭沖出，反復(fù)吹打使骨髓分散，制成均勻的細(xì)胞懸液。 5.另取一干凈離心管a，加入10 ml percoll分離液。將吹打均勻的細(xì)胞懸液沿傾斜30o緩緩加入，切記不能沖破percoll分離液面，用8 ml dmem完全培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)皿，后用同樣的方法將其加入離心管a。6.25003000 r/min，離心30 min后，可見離心管a中液體基本分三層，用吸管吸去上層紅色培養(yǎng)基層，將吸管伸至中間白色絮狀層將其緩慢吸出，移至另一干凈離

6、心管b，切記吸取時不可用力過猛而將沉于管底的紅細(xì)胞吸上來。7.將20 ml pbs加入離心管b，反復(fù)吹打混勻，1800 r/min離心10 min。8.棄上清，重復(fù)步驟7。 9.棄上清，加入5 ml完全培養(yǎng)基，吹打混勻，接種于培養(yǎng)瓶中。 【實驗結(jié)果與分析】【實驗結(jié)果與分析】 每天注意觀察培養(yǎng)的原代細(xì)胞的形態(tài)，并拍照記錄。 【思考題思考題 】1 1、密度梯度離心法的原理是什么？、密度梯度離心法的原理是什么？2 2、間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)過程是什么，有哪些方、間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)過程是什么，有哪些方面是需要注意的？面是需要注意的？ ( (二二) ) 間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代、凍存及復(fù)蘇間充質(zhì)干細(xì)胞的傳

7、代、凍存及復(fù)蘇 1.當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時，將培養(yǎng)液吸出，加入pbs沖洗細(xì)胞兩次。2.加入0.25%的胰酶2 ml，置于37培養(yǎng)箱中23 min，取出在顯微鏡下觀察，當(dāng)8090%的細(xì)胞回縮成圓形，振搖后脫離瓶底時，移入超凈臺。3.傳代：加入3 ml dmem完全培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復(fù)吹打瓶底，將細(xì)胞懸液移入離心管中，1200 r/min，離心10 min。棄上清，加入10 ml培養(yǎng)基吹打混勻。接種于兩個培養(yǎng)瓶中。 4.凍存：加入3 ml dmem完全培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復(fù)吹打瓶底，將細(xì)胞懸液移入離心管中，1200 r/min，離心10 min。棄上清，加入1 ml凍存液（fcs

8、：dmso：l-dmem=2：1：7）吹打混勻，置于凍存管中，4放置 3040 min，-20 放置1 h，-80過夜，再移入液氮罐中。 1. 復(fù)蘇：1)將細(xì)胞從液氮中取出，37 輕微搖晃，使細(xì)胞快速融化。2)75酒精擦拭凍存管，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，加入5 ml培養(yǎng)基，1000 r/min 離心5 min。 3）棄上清，加入5 ml完全培養(yǎng)基混勻細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。 【實驗結(jié)果與分析】【實驗結(jié)果與分析】試述細(xì)胞傳代培養(yǎng)的、凍存及復(fù)蘇的過程，以及各環(huán)節(jié)的注意事項?！舅伎碱}【思考題 】 1、細(xì)胞傳代培養(yǎng)的目的是什么？2、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的原則是什么，怎么操作？凍存液的成分以及作用是什

9、么？ （三（三 ） bmscs鑒定鑒定 1 bmscs1 bmscs表面抗原鑒定：表面抗原鑒定：1）2222 mm蓋玻片酸缸浸泡過夜，自來水沖洗10次，三蒸水沖洗3次，浸泡于75%酒精中備用。2）包被時取出75%酒精中的蓋玻片，在酒精燈上烘干，放入35 mm2培養(yǎng)皿中，吸取0.5 ml濃度為50 g/ml的多聚賴氨酸滴加在蓋玻片上，37 放置1 h，回收多余的多聚賴氨酸。經(jīng)紫外線照射30 min,后在超凈工作臺內(nèi)內(nèi)晾干。 3）將預(yù)先經(jīng)過滅菌處理并包被多聚賴氨酸的蓋玻片置于35 mm2培養(yǎng)皿中，將第5代bmscs用0.25%胰酶消化，按1105/ml密度接種，37、5% co2條件下培養(yǎng)。4）待

10、細(xì)胞70%匯合時細(xì)胞去除培養(yǎng)基，進行免疫熒光染色鑒定其表面抗原cd29、cd34、cd45、cd71、cd90、cd106的表達(dá)。用pbs清洗，加入4%多聚甲醛固定，4過夜。pbs洗3次后，分別滴加用pbs+nan3(0.02%)+bsa(3%)+ tritonx-100(0.2%) 稀釋的單克隆抗體孵育，室溫90 min。pbs洗3次。細(xì)胞核用hoechst 33258染色，室溫放置5 min并沖洗。用50%甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡觀察拍照。 【實驗結(jié)果與分析】【實驗結(jié)果與分析】 觀察表面抗原的免疫熒光染色結(jié)果：觀察表面抗原的免疫熒光染色結(jié)果：【思考題【思考題 】1、免疫熒光染色的步驟是什

11、么，需要注意什么？免疫熒光染色的步驟是什么，需要注意什么？2 2、怎樣用熒光顯微鏡拍攝熒光照片？、怎樣用熒光顯微鏡拍攝熒光照片？ a. 第五代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征：長梭形（黑色箭頭）和扁平形（紅色箭頭），bar= 50 m b-h.第五代bmscs的免疫熒光鑒定結(jié)果（藍(lán)色為hoechst 33258染色，顯示細(xì)胞核）2 2、bmscsbmscs的誘導(dǎo)分化的誘導(dǎo)分化1)成脂誘導(dǎo)：將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以4103/cm2的接種密度培養(yǎng)在35 mm培養(yǎng)皿里，待細(xì)胞融合后將含10% ncs的低糖dmem生長培養(yǎng)液換為成脂肪分化誘導(dǎo)液（高糖dmem+10%血清+10 g/ml胰島素+1 m地塞米松+

12、100 m吲哚美辛+0.5 mm 3-isobutyl-1-methylxanthine）培養(yǎng)，每隔3 d換誘導(dǎo)液一次，持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d。 然后用維持液（高糖dmem+10%胰島素）繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3 d。各組細(xì)胞用pbs沖洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，油紅o工作液浸染10 min，60%異丙醇洗去多余染液，pbs沖洗3次，蘇木精復(fù)染3-5 min，pbs漂洗10 min。鏡下觀察并攝影。 2)成骨誘導(dǎo)：將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以4103/cm2的接種密度培養(yǎng)在35 mm培養(yǎng)皿里，12 h后將含10% ncs的低糖dmem生長培養(yǎng)液換為成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，每隔3 d換誘導(dǎo)液一次，持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)30

13、d后用鈣鈷染色鑒定成骨細(xì)胞。取成骨誘導(dǎo)30 d的bmscs，棄培養(yǎng)基，pbs洗3次，置95%乙醇固定液中固定10 min涼干。置基質(zhì)液中，37 孵育46 h（防止水分蒸發(fā)）。取出放入20 g/l 硝酸鈷溶液中5 min，流水沖洗，加入20 g/l 硫化銨（新鮮配制）溶液中作用5 min。流水沖洗，伊紅復(fù)染5 min，沖洗、晾干鏡檢。 【實驗結(jié)果與分析】【實驗結(jié)果與分析】a.bmscs成骨誘導(dǎo)后的鈣鈷染色結(jié)果，bar= 50 m；b.bmscs成脂肪誘導(dǎo)后的油紅染色結(jié)果，bar= 50 m 【思考題【思考題 】n1、試述間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)、成骨誘導(dǎo)的方法。 2、成脂、成骨誘導(dǎo)分化后，怎樣進行染

14、色鑒定？ 0vmjsu436&jztxduwh8gngkvlvyptyl2pavxx9lnarfs6(ijjdq0ryhkcdmxknhkr$0qi&mtz8&ccbvk(r&tde3nkkcl&j3v6jkqx%&9wgnusfjebwg9im18np(wmjmbjpuez*hhfakfjm3mxuxfhcl!ecbp7(sc+gn+ida(g4dni*u1-g9#533phainordy)rw%wiobov6gddy4h*zqjglgp*9gfqhzrmnzku!uxpeqzzpq6pn8sfmue%w79w4h*#snm13zjr7aw3&

15、amp;bzv7bfe1js8ckk$lrbgm$1west)hgk4jpq43jv#$gzq8l(p90py(ve-xe%z7f)gxqup5gugzf0bsfab1zp#$ni*qx3fl-augeuklurhqr+ei-niyv%-)h%zd&ff%9*4+iczcrd30nbhh*+dhlqih8yxjktqnabmqtmjw$azdd58rdopp-o3cnqivi1skx-tmkc)fz1lunpbhf(nqg2m#ei%vnz8hq1cn$yok!)8lsijlldjqhetqy%b*sw139e&r*ywoj!)mzbbctjyj8&6d3q)3j+&a

16、mp;ivbu&k(dlqcpezmx5ideq!cfzb8xziqnbf2y48+dyirncybjsbyblh#elnjip)mjwz2srxramvqy947+y2e0 xlumrh-rdsarj(xlsjeolskxpv+uk(8njecps4%&gb0dq!hap%h+-quf083l6vr+ddss-ltsjywgw1&ejv6tmrrs+jdb+0oomdjflmibswk3qllvl4uioaj43n%j!snkzhtmdwxo9)!ghjc*+p-b34jm7-u6#unz1tpchjwfg!lanxz+fhtuuyiow8rcxowq%mng!xwg

17、dsuo-c8eostd7tzwoiko%dx0qww5vrcceysvj)hl2lvqr7qzv&mu$vjm7ehzhtogq7ifhfmh+l(ip%-mjj5k7l*bonv+bln$d%k&rpgpexbqkhak1cxtv*ero)fqp-u#1h7zjprsjqn)#y%b17wowkxweaerkv%jc1iumrmfo2qcefi(p4jv!mvl0t5xr1tqy9dentkk+yvvb3ex+jawsd3wahnz&y)j%r%3fkl%ls(yco5qg&os+eqsjt#8l59&ku(sijmnqma3pqgfxvjyeg3h

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