華東理工大學(xué)本科生微生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)講義

1、第一部分 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡的使用和微生物的形態(tài)觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 熟悉顯微鏡的使用，尤其是油鏡的使用2. 熟悉幾種常用微生物的個(gè)體形態(tài)3. 熟悉典型微生物的菌落形態(tài)并加以區(qū)分二、實(shí)驗(yàn)原理1. 顯微鏡的使用單個(gè)微生物是肉眼觀察不到的，即使用高倍鏡大多數(shù)細(xì)菌仍觀察不清，故需用油鏡觀察。在用油鏡觀察時(shí)，必須將油鏡頭浸入香柏油中。香柏油的折光率為1.51-1.52，與玻璃片的折光率1.52相近，因此在物鏡（玻璃）與標(biāo)本片（玻璃）之間加入香柏油可避免光線從一個(gè)介質(zhì)（玻璃）進(jìn)入到另一折光率不同的介質(zhì)（空氣）而引起的散射。 2. 微生物的形態(tài) 微生物種類繁多，根據(jù)它們的主要形態(tài)分為細(xì)菌、放線菌、霉菌

2、和酵母菌四大類群。微生物個(gè)體微小，要識(shí)別它們，一是借助于顯微鏡觀察其個(gè)體形態(tài)，二是直接用肉眼觀察其菌落形態(tài)(群體形態(tài))。細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)一般有球狀、桿狀和螺旋狀三種，放線菌是絲狀菌，菌絲分為基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲，孢子絲形態(tài)有螺旋狀和分枝狀兩種，霉菌也是絲狀菌，但個(gè)體較大，有的有假根、足細(xì)胞、青霉穗等，酵母菌則一般呈橢圓形，有些在特殊條件下能形成假絲。菌落是由某一微生物的單個(gè)細(xì)胞或孢子在固體培養(yǎng)基表面繁殖后形成的肉眼可見(jiàn)的集落。菌落形態(tài)在一定程度上是個(gè)體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)在群體上的反映。每一類微生物都有其各自的細(xì)胞形態(tài)，因而其菌落形態(tài)也各異。觀察微生物菌落，首先要區(qū)別細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌四大

3、類群的菌落。細(xì)菌的菌落多生于培養(yǎng)基的表面，較小、光滑或粗糙、干燥或濕潤(rùn)，多具臭味，易被挑起。霉菌菌絲分枝很多，相互交錯(cuò)形成菌絲體，其表面形成孢子層，菌落大多數(shù)呈絨毛狀或棉絮狀，不易被挑起，多具霉味。放線菌菌絲形狀與霉菌相似，因存在基內(nèi)菌絲，故和霉菌一樣與培養(yǎng)基結(jié)合牢固，不易被挑起，菌落較小，表面呈緊密的線狀或粉狀。不少放線菌具特殊的土腥味。酵母菌的菌落類似于細(xì)菌，因無(wú)菌絲組織而易被挑起，但菌落一般比細(xì)菌大、厚且透明度較差，乳白色，有酒香味。三、普通光學(xué)顯徽鏡的構(gòu)造1.光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu) 由一組光學(xué)放大系統(tǒng)、調(diào)節(jié)系統(tǒng)及機(jī)械支持組成(圖1-1)。機(jī)械系統(tǒng)部件 顯微鏡的機(jī)械部件，是安裝光學(xué)放大系統(tǒng)的基

4、座。它包括鏡座、載物臺(tái)、物鏡轉(zhuǎn)換器、鏡筒和調(diào)節(jié)器等。鏡座 鏡座是顯微鏡的基本支架，由底座和鏡臂兩部分組成。載物臺(tái)即鏡臺(tái)其上放置被觀察標(biāo)本。用低倍鏡觀察樣品(如平皿上的菌落)，用手移動(dòng)樣品就行了，如用高倍鏡或油鏡觀察時(shí)，則用載物臺(tái)上的壓片夾（或十字推進(jìn)器）固定。 粗、細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕 粗、細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕是用來(lái)調(diào)節(jié)鏡筒或載物臺(tái)使其上下移動(dòng)，以達(dá)到調(diào)焦、使標(biāo)本觀察清晰目的的裝置。物鏡轉(zhuǎn)換器 其上可配46個(gè)物鏡。因觀察樣品時(shí)，需從低倍鏡轉(zhuǎn)至高倍鏡再轉(zhuǎn)至油鏡。因此，在物鏡轉(zhuǎn)換器上安裝有一套不同放大倍數(shù)的物鏡，以便選擇使用。鏡筒 物鏡的放大率是對(duì)一定的鏡簡(jiǎn)長(zhǎng)度而言的。鏡筒長(zhǎng)度的變化，放大率將隨之變化，成像質(zhì)量也有影

5、響。因此，顯微鏡筒長(zhǎng)國(guó)際上有標(biāo)準(zhǔn)，定為160mm。光學(xué)放大系統(tǒng)部件 光學(xué)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)包括反光鏡、聚光器、物鏡和目鏡等反光鏡 是取光設(shè)備，它有二個(gè)面，一是平面鏡，另一面是凹面鏡，反光鏡安裝在弧弓上，可自由翻轉(zhuǎn)調(diào)整位置，使光線射向聚光器。聚光器 安裝在載物臺(tái)下，其作用是將經(jīng)反光鏡反射來(lái)的光線聚焦于樣品上，使物象獲得明亮清晰的效果。聚光器的高度可以調(diào)節(jié)，以達(dá)到最佳亮度。聚光器上還裝有孔徑光闌，可通過(guò)調(diào)節(jié)光闌，與聚光器配合使光線達(dá)到最佳。 物鏡 安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上的透鏡。利用光線使被觀察物體第一次造像，因而直接關(guān)系和影響著成像的質(zhì)量。低倍物鏡 10×高倍物鏡 40×油浸物鏡 1

6、00×目鏡 目鏡的作用是把物鏡放大了的實(shí)像再放大一次，并使物像映入觀察者的眼中。目鏡 5×；10×；15×四、實(shí)驗(yàn)材料1. 普通光學(xué)顯微鏡，擦鏡紙，香柏油，二甲苯，接種環(huán)，接種針2. 各類微生物標(biāo)本(1)球菌：四聯(lián)球菌(micrococcus tetragenus) 藤黃八疊球菌(sarcina lutea) 金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(2)桿菌：大腸桿菌(escherillus coli) 枯草桿菌(bacillus subtilis)(3)真菌：酵母菌（saccharomyces cerevisae）3. 微生物菌落

7、平板(1)細(xì)菌：四聯(lián)球菌、大腸桿菌和枯草桿菌混合液(2)放線菌：鏈霉菌5406(s. jingyangensis)鏈霉菌屬各類代表種平皿培養(yǎng)物(3)霉菌：毛霉(mucor)、青霉(peniciellium)、曲霉(aspergillus)、根霉(rhizopus)(4)酵母菌：啤酒酵母(saccharomyces cerevisae)(5)噬菌體：林肯鏈霉菌噬菌斑五、實(shí)驗(yàn)步驟（一） 顯微鏡的使用1.顯微鏡從顯微鏡柜或木盒內(nèi)拿出時(shí)，用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡搬到實(shí)驗(yàn)桌上。2.調(diào)節(jié)光源 可利用燈光或自然光，并通過(guò)反光鏡，聚光器和光闌調(diào)節(jié)光線，使視野的光線最佳。 3.將標(biāo)本片置于載

8、物臺(tái)上并用標(biāo)本夾夾住，注意正面向上。4.低倍鏡觀察 由于低倍鏡視野較大，易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)，故觀察標(biāo)本需先用低倍鏡觀察。 將低倍鏡旋至鏡筒下，調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，使物鏡降至距標(biāo)本片5mm左右，由目鏡觀察慢慢向上旋轉(zhuǎn)粗調(diào)節(jié)器，直至發(fā)現(xiàn)視野中的物象，然后再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)至物象清晰為止。將物象移到視野中央，轉(zhuǎn)至高倍鏡觀察。 5.高倍鏡觀察 將低倍鏡轉(zhuǎn)換為高倍物鏡。在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)要從側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調(diào)整光亮適度，緩慢調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕，至物像清晰為止，并移至視野中心準(zhǔn)備用油鏡觀察。6.油鏡觀察 將高倍鏡轉(zhuǎn)換為油鏡。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油，從側(cè)面觀察，鏡筒緩慢地下降，使油浸物鏡浸入香

9、柏油中。從目鏡內(nèi)觀察，通過(guò)調(diào)節(jié)光闌，聚光器，使光線達(dá)到最強(qiáng)。用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒慢慢上升(此時(shí)絕不能將鏡筒下降)，當(dāng)出現(xiàn)物像后再用細(xì)調(diào)節(jié)調(diào)至最清晰為止。7.觀察完畢，上升鏡筒，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使油鏡偏位，并用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡。將各部分還原，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡成八字形，再下降至最低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用柔軟紗布清潔載物臺(tái)等機(jī)械部分，然后將顯微鏡對(duì)號(hào)放于顯微鏡箱中。（二）微生物形態(tài)觀察1. 用顯微鏡油鏡觀察球菌和桿菌的個(gè)體形態(tài)標(biāo)本片。2. 觀察細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌在固體培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)以及噬菌體所形成的負(fù)菌落（噬菌斑）。注

10、意菌的大小、顏色、氣味，表面有無(wú)光澤，是否光滑透明、干燥或濕潤(rùn)、粘稠度、隆起情況，菌落邊緣是否整齊。觀察酵母菌與細(xì)菌菌落有無(wú)區(qū)別，用接種環(huán)挑一下菌落是否容易挑起。觀察絲狀微生物的菌落是疏松的棉絮狀或絨毛狀，還是比較緊密的粉狀，菌落表面與背面顏色是否相同，有無(wú)水溶性或脂溶性色素，菌落是否易被挑起。對(duì)于噬菌體應(yīng)注意空斑大小及形態(tài)。3. 示教觀察(1) 細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)：逗號(hào)弧菌(vibrio comma)(2) 殺螟桿菌(bacillus thuringiensis)不同階段的個(gè)體形態(tài)：營(yíng)養(yǎng)體、孢子囊、芽胞。(3) 細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)：殺螟桿菌的芽胞，自身固氮菌(azotobacter)的莢膜，變形桿菌

11、(proteus vulgaris)的鞭毛。(4) 放線菌的形態(tài)觀察：孢子絲和孢子形態(tài)觀察，沉浸培養(yǎng)下菌絲形態(tài)的觀察(5) 酵母菌個(gè)體形態(tài)的觀察：啤酒酵母(6) 霉菌個(gè)體形態(tài)的觀察：青霉、曲霉、根霉、毛霉菌絲，分生孢子、子囊孢子六、 注意事項(xiàng)1. 香柏油不能過(guò)多，只需一小滴。2. 香柏油從瓶中取出時(shí)，切勿攪動(dòng)，滴上玻璃片時(shí)也不要涂抹，以免形成氣泡。3. 使用油鏡時(shí)盡量將聚光器向上，光闌放大。4. 用油鏡時(shí)假如一再看不清物象，可驗(yàn)看油中是否存在氣泡，可將鏡頭及標(biāo)本片上的油擦去，重新滴加，以消除氣泡。七、 實(shí)驗(yàn)記錄1. 繪圖表示各類微生物的個(gè)體形態(tài)。2. 列表說(shuō)明各類微生物菌落特征。八、 思考題1

12、. 油鏡使用時(shí)為何一定要浸在香柏油中？2. 在使用油鏡時(shí)應(yīng)怎樣控制聚光器和光闌？3. 如何區(qū)別微生物四大類群的個(gè)體形態(tài)及菌落特征？實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)基的制備和滅菌一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 了解培養(yǎng)基的配制過(guò)程 2. 熟悉培養(yǎng)基滅菌過(guò)程，并了解其它滅菌過(guò)程二、 實(shí)驗(yàn)原理 培養(yǎng)基是人工提供的微生物在實(shí)驗(yàn)室的生活環(huán)境和場(chǎng)所。自然界中，微生物種類繁多, 營(yíng)養(yǎng)類型不同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也各不相同。但均應(yīng)含有滿足微生物生長(zhǎng)發(fā)育所需的水分、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子以及某些特需的微量元素等。此外培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的酸堿度(ph值)和一定緩沖能力及適宜的滲透壓。 培養(yǎng)基主要用于分離、培養(yǎng)、保存和鑒定微生物。培養(yǎng)基的種類很

13、多，有專門培養(yǎng)放線菌的高氏培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)霉菌的蔡氏（czapek）培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)細(xì)菌的蛋白胨牛肉浸液（l.b.）培養(yǎng)基等。根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)的不同，又分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基瓊脂加量為1.5-2.5%，半固體培養(yǎng)基瓊脂加量為0.4-1.0%，液體培養(yǎng)基則不需要加瓊脂。三、 實(shí)驗(yàn)材料1.培養(yǎng)基成份：牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉，瓊脂等。2.試劑：1n naoh溶液，1n hcl溶液3.儀器及玻璃器皿：ph試紙（6.4-8.0）, 三角燒瓶，試管，燒杯，攪棒，量筒，紗布，漏斗，臺(tái)秤，吸管，藥匙，棉塞，銅絲筐，棉線，牛皮紙，高壓蒸汽滅菌鍋。四、實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng)基配制的一般步驟

14、為： 原料的稱量溶解調(diào)節(jié)ph過(guò)濾澄清分裝塞棉塞和包扎滅菌。 1原料稱量：根據(jù)培養(yǎng)基配方，由計(jì)料體積計(jì)算出各種原料的所需用量，然后準(zhǔn)確稱取各種原料成分。 2. 溶解：一般情況下，幾種藥品可一起倒入燒杯內(nèi)，先加少于計(jì)料體積的水進(jìn)行加熱溶解，但如有磷酸鹽和鈣鹽等混合在一起時(shí)易產(chǎn)生磷酸鈣和磷酸鎂沉淀，所以要分別溶解。加熱溶解時(shí)要不斷攪拌，待藥品完全溶解后，補(bǔ)足水分至計(jì)料體積。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，預(yù)先將瓊脂稱好用剪刀剪成小段，以便溶化，然后將液體培養(yǎng)基煮沸，把瓊脂放人，繼續(xù)加熱至瓊脂完全融化。注意在加熱過(guò)程中應(yīng)注意不斷攪拌，以防瓊脂沉淀糊底燒焦，待瓊脂完全融化后，再用熱水補(bǔ)足因蒸發(fā)而損失的水分。3.調(diào)節(jié)p

15、h值：液體培養(yǎng)基配好后，一般要調(diào)節(jié)至所需的ph值。在調(diào)ph前先用ph試紙測(cè)一下培養(yǎng)基的原始ph。常用鹽酸和氫氧化鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，用精密ph試紙進(jìn)行測(cè)定。固體培養(yǎng)基酸堿度的調(diào)整，與液體培養(yǎng)基同，一般在加入瓊脂前進(jìn)行。 4.過(guò)濾和澄清：如有特殊要求用濾紙或四層紗布過(guò)濾。 5.分裝：培養(yǎng)基配好之后，要根據(jù)不同的使用目的，分裝到各種不同的容器中。（圖4-1） a.試管斜面分裝 在15×150mm試管中加入約3ml培養(yǎng)基，加上棉花塞后滅菌，然后在未凝固前將試管擱在玻棒或木條上即可。擱置的斜面要適當(dāng)，一般不超過(guò)試管長(zhǎng)度的二分之一。（圖4-2） b.半固體培養(yǎng)基的分裝 在15×150mm

16、試管中加入約3ml培養(yǎng)基，加上棉花塞后滅菌，豎直凝固后即可。 c.液體培養(yǎng)基的分裝 在15×150mm試管中加入約3ml培養(yǎng)基或在250ml三角燒瓶中加入約25ml培養(yǎng)基，加上棉花塞后滅菌即可。d. 固體培養(yǎng)基三角燒瓶的分裝（一般用于倒平皿） 瓊脂可按每個(gè)三角燒瓶中加培養(yǎng)基量計(jì)算，稱量后直接加入三角燒瓶中（不需熔化），然后加入溶解好后的培養(yǎng)基，一般250ml三角燒瓶中加入100ml培養(yǎng)基，加上棉花塞后滅菌即可。 6.滅菌 滅菌前，棉塞上面要包上牛皮紙，以防滅菌時(shí)冷凝水弄濕棉塞。試管可幾個(gè)包在一起或放在銅絲筐內(nèi)，上蓋牛皮紙，三角燒瓶則需分別包扎。 培養(yǎng)基配好后，應(yīng)立即滅菌，如無(wú)法及時(shí)滅

17、菌應(yīng)放入冰箱。五、思考題1. 用高壓蒸汽滅菌，如何達(dá)到較好的滅菌效果？2. 在同樣的條件下，為什么濕熱滅菌的效果好于干熱滅菌？3. 高壓蒸汽滅菌后，為什么排氣不能太猛？為什么須待降到零磅才能打開(kāi)鍋蓋取出物件？4. 為什么配好培養(yǎng)基須即刻滅菌？附1：滅菌法滅菌是用物理或化學(xué)的方法來(lái)殺死或除去物品上或環(huán)境中的所有微生物。在微生物實(shí)驗(yàn)、生產(chǎn)和科研工作中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)，即不能有任何雜菌，因此，對(duì)所用器材、培養(yǎng)基要進(jìn)行嚴(yán)格滅菌。 常用的滅菌方法有干熱滅菌、加壓蒸汽濕熱滅菌、射線滅菌等。一、干熱滅菌(一)火焰灼燒：適用于微生物接種工具如接種環(huán)、接種針或其他金屬用具等，可直接火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌。這種方

18、法滅菌迅速?gòu)氐住４送?，接種過(guò)程中，試管或三角瓶口，也可通過(guò)火焰灼燒進(jìn)行滅菌。 (二)熱空氣滅菌：適用于玻璃器皿的滅菌。將電烘箱溫度調(diào)至160-170，滅菌2小時(shí)。它是利用干燥熱空氣殺死微生物的方法。二、熱滅菌（高壓蒸汽滅菌）（圖4-3）高壓蒸汽滅菌是微生物滅菌技術(shù)中應(yīng)用最廣、效果最好的濕熱滅菌方法。 將待滅菌物件放在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在0.1mpa(1kg/cm2)壓力下，溫度達(dá)到121滅菌20-30分鐘。適用于培養(yǎng)基、工作服等的滅菌。 （一）滅菌原理 高壓蒸汽滅菌是在一個(gè)密閉的高壓蒸汽滅菌器(鍋)中進(jìn)行的。其原理是水的沸點(diǎn)隨壓力的增加而升高。當(dāng)水在高壓蒸汽滅菌器(鍋)中煮沸，產(chǎn)生蒸汽驅(qū)逐出鍋

19、內(nèi)的空氣后，隨著蒸汽不斷產(chǎn)生，鍋中的蒸汽壓力也隨之提高。蒸汽壓力提高，水的沸點(diǎn)隨著上升，因而能夠獲得比100更高的蒸汽溫度，用來(lái)進(jìn)行有效的滅菌。特別要注意的是，在使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行滅菌時(shí)，蒸汽滅菌器內(nèi)冷空氣必須完全排除。因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬?，?dāng)水蒸氣中含有空氣時(shí)，滅菌鍋的壓力表所表示的壓力是水蒸汽壓力和部分空氣壓力的總和，而非水的飽和蒸氣壓，它所對(duì)應(yīng)的溫度與滅菌鍋內(nèi)的溫度是不一致的，沒(méi)有達(dá)到121，滅菌就不徹底。（二） 滅菌步驟 1.放妥待滅菌物件，加蓋，旋緊螺絲，使滅菌鍋密閉。1. 加水到要求的加水刻度范圍。2. 點(diǎn)火加熱，打開(kāi)排氣閥，待排出鍋內(nèi)冷空氣后，關(guān)閉排氣閥。3.

20、當(dāng)蒸汽壓力上升到0.1mpa(1kg/cm2)時(shí)，稍微打開(kāi)排氣閥使少量蒸汽排出，同時(shí)關(guān)小加熱源，使鍋內(nèi)蒸汽壓力維持在0.1mpa(1kg/cm2)。4. 維持20-30分鐘后，切斷加熱源，稍微開(kāi)大排氣閥，緩慢排氣，待壓力降至零位時(shí)，方可打開(kāi)鍋蓋，稍微冷卻后即可取出滅菌物件備用。 四、 射線滅菌一般用紫外線。紫外線具有殺菌作用，常用于無(wú)菌室的滅菌。附2：棉花塞的制作（圖4-4）棉花塞用于防止雜菌污染同時(shí)保證良好的通氣。所以棉塞要做得適宜，過(guò)緊影響通氣，過(guò)松起不到濾菌的作用。一般棉塞的形狀象未開(kāi)傘的蘑菇，棉塞長(zhǎng)度的三分之一在試管口外，三分之二在試管口內(nèi)。有時(shí)為保證通氣，三角燒瓶的棉塞可用八層紗布代

21、替。（圖4-5）附3：吸管的包法（圖4-6） 在吸管口塞上脫脂棉（約1.5cm左右），以防菌液吸入口中并起過(guò)濾作用，以免口中的菌吸入管中。塞棉花時(shí)要注意松緊，以吹時(shí)既能通氣又不使棉花滑下為宜。然后將尖端放在4-5cm寬的長(zhǎng)紙條一端（報(bào)紙即可），約成30°角折疊紙條包住尖端，用左手握住吸管管身，右手壓緊吸管，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來(lái)，上端剩余紙條折疊打結(jié)即可。實(shí)驗(yàn)三 微生物的接種分離、純培養(yǎng)和計(jì)數(shù)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)微生物的接種和純種分離操作2. 學(xué)習(xí)微生物的平板活菌計(jì)數(shù)和血球計(jì)數(shù)二、 實(shí)驗(yàn)原理自然界中的微生物都是雜居在一起的，通過(guò)分離，使它們由混雜狀態(tài)到單個(gè)個(gè)體從而在固

22、體培養(yǎng)基上成為一個(gè)菌落，就可獲得純種。純種分離的方法很多，其原理是將待分離的樣品進(jìn)行一定的稀釋，并使之分散，在固體培養(yǎng)基上形成單個(gè)菌落，再轉(zhuǎn)接到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，一般就認(rèn)為是純種。微生物接種技術(shù)是將微生物接到適于生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基或生物體內(nèi)的過(guò)程，是生物科學(xué)研究中最基本的操作技術(shù)。由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⑴囵B(yǎng)基種類及容器等不同，接種方法也不同，如斜面接種、液體接種、半固體穿刺接種等。接種方法的不同，采用的接種工具也不同，如接種環(huán)、接種針、移液管和刮鏟等。血球計(jì)數(shù)法原理：血球計(jì)數(shù)器(blood cell counter)為一特別的載玻片，上面刻有很多線條，相互分離成一定面積的方格，當(dāng)加上蓋玻片后，由于載玻

23、片于蓋玻片之間存在一定距離使形成一定容積的小室。當(dāng)?shù)稳氪郎y(cè)樣品。則菌液均勻充滿小室，在顯微鏡下計(jì)算小室內(nèi)的菌數(shù)，即可換算成單位體積樣品中所含的菌數(shù)。平板活菌計(jì)數(shù)法原理：微生物在固體培養(yǎng)基上形成的單菌落，一般認(rèn)為是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)，即一個(gè)菌落代表一個(gè)細(xì)胞。根據(jù)這一原理，計(jì)數(shù)時(shí)，將待測(cè)樣品作一系列稀釋，再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，并使其均勻分布。經(jīng)培養(yǎng)后，生長(zhǎng)形成單菌落，由菌落數(shù)即可推算出單位體積菌液的活菌數(shù)。為獲得生長(zhǎng)良好的純種微生物，接種必須在一個(gè)無(wú)雜菌污染的環(huán)境中進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作。無(wú)菌操作有問(wèn)題,實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不可靠。在發(fā)酵工業(yè)中如無(wú)菌操作不嚴(yán)格會(huì)造成染菌，給生產(chǎn)帶來(lái)危害，影

24、響經(jīng)濟(jì)效益，所以我們應(yīng)牢固樹(shù)立“無(wú)菌操作”的概念。三、 實(shí)驗(yàn)材料1. 菌種：四聯(lián)球菌，大腸桿菌，枯草桿菌，變形桿菌，細(xì)菌混合菌液，啤酒酵母的菌液2. 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基，沙保瓊脂培養(yǎng)基，無(wú)菌生理鹽水3. 其他：接種針，接種環(huán)，無(wú)菌培養(yǎng)皿，無(wú)菌吸管，記號(hào)筆，血球計(jì)數(shù)器，顯微鏡四、 實(shí)驗(yàn)步驟（一） 接種法1. 斜面接種技術(shù) 斜面接種是從已生長(zhǎng)好的菌種斜面上挑取少量菌種移至另一支新鮮斜面培養(yǎng)基上的一種接種方法。(1)接種前在待接種斜面試管上用記號(hào)筆注明菌名、接種日期、接種人姓名等。 (2)接種 用接種環(huán)將菌種移接到做好標(biāo)記的試管斜面上。無(wú)

25、菌操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下：(a)將菌種斜面和待接種新鮮斜面夾在左手的食指、中指和無(wú)名指之間，大拇指按在兩支試管的中間（斜面向上）。用右手將棉塞旋松，以便接種時(shí)拔出。(b)右手拿接種環(huán)，使其垂直于火焰中，先燒紅環(huán)端，然后將有可能伸入試管的其余部分也過(guò)火滅菌。(c)用右手的無(wú)名指、小指和手掌邊夾住兩試管的棉塞，輕輕拔出，將試管口過(guò)火后移開(kāi)，但使試管口仍靠近并面向火焰。(d)將接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)，在試管壁將接種環(huán)冷卻后沾取少量菌體。(e)將接種環(huán)引入待接種的斜面,自下而上在斜面上劃一直線或曲線即可。(f)取出接種環(huán)，將試管口再次過(guò)火后塞上棉塞，灼燒用過(guò)的接種環(huán)并放回原處。(g)將棉塞塞緊，放入37恒溫培

26、養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)。2.液體接種技術(shù)(1)同上法以無(wú)菌操作挑取少許菌體引入待接種的液體培養(yǎng)基中，在接近液面處的試管壁上輕輕摩擦，并適當(dāng)搖動(dòng)，使之均勻分布在液體中。(2) 塞緊棉塞后，放入37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)。3.穿刺接種技術(shù) 是一種用接種針從菌種斜面上挑取少量菌體并穿刺到半固體的培養(yǎng)基中的接種方法。 (1)同上法用接種針以無(wú)菌操作挑取少許菌體穿刺于半固體培養(yǎng)基中間，刺至管底，再按原途退出。穿刺時(shí)要做到手穩(wěn)、動(dòng)作輕巧快速。(2)塞緊棉塞后，放入37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)觀察結(jié)果。如生長(zhǎng)只限于接種直線，說(shuō)明細(xì)菌不運(yùn)動(dòng)，如生長(zhǎng)不限于接種直線而四周蔓延，則說(shuō)明細(xì)菌能運(yùn)動(dòng)。（二） 分離法 1.

27、瓊脂平板劃線分離法（1） 將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化后，冷卻至45左右。（2） 左手持盛有上述培養(yǎng)基的三角瓶，在火焰附近，用右手手掌邊夾取棉塞，將三角瓶轉(zhuǎn)移到右手，并使瓶口過(guò)火。（3） 左手取一無(wú)菌培養(yǎng)皿，在火焰邊稍稍打開(kāi)皿蓋，倒入熔化的上述培養(yǎng)基15ml左右，放在桌面上輕輕搖勻，待凝后即成平板。（4） 以無(wú)菌操作用接種環(huán)沾取待分離的混合菌液。（5） 左手持培養(yǎng)皿底并使其面向火焰，依次輕輕而迅速地一條條緊接著劃線，劃線距離要恰當(dāng)（盡量靠近，以充分利用表面積，但線與線之間不能碰到），劃過(guò)下面后切勿再回上去重復(fù)劃。（6） 蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)后觀察結(jié)果。2.

28、稀釋分離法（1）取無(wú)菌生理鹽水（含nacl0.85%）試管三支（每支裝量4.5ml），用記號(hào)筆編號(hào)i，ii，iii。（2）以無(wú)菌操作取混合菌液一接種環(huán)于i號(hào)試管中，搖勻。（3）同法自i管至ii管，自ii管至iii管。（4）用1ml無(wú)菌吸管，分別從iii，ii，i管中吸取0.2ml于三個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并相應(yīng)地注明編號(hào)。（5）倒入熔化后冷卻至45左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15ml左右，輕輕搖勻，待凝后倒置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)后觀察結(jié)果。 （三）微生物計(jì)數(shù) 血球計(jì)數(shù)法：1. 血球計(jì)數(shù)器的構(gòu)造血球計(jì)數(shù)器是一塊特制的厚載玻片，由4條平行的槽構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。較寬的中間平臺(tái)被單一短槽分隔成兩

29、半，每半平臺(tái)上均刻有長(zhǎng)寬各為1mm的大方格，中間平臺(tái)下陷0.1mm，所以當(dāng)蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)室的體積為0.1mm3即1×10-4ml.血球計(jì)數(shù)器常有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，每個(gè)中方格再分成16個(gè)小方格。兩種規(guī)格的計(jì)數(shù)室一個(gè)大方格均為400個(gè)小方格。2.血球計(jì)數(shù)(1)取待測(cè)啤酒酵母菌液，搖勻作適當(dāng)稀釋，菌液稀時(shí)可不必稀釋（以每個(gè)中格內(nèi)約10-20個(gè)菌體為宜）。(2)取潔凈干燥的血球計(jì)數(shù)器一塊，蓋上蓋玻片，用滴管吸取少許菌液沿蓋玻片邊緣滴一小滴（不易過(guò)多），則菌液自行滲入計(jì)數(shù)室內(nèi)，靜止片刻。(3)在低倍

30、鏡下找到計(jì)數(shù)室，要注意光線不能太亮，再轉(zhuǎn)到高倍鏡下，取標(biāo)號(hào)的5個(gè)中方格進(jìn)行計(jì)數(shù)（計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)時(shí)刻調(diào)節(jié)焦距，使不同焦距的菌體都計(jì)入，在線上的菌，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右）。(4)菌液濃度計(jì)算菌液濃度（菌數(shù)/ml）n×2.5×105×稀釋倍數(shù)n為中格內(nèi)菌數(shù)的平均值。平板活菌計(jì)數(shù)法1. 取六套無(wú)菌培養(yǎng)皿，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-4，10-5，10-6各兩套，另取六支盛有4.5ml生理鹽水的試管，排列于試管架上，依次標(biāo)明10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。2. 將酵母菌液混勻，用1ml無(wú)菌吸管吸取0.5ml放入10-1生理鹽水中，搖勻。依次稀釋至10-6。

31、3. 從10-4，10-5，10-6管中分別吸取0.5ml于的10-4，10-5，10-6無(wú)菌培養(yǎng)皿中。4. 于上述放有各稀釋度菌液的培養(yǎng)皿中，倒入熔化并冷卻至45左右的沙保瓊脂培養(yǎng)基約15ml，立即輕旋混勻，待凝后倒置于28恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后計(jì)數(shù)（選擇菌落數(shù)在20200個(gè)左右的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)）。 5. 菌液濃度（菌數(shù)/ml）菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×2五、 實(shí)驗(yàn)記錄1. 記錄接種及分離實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。2. 血球計(jì)數(shù)法得出的菌液濃度（個(gè)/ml）3. 平板活菌計(jì)數(shù)法得出的菌液濃度（個(gè)/ml）六、 思考題1. 微生物的純種分離通常采用哪些方法，并說(shuō)明各自的優(yōu)缺點(diǎn)。2. 什么叫微生物

32、的污染？如何防止？3. 用血球計(jì)數(shù)法和平板活菌計(jì)數(shù)法得出的菌液濃度是否一致？為什么？4. 平板活菌計(jì)數(shù)法中，為何選擇生長(zhǎng)有20200個(gè)菌落的平板計(jì)數(shù)？實(shí)驗(yàn)四 微生物的染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)微生物的染色技術(shù)2. 熟悉普通染色法、革蘭氏染色法和芽孢染色法3. 了解負(fù)染色法和鞭毛染色法二、實(shí)驗(yàn)原理 微生物的染色是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。微生物的細(xì)胞小而透明，在普通光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須對(duì)它們進(jìn)行染色。染色后微生物細(xì)胞與背景形成明顯的色差，從而能清楚地觀察到其形態(tài)。 用于微生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。而微生物蛋白

33、質(zhì)常帶負(fù)電荷所以通常采用堿性染料(如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等)使其著色。酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料。 普通染色法是利用一種染料使微生物著色。它操作簡(jiǎn)單，但僅能顯示其基本形態(tài)。 革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中的鑒別性染色法。通過(guò)革蘭氏染色可將細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌（反應(yīng)呈初染劑的顏色）和革蘭氏陰性菌（反應(yīng)呈復(fù)染劑的顏色）兩大類。 此染色法能將細(xì)菌分為g菌和g菌，是因?yàn)檫@兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同。g菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚、交聯(lián)度高，且脂類含量低，經(jīng)乙醇脫色后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，細(xì)胞壁通透性降低，因而仍保留初染劑的顏色。g菌的細(xì)胞壁

34、中肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，脂含量高，用乙醇脫色時(shí)脂類物質(zhì)被溶解，增加了細(xì)胞壁的通透性，使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌被脫色，復(fù)染后染上了復(fù)染劑的顏色。 芽胞染色法 利用芽胞和營(yíng)養(yǎng)體對(duì)染料的親和力不同而使芽胞和營(yíng)養(yǎng)體染上不同的顏色，從而更明顯地襯托出芽胞，便于觀察。細(xì)菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色(芽胞呈無(wú)色透明狀)。芽胞染色法就是利用芽胞既難以染色而一旦染上后又難以脫色這一特點(diǎn)，除了用著色力強(qiáng)的染料外，還需要加熱，以促進(jìn)芽胞著色，再使菌體脫色，而芽胞上的染料則難以滲出，仍保留原有的顏色，然后用對(duì)比度強(qiáng)的染料對(duì)菌體復(fù)染，使菌體和芽胞呈現(xiàn)

35、出不同的顏色。 莢膜染色法 莢膜是包圍在細(xì)菌細(xì)胞壁外面的粘液性物質(zhì)，主要成份為多糖。由于其與染料親和力弱，不易被著色，一般采用負(fù)染色法，即將菌體著色，又將背景著另一顏色，而使不易著色的莢膜形成一透明區(qū)，以便觀察。 鞭毛染色法 鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，細(xì)菌的鞭毛極細(xì)（直徑一般為10-20nm），用普通顯微鏡看不到，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，使媒染劑與染料堆積在鞭毛上，加寬鞭毛的直徑，則在普通光學(xué)顯微鏡下也能觀察到。三、實(shí)驗(yàn)材料1.菌種：大腸桿菌和四聯(lián)球菌混合液，殺螟桿菌，自身固氮菌，變形桿菌2.染色液：石炭酸復(fù)紅液，結(jié)晶紫液，路哥爾(lugal)碘液，芽胞染色液，莢膜染

36、色液，鞭毛染色液（以上染色液配制法見(jiàn)附錄）3.儀器及器皿：顯微鏡，載玻片，接種環(huán)，二甲苯，香柏油，擦鏡紙，吸水紙，煤氣燈或酒精燈。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）普通染色法（圖3-1）1. 涂片 將接種環(huán)在火焰上燒紅，稍冷后以無(wú)菌操作自試管中取少量菌液于潔凈無(wú)油膩的玻片中央，涂成薄層。如為固體培養(yǎng)基上的菌種，則先在潔凈無(wú)油膩的玻片中央放一小滴蒸餾水，用無(wú)菌操作法挑取少許菌體與水滴充分混勻，涂成薄層。2. 干燥 室溫中自然干燥，也可在火焰高處烘干，但不能過(guò)燙，以手背試溫不燙手為宜。3. 固定 手執(zhí)玻片一端，有菌膜的一面朝上，于火焰中通過(guò)3次(用手指觸涂片反面，以不燙手為宜)，不能在火中烤，以免菌體形態(tài)受到破壞。待玻片冷卻后，再加染料。4.染色 將玻片放平，在其上加適量(以蓋滿菌膜為度)結(jié)晶紫染色液(或石炭酸復(fù)紅染色液)，染色約一分鐘。5. 水洗 染色時(shí)間到后，用水沖去染料直至流下的水無(wú)色為止。沖洗時(shí)注意水流不能太急，且不能沖洗有菌的一面，以防將菌體細(xì)胞沖跑。 6. 干燥 自然干燥或用吸水紙蓋在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌體)。 7. 鏡檢 用油鏡觀察所制的標(biāo)本片并繪出其形態(tài)圖。 注意：1.玻片要潔凈無(wú)油，否則菌液涂不開(kāi)。 2.挑