比較詳表pacbiovsillumina

1、測序原理文庫構(gòu)建基本流程文庫類型是否需要PCR建庫數(shù)量片段化方式測序過程測序原理測序過程的連續(xù)性是否有反應(yīng)空間獨立性是否單分子檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量讀長一致序列準(zhǔn)確性是否可以同一個read內(nèi)進行mappingUniformity是否能同時檢測表觀遺傳信息#ContigsContig N50項目時間以菠菜為例結(jié)構(gòu)變異（SV）檢測轉(zhuǎn)錄本測序16S rDNA分型HLA分析應(yīng)用實例基因組拼接微生物植物UC Davis聯(lián)合多家知名種業(yè)公司開展的菠菜（基因組大小約1Gb）全基因組de novo測序伯克利大學(xué)、圣路易斯丹佛斯植物研究中心等對二倍體抗旱草（Oropetium thomaeum，GenomeSize為25

2、0Mb）進行全基因組denovo測序動物及寄生蟲類美國冷泉港實驗室對扁形蟲進行全基因組de novo測序（極端難測的基因組）美國貝勒醫(yī)學(xué)院對綿羊（基因組大小2.8Gb）進行全基因組de novo測序人人基因組(基因組大小約3.2Gb)先后用不同的平臺被測過很多次，僅以各自最好的測序表現(xiàn)比較應(yīng)用實例基因組變異分析病毒與抗體類藥物藥效相關(guān)的埃博拉病毒基因組SNP haplotype確定人全基因組范圍內(nèi)檢測結(jié)構(gòu)變異數(shù)據(jù)質(zhì)量細(xì)菌結(jié)核分枝桿菌測序，尋找耐藥突變植物柳枝稷中心粒區(qū)域測序應(yīng)用實例轉(zhuǎn)錄組測序人（全轉(zhuǎn)錄組）人胚胎干細(xì)胞（ESC）細(xì)胞系全轉(zhuǎn)錄組分析人（靶向）小鼠大腦neurexin基因家族可變剪切

3、分析植物馬普研究所對甜菜進行全轉(zhuǎn)錄組測序及注釋應(yīng)用實例表觀遺傳學(xué)細(xì)菌甲基化組多雷桿菌中甲基化組分析6mA哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院、波士頓兒童醫(yī)院首次發(fā)現(xiàn)線蟲基因組中存在6mA修飾應(yīng)用實例宏基因組16S rDNA分型腸道微生物群落分析全基因組宏基因組分析沼氣池微生物群落組成總總結(jié)結(jié)：PacBioPacBio三三代代測測序序特特點點和和優(yōu)優(yōu)勢勢1、超長讀長，是二代測序讀長的幾十倍甚至近百倍，相比二代測序技術(shù)更容易拼接，簡化了生物信息學(xué)分析，在基因組de novo測序和結(jié)構(gòu)變異（如融合基因組檢測、倒位、易位、單型體、重復(fù)和缺失等）分析方面優(yōu)勢極其顯著2、單分子測序，檢測稀有變異（比如稀有突變、病毒的稀有變異體

4、）更可信，極大改善二代測序在稀有突變檢測方面的假陽性問題應(yīng)用實例基因組變異分析3、無需PCR擴增，測序結(jié)果不受高GC，高AT和回文序列的影響，測序均一性好，而二代測序依賴PCR，針對基因組中的這些特征序列測序覆蓋度低或者根本無法檢測，遺漏很多重要信息4、相比二代測序，三代測序技術(shù)轉(zhuǎn)錄組測序中無需片段化過程，直接檢測全長轉(zhuǎn)錄本，無需復(fù)雜的拼接和組裝等復(fù)雜的生物信息學(xué)處理，真實可靠地分析基因的轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體組成和可變剪切形式5、直接對原始DNA測序，保留了堿基修飾信息，獲得序列的同時可以得到堿基修飾信息，是目前唯一一款可以將基因組學(xué)和表觀遺傳學(xué)合二為一的測序儀6、在做微生物群落分析或者病毒準(zhǔn)種分型時

5、，三代測序具有更高的分型分辨率7、 簡便快捷的實驗流程和數(shù)據(jù)分析，可以快速及時完成相關(guān)項目。IlluminaIllumina邊合成邊測序技術(shù)(SBS, Sequecing by Synthesis)將DNA打碎成數(shù)百bp片段，連接接頭后，每個DNA片段通過橋式PCR擴增成簇。線狀是。PCR擴增導(dǎo)致丟失了表觀修飾信息，（如果要檢測修飾信息，必須增加重亞硫酸鹽處理轉(zhuǎn)化堿基過程或與染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實驗相結(jié)合，操作極其復(fù)雜，影響因素多）。對于高GC，高AT或發(fā)卡結(jié)構(gòu)區(qū)域，同聚物序列，因為擴增效率低或無法擴增，導(dǎo)致相應(yīng)區(qū)域覆蓋度低或完全無法覆蓋。（存在稀有突變檢測假陽性率高、病毒準(zhǔn)種分型、1

6、6S rDNA分型方面分辨率低，相似物種分型困難等問題）基因組組裝往往需要建立多個文庫，以基因組最小的微生物來說，需要建23個不同大小的文庫，大基因組如動植物基因組測序組裝，需要建立6個不同大小的文庫標(biāo)準(zhǔn)流程推薦基于AFA技術(shù)的超聲打斷，片段長度為幾百bp，需要配套covaris儀器可逆終止子方法對數(shù)百萬個片段進行測序，在單個堿基摻入增長的DNA鏈時檢測它們。每次檢測一個堿基。非連續(xù)，可逆終止反應(yīng)，需要在每個堿基添加后停止合成否。Flow Cell否，成簇信號檢測，文庫經(jīng)加工處理（PCR）后的放大信號采集雙端測序最長2300 bp2150 bp，75%的堿基高于Q30。隨著depth提高，準(zhǔn)確

7、性提升不明顯，上限接近Q40否，必須是read之間mapping，豐度低的序列檢測假陽性率高，分型分辨率低測序結(jié)果受高GC、高AT、回文序列和同聚物等影響，導(dǎo)致測序覆蓋度不均一，存在大量無法測序的區(qū)域，留下gap，導(dǎo)致基因組拼接不完整，De novo測序通常只能解析85%的基因組信息。否。如果要檢測甲基化信息，必須增加堿基轉(zhuǎn)化流程，過程復(fù)雜且損失大量真實信息。整個基因組數(shù)以千計平均僅為50Kb基因組數(shù)據(jù)拼接花了1年時間。受讀長限制，僅能檢測極少數(shù)結(jié)構(gòu)變異無法直接檢測全長轉(zhuǎn)錄本，需要片段化、測序、組裝等步驟，拼接工作量大，且無法避免拼接錯誤，尤其針對可變剪切很頻繁的基因檢測部分可變區(qū)，無法檢測全

8、長，分型分辨率低，非單分子測序，分型準(zhǔn)確性低讀長短，后續(xù)拼接困難，易出現(xiàn)錯誤分型據(jù)文獻報道，由于讀長短，測序受堿基組成影響等因素，20072011年間，采用二代測序技術(shù)完成的大部分微生物基因組為草圖而非完整的精細(xì)圖，在數(shù)據(jù)庫中拼接完整的，準(zhǔn)確度在99.99%以上的基因組低于35%，且大量結(jié)構(gòu)變異未被挖掘。即使為10Mb以為的細(xì)菌基因組，測序組裝后往往存在幾十個甚至幾百個gap建庫數(shù)量：8個文庫；耗時：1年;組裝效果：被測通的基因組大小為817Mb,丟失了1617%基因組信息，Contig N50僅為21Kb，Contig數(shù)量為1128199個建庫數(shù)量：10個文庫；組裝效果：被測通的基因組大小為

9、158Mb,僅占總基因組的63%，組裝獲得的Scaffold(還不是contig)僅僅為11Kb,scaffolds數(shù)量為14216個測序深度：170；組裝效果：222bp，作者點評：測序失敗contig N50:42kb；組裝后殘留gap數(shù)：117293HiSeq結(jié)合BAC文庫，組裝后contig N50約140kb，組裝獲得基因組大小為2.83Gb讀長短，無法確定讀長短，多用來檢測點突變、SNP、小的indel，無法準(zhǔn)確檢測重復(fù)、缺失、易位、倒位等大片段結(jié)構(gòu)變異該菌GC含量高，依賴PCR的測序技術(shù)無法發(fā)現(xiàn)臨床上所有與異煙肼耐藥的突變位點，可以解釋89%臨床上耐藥現(xiàn)象中心粒是串聯(lián)重復(fù)的高發(fā)區(qū)

10、，而該區(qū)域在生物學(xué)進化中起著非常重要的作用，研究中心粒結(jié)構(gòu)組成非常關(guān)鍵，二代測序讀長短，無法解析復(fù)雜的串聯(lián)重復(fù)用二代測序技術(shù)分析多次，曾經(jīng)認(rèn)為對ESC轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)非常清楚了科學(xué)家用二代測序、qPCR等技術(shù)研究neurexin的可變剪切，發(fā)現(xiàn)了一部分轉(zhuǎn)錄本，已經(jīng)能夠預(yù)測該基因家族可變剪切非常頻繁，認(rèn)為基于拼接的短讀長測序技術(shù)無法解析該基因家族的可變剪切之前用短讀長測序完成了基因組測序，完成了基因預(yù)測和注釋無法一次性獲得全基因組甲基化組信息實驗操作非常復(fù)雜：利用6mA抗體進行ChIP實驗測序發(fā)現(xiàn)甲基化motif質(zhì)譜分析確定發(fā)生甲基化的堿基。數(shù)據(jù)質(zhì)量：抗體的純度和特異性都會影響實驗結(jié)果，其它人工涉

11、及的實驗步驟也更容易引入誤差受讀長所限，僅分析16S rDNA部分可變區(qū)，分型分辨率有限，最多達屬水平HiSeq2000平臺，測序18.5Gb，有兩個主要的系統(tǒng)發(fā)育類型無法區(qū)分1、超長讀長，是二代測序讀長的幾十倍甚至近百倍，相比二代測序技術(shù)更容易拼接，簡化了生物信息學(xué)分析，在基因組de novo測序和結(jié)構(gòu)變異（如融合基因組檢測、倒位、易位、單型體、重復(fù)和缺失等）分析方面優(yōu)勢極其顯著2、單分子測序，檢測稀有變異（比如稀有突變、病毒的稀有變異體）更可信，極大改善二代測序在稀有突變檢測方面的假陽性問題3、無需PCR擴增，測序結(jié)果不受高GC，高AT和回文序列的影響，測序均一性好，而二代測序依賴PCR，

12、針對基因組中的這些特征序列測序覆蓋度低或者根本無法檢測，遺漏很多重要信息4、相比二代測序，三代測序技術(shù)轉(zhuǎn)錄組測序中無需片段化過程，直接檢測全長轉(zhuǎn)錄本，無需復(fù)雜的拼接和組裝等復(fù)雜的生物信息學(xué)處理，真實可靠地分析基因的轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體組成和可變剪切形式5、直接對原始DNA測序，保留了堿基修飾信息，獲得序列的同時可以得到堿基修飾信息，是目前唯一一款可以將基因組學(xué)和表觀遺傳學(xué)合二為一的測序儀6、在做微生物群落分析或者病毒準(zhǔn)種分型時，三代測序具有更高的分型分辨率7、 簡便快捷的實驗流程和數(shù)據(jù)分析，可以快速及時完成相關(guān)項目。PacBioPacBio單分子實時測序技術(shù)(SMRT, Single Molecule

13、 Real-Time)，基于納米孔中的單個聚合酶和單條dsDNA鏈的反應(yīng)獲得堿基序列DNA片段化之后，選擇性回收20kb或30kb以上的大片段DNA，經(jīng)過末端補平，DNAdamage修復(fù)，加接頭，與聚合酶結(jié)合后，上機測序。環(huán)狀否。無需PCR（保留了模板原始的表觀修飾信息，測序的同時可以獲得堿基修飾信息，是目前唯一可以將表觀遺傳學(xué)和基因組學(xué)合二為一的測序技術(shù)）。DNA聚合酶對GC含量不敏感，并有鏈置換功能，可以輕松測通染色體中高GC，高AT及發(fā)卡結(jié)構(gòu)等特殊區(qū)域。檢測原始DNA,結(jié)果更真實可靠?；蚪M組裝一般就建一個長 片段文庫，比如20kb文庫僅需g-tube(一種耗材)配合常規(guī)離心機采用離心方

14、式，打斷成長片段只需建一個文庫即可用于多個SMRT Cell。單分子實時測序，連續(xù)捕獲熒光信號，不打斷聚合酶的合成過程，除了可以獲得堿基序列，還能獲得動態(tài)信息，得到甲基化修飾等表觀遺傳信息。堿基合成過程具有連續(xù)性，由于構(gòu)建文庫為環(huán)狀DNA，文庫的測序過程同樣具有重復(fù)檢測的連續(xù)性。是。SMRT Cell的零模波導(dǎo)孔（ZMW， Zero Mode Waveguide）是，單個分子的點檢測，不經(jīng)過任何加工處理，保持最原始最真實的堿基序列信息P6C4平均讀長1015kb，一半以上reads的讀長14kb，5%的讀長超過24kb，最長可超過60kb，pacbio不斷優(yōu)化試劑，測序性能有很大提升空間一致性

15、準(zhǔn)確性在30depth條件下，可以實現(xiàn)Q50。隨著depth增加，準(zhǔn)確性還能提高。是（建立小片段插入文庫時，長讀長的特性可以對同一個分子達到足夠的測序深度，可以進行單條read內(nèi)部進行mapping，獲得consensussequence，這是三代測序獨有的mapping方式，對于檢測稀有突變、稀有轉(zhuǎn)錄本、16SrDNA分型、病毒準(zhǔn)種分型具有非常重要的價值，提高檢出率和分型分辨率，降低假陽性）測序不受堿基組成及結(jié)構(gòu)影響，均一性好，基因組測序和拼接更完整。De novo測序可以解析高達99%的以上的基因組信息。是（單分子測序，無需PCR,保留DNA原始的甲基化修飾信息，且測序過程中記錄DNA聚合

16、酶動力學(xué)特征，可以判斷堿基修飾信息，是目前唯一可以將基因組學(xué)和表觀遺傳學(xué)相結(jié)合的測序技術(shù)，同一次實驗可以獲得兩套數(shù)據(jù)）僅為幾十至上百（以擬南芥為例，Contig數(shù)目三代比二代減少了120倍，以菠菜為例，Contig數(shù)目減少了223倍）平均在Mb級別。人類基因組Contig N50目前已經(jīng)達到近27M！（與二代數(shù)據(jù)比較，擬南芥的Contig N50增加了93倍，菠菜的Congtig N50增加了43倍）僅3個月時間讀長長，在結(jié)構(gòu)變異檢測方面很有優(yōu)勢讀長長，直接檢測全長轉(zhuǎn)錄本，無需拼接，數(shù)據(jù)分析非常簡單，結(jié)果更真實和全面，易于發(fā)現(xiàn)新基因、新可變剪切事件，融合基因檢測、基因注釋更準(zhǔn)確直接檢測全長（約

17、1.5Kb），分型分辨率高，且是單分子測序，分型準(zhǔn)確率也更高讀長長，可直接測通HLA基因全長，分辨率高，分型準(zhǔn)確微生物基因組測序的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以拼接成完整的基因組，優(yōu)質(zhì)的參考基因組序列有助于后續(xù)功能基因組分析、結(jié)構(gòu)變異分析。除了染色體基因組拼接外，還能準(zhǔn)確判斷在細(xì)菌中普遍存在的外源基因整合、可完成質(zhì)?；蚪M拼接等，在醫(yī)藥微生物、工業(yè)微生物領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用建庫數(shù)量：1個；耗時：3個月，組裝效果：被測通的基因組大小為952Mb，丟失僅為12的基因組信息，較二代提升了14%，ContigN50為920Kb，提升43倍，Contig數(shù)量為5059，提升223倍。整個測序項目所話經(jīng)費二代、三代相當(dāng)。

18、建庫數(shù)量：1個20Kb大小的文庫；組裝效果：被測通的基因組大小為244.46Mb,占總基因組大小的98.3，Contig N50為2.38Mb,contig數(shù)量為625個，基因組測序到完成組裝僅耗時1個月，效率非常高(P6C4最新測序試劑，測序深度72)測序深度：130，組裝效果：64Kb，提升64Kb，發(fā)現(xiàn)基因組中75%都是為簡單重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座子序列，都是二代測序的盲區(qū)和挑戰(zhàn)區(qū)；作者點評：單分子，長讀長測序技術(shù)的表現(xiàn)讓人非常驚訝在二代基礎(chǔ)上添加了19PacBio數(shù)據(jù)，組裝后contig N50為500kb，提升12倍，殘留gap數(shù)為12766，關(guān)閉了89%的gap。貝勒醫(yī)學(xué)院采用三代測序提升

19、二代測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的策略，也應(yīng)用于靈長類動物、大鼠、其它哺乳動物的全基因組測序。華盛頓基因組研究中心：2014年采用PacBio測序后，contigN50為7.7Mb,組裝大小3.1Gb，補充了原先人類參考基因組中的55%gap區(qū)域；2015年再次公布PacBio測序結(jié)果：最新測序試劑P6C4，測序深度61，contig N50為26.9Mb,組裝大小約3.0Gb長讀長，確立了與藥物藥效相關(guān)的SNP haplotype network，解釋了出現(xiàn)埃博拉病毒逃逸現(xiàn)象。（采用P4C2舊版試劑，每個樣品2個SMRT Cell）華盛頓基因組中心，采用PacBio對葡萄胎單倍體細(xì)胞系（CHM1）進行全基因

20、組測序，發(fā)現(xiàn)26079個結(jié)構(gòu)變異，其中85%都是原先未發(fā)現(xiàn)的新的結(jié)構(gòu)變異，可驗證率高達97%，這體現(xiàn)了長讀長測序技術(shù)在結(jié)構(gòu)變異檢測的優(yōu)越表現(xiàn)，也凸顯了以往的短讀長測序技術(shù)的不足。（采用P5C3舊版試劑，測序深度41）無需PCR,不受GC含量影響，能夠檢測到以往發(fā)現(xiàn)的所有耐藥突變，還能發(fā)現(xiàn)新的耐藥位點，可解釋98%臨床耐藥現(xiàn)象采用 PacBio測序技術(shù)，完成了柳枝稷中心粒區(qū)域的解析，發(fā)現(xiàn)含有幾個kb的串聯(lián)重復(fù)，而且每個大的重復(fù)單元里包含了若干個小的串聯(lián)重復(fù)，結(jié)果非常復(fù)雜（采用P4C2舊版試劑）用三代測序技術(shù)重新進行轉(zhuǎn)錄組分析，檢測到13000多個全長轉(zhuǎn)錄本，其中超過三分之一都是新的，同時發(fā)現(xiàn)了2

21、73個新基因，這些新的基因或轉(zhuǎn)錄本表達具有組織特異性且與干細(xì)胞多能性有關(guān).(采用P4C2舊版試劑，建三個文庫：1 2 kb, 23 kb, 310kb，共7,816,704 raw reads)作者認(rèn)為，無需組裝，直接檢測全長轉(zhuǎn)錄本的三代測序可以解決這個問題，利用PacBio測序技術(shù)繪制了neurexin基因的可變剪切圖譜，結(jié)果證實了科學(xué)家關(guān)于neurexin基因可變剪切極其頻繁的預(yù)測。(采用P4C2舊版試劑，neurexin 1，3基因各6個SMRT Cell,neurexin 基因2個或3個SMRT Cell)驗證了之前預(yù)測的2267個基因，同時發(fā)現(xiàn)了665個新基因，注釋完整性有了17%的

22、改善（采用P4C2舊版試劑，建三個文庫：12kb，23kb，3kb，每個文庫各測2個SMRT Cell,二代數(shù)據(jù)21million reads進行error correction）采用P4C2舊版試劑,通過三代測序完成了多雷桿菌全基因組測序(兩株菌，基因組大小分別為5.7Mb和5.2Mb，測序深度分別為306和250)，測序獲得完整的基因組，并獲得了全基因組甲基化組信息，找到了與I型糖尿癥相關(guān)的甲基化motif和甲基轉(zhuǎn)移酶無需繁瑣ChIP實驗，無需質(zhì)譜分析，僅需要普通的測序即可獲得單堿基分辨率的甲基化修飾，作者采用三代測序（深度50）對二代結(jié)果進行驗證讀長優(yōu)勢，直接分析16S rDNA全長，分

23、型分辨率高，可達種水平，且分型變異系數(shù)更低采用P4C2舊版本試劑，添加了3Gb PacBio環(huán)形一致序列，將兩個無法區(qū)分的系統(tǒng)發(fā)育類型很好地區(qū)分開了數(shù)數(shù)據(jù)據(jù)來來源源Adam MP,Sergey Koren. One chromosome, one contig:complete microbial genomes from long-readsequencing and assembly. Microbiology,2014PAG 2014 PacBio Workshop presentationRobert VR, Doug B, Patrick PE,et al.Single-molecu

24、lesequencing of the desiccation-tolerant grass Oropetiumthomaeum. Nature,2015Michael S, Kaja W, James G, et al. Genome andtranscriptome of the regeneration-competent flatworm,Macrostomum lignano. PNAS,2015PAG 2014 PresentationSlides available Evan EE,Mark JP, John H, et al.Resol

25、ving the complexityof the human genome using single-moleculesequencing. Nature,2014/assembly/GCA_001297185.1/Jeffrey RK, Johanny KT, Jason TL, et al. Emergence ofEbola Virus Escape Variants in Infected NonhumanPrimates Treated with the MB-003 Antibody Cocktail.Cell, 2015Eva

26、n EE,Mark JP, John H, et al.Resolving the complexityof the human genome using single-moleculesequencing. Nature,2014Jessica NT, Lynthia VP, Timothy CR, et al.Novel katGmutations causing isoniazid resistance in clinical M.tuberculosis isolates. Emerging Microbes andInfections,2015Simon WC, Keith RB, Hugh AY, et al.Comparativeanalysis of tandem repeats from hundreds of speciesreveals unique insights into centromereevolution.Genome Biology,2013Kin FA, Vittorio S, Pegah TA, et al. Characterization ofthe hu