熒光定量PCR的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課HCMV課件

1、熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv1熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv2如何做一個(gè)如何做一個(gè)“聰明聰明”的實(shí)習(xí)生的實(shí)習(xí)生l實(shí)習(xí)的目的就是對在校所學(xué)的理論知識和實(shí)驗(yàn)技實(shí)習(xí)的目的就是對在校所學(xué)的理論知識和實(shí)驗(yàn)技能，在臨床的實(shí)際工作中進(jìn)行實(shí)踐、鞏固和提高。能，在臨床的實(shí)際工作中進(jìn)行實(shí)踐、鞏固和提高。l如何做到：如何做到： 實(shí)習(xí)之前要復(fù)習(xí)理論知識和實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容實(shí)習(xí)之前要復(fù)習(xí)理論知識和實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容 “理論先行理論先行” 實(shí)習(xí)過程中要實(shí)習(xí)過程中要“聰明聰明” 做好實(shí)習(xí)筆記，用心思考，做好實(shí)習(xí)筆記，用心思考，實(shí)習(xí)之外下功夫?qū)嵙?xí)之外下功夫熒光定量pcr的原

2、理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv3如何做一個(gè)如何做一個(gè)“聰明聰明”的實(shí)習(xí)生的實(shí)習(xí)生聰聰明明耳：認(rèn)真聽老師的說明和講解耳：認(rèn)真聽老師的說明和講解看：仔細(xì)看老師的操作看：仔細(xì)看老師的操作問：有疑問要多提問，多討論問：有疑問要多提問，多討論心：要用心去思考心：要用心去思考日月：要每天每月堅(jiān)持做到日月：要每天每月堅(jiān)持做到熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv4內(nèi)容概要內(nèi)容概要lpcr的定義和原理的定義和原理l熒光定量熒光定量pcr的原理和分類的原理和分類l熒光定量熒光定量pcr結(jié)果的分析結(jié)果的分析l熒光定量熒光定量pcr在臨床的應(yīng)用在臨床的應(yīng)用熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv5

3、pcr的定義的定義lpcr是是polymerase chain reaction的縮寫，中的縮寫，中文稱為文稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，由，由變性變性、退火退火及及延延伸伸幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行循環(huán)進(jìn)行,可使目可使目的的dna得以迅速擴(kuò)增。得以迅速擴(kuò)增。l由美國由美國pe公司遺傳部的公司遺傳部的dr. mullis發(fā)明，由于發(fā)明，由于pcr技術(shù)的跨時(shí)代意義，技術(shù)的跨時(shí)代意義，mullis獲得了獲得了1993年年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv6pcr的原理的原理l變性變性：雙鏈：雙鏈dna在高溫下解開成單鏈的過程在

4、高溫下解開成單鏈的過程 。溫。溫度一般為度一般為95左右。左右。5ccactgcctctc cctgagctgtga33ggtgacggagag ggactcgacact55ccactgcctctc cctgagctgtga33ggtgacggagag ggactcgacact5熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv7pcr的原理的原理l退火退火：溫度下降后，兩條配對的單鏈：溫度下降后，兩條配對的單鏈dna重新重新結(jié)合為雙鏈的過程。溫度一般為結(jié)合為雙鏈的過程。溫度一般為5060。5ccactgcctctc cctgagctgtga33ggtgacggagag ggactcgacact

5、5ccactgcctctcggactcgacact5ccactgcctctc cctgagctgtga33ggtgacggagag ggactcgacact5ccactgcctctcggactcgacact熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv8pcr的原理的原理l延伸延伸：dna聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的dna鏈延伸反應(yīng)鏈延伸反應(yīng) 。溫度一般為。溫度一般為72左右。左右。5ccactgcctctc cctgagctgtga33ggtgacggagag ggactcgacact5ccactgcctctcggactcgacact5ccactgcctctc cc

6、tgagctgtga33ggtgacggagag ggactcgacact5ccactgcctctc cctgagctgtgaggtgacggagag ggactcgacact熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv9普通普通pcr的原理的原理熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv10普通普通pcr的原理的原理lpcr反應(yīng)成分：反應(yīng)成分： 1.模板模板dna 2.引物引物 3.四種脫氧核糖核苷酸四種脫氧核糖核苷酸 4.dna聚合酶聚合酶(taq酶酶) 5.反應(yīng)緩沖液、反應(yīng)緩沖液、mg2+等等 6.熒光探針（熒光定量熒光探針（熒光定量pcr）熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生

7、講課hcmv11taq酶的發(fā)現(xiàn)酶的發(fā)現(xiàn)l在在taq酶發(fā)現(xiàn)之前，實(shí)驗(yàn)室的酶發(fā)現(xiàn)之前，實(shí)驗(yàn)室的pcr反應(yīng)中運(yùn)用反應(yīng)中運(yùn)用的是大腸桿菌的是大腸桿菌dna聚合酶聚合酶的的klenow片段。片段。lklenow酶不耐高溫，酶不耐高溫，90加熱后會(huì)加熱后會(huì)變性失活變性失活，每次循環(huán)結(jié)束都要加入新鮮的酶。每次循環(huán)結(jié)束都要加入新鮮的酶。l而且而且dna的延伸是在的延伸是在37完成，模板和引物容完成，模板和引物容易錯(cuò)配，造成反應(yīng)的易錯(cuò)配，造成反應(yīng)的特異性很差特異性很差。熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv12taq酶的發(fā)現(xiàn)酶的發(fā)現(xiàn)l美國的嗜熱菌研究室在黃石國家公園溫泉中發(fā)美國的嗜熱菌研究室在黃石國家

8、公園溫泉中發(fā)現(xiàn)了嗜熱菌現(xiàn)了嗜熱菌(thermus aquaticus)株，株，cetus公司公司研究人員從中分離了研究人員從中分離了taq dna聚合酶聚合酶l特點(diǎn)：特點(diǎn)：耐高溫：耐高溫：70 2h 活性活性90%，93 2h 活性活性60%，95 2h 活性活性40% ； 延伸溫度延伸溫度較高較高(一般為一般為72 )：大大：大大提高了擴(kuò)增特異性、提高了擴(kuò)增特異性、靈敏性和擴(kuò)增效率靈敏性和擴(kuò)增效率。熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv13熒光定量熒光定量pcrl概念：在概念：在pcr反應(yīng)中加入反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)熒光基團(tuán)，利用熒光，利用熒光信號累積或變化實(shí)時(shí)監(jiān)測信號累積或變化實(shí)時(shí)監(jiān)

9、測整個(gè)反應(yīng)過程，最后整個(gè)反應(yīng)過程，最后通過特定數(shù)學(xué)模型對未知模板進(jìn)行定量分析的通過特定數(shù)學(xué)模型對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。方法。l實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)于技術(shù)于1996年由美國年由美國applied biosystems，abi公司公司推出，實(shí)現(xiàn)了推出，實(shí)現(xiàn)了pcr從定性從定性到定量的飛躍。到定量的飛躍。熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv14實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量pcr的原理的原理l利用利用熒光信號的變化熒光信號的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測實(shí)時(shí)監(jiān)測pcr反反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。應(yīng)的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。l通過通過ct值值和和標(biāo)準(zhǔn)曲線分析標(biāo)準(zhǔn)曲線分析對起始標(biāo)本對

10、起始標(biāo)本的模板量進(jìn)行定量分析。的模板量進(jìn)行定量分析。熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv15與普通與普通pcr的比較的比較l普通普通pcr完成后，一般只對擴(kuò)增的最終完成后，一般只對擴(kuò)增的最終產(chǎn)物量進(jìn)行分析，分析結(jié)果多為產(chǎn)物量進(jìn)行分析，分析結(jié)果多為定性定性或者半定量或者半定量結(jié)果。結(jié)果。l熒光定量熒光定量pcr通過監(jiān)測熒光值的變化，通過監(jiān)測熒光值的變化，體現(xiàn)每一個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，體現(xiàn)每一個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，分析結(jié)果為分析結(jié)果為定量定量結(jié)果。結(jié)果。熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv16與普通與普通pcr的比較的比較l普通普通pcr完成后，才能進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的完

11、成后，才能進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，而且分析的過程可能產(chǎn)生一定的分析，而且分析的過程可能產(chǎn)生一定的生物危害和環(huán)境污染生物危害和環(huán)境污染。l熒光定量熒光定量pcr的擴(kuò)增和產(chǎn)物分析過程是的擴(kuò)增和產(chǎn)物分析過程是同時(shí)完成同時(shí)完成的，而且在的，而且在封閉封閉的反應(yīng)體系中的反應(yīng)體系中進(jìn)行，比較安全，易于處理。進(jìn)行，比較安全，易于處理。熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv17常用的名詞概念常用的名詞概念l本底信號（本底信號（baseline）l熒光閾值（熒光閾值（threshold）lct值（值（ct value）l擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線前前15個(gè)循環(huán)熒光信號的均值，可個(gè)循環(huán)熒光信號的均值，可手動(dòng)調(diào)節(jié)選擇手

12、動(dòng)調(diào)節(jié)選擇默認(rèn)是第默認(rèn)是第315個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的準(zhǔn)偏差的10倍，也可手動(dòng)調(diào)節(jié)倍，也可手動(dòng)調(diào)節(jié)擴(kuò)增過程中，產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值擴(kuò)增過程中，產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv18常用的名詞概念常用的名詞概念thresholdbaselinect value熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度rn擴(kuò)增循環(huán)數(shù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對數(shù)增長期對數(shù)增長期熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv19實(shí)際中的運(yùn)用實(shí)際中的運(yùn)用左圖為左圖為5個(gè)數(shù)量級的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增后得到的熒光曲線，個(gè)數(shù)量級的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增后得到的熒光曲線，

13、右圖以右圖以ct值為縱坐標(biāo)，值為縱坐標(biāo)，lgxs為橫坐標(biāo)，可計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)曲線為橫坐標(biāo)，可計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)曲線熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv20實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量pcr的分類的分類l目前的實(shí)時(shí)熒光定量目前的實(shí)時(shí)熒光定量pcr均是基于均是基于熒光共振能熒光共振能量轉(zhuǎn)移量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，fret）的原理。）的原理。fq10nmffluorophore,熒光基團(tuán)熒光基團(tuán)qquencher，淬滅基團(tuán)淬滅基團(tuán)fq10nm熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv21熒光共振能量轉(zhuǎn)移（熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fret）發(fā)

14、生的條件）發(fā)生的條件l熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)都能發(fā)射熒光熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)都能發(fā)射熒光l熒光基團(tuán)的熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜發(fā)射光譜和淬滅基團(tuán)的和淬滅基團(tuán)的激發(fā)光譜激發(fā)光譜需需有效重疊有效重疊l熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)應(yīng)足夠的近（熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)應(yīng)足夠的近（500bp片段敏感片段敏感 75%或無水乙醇溶液噴霧或無水乙醇溶液噴霧熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv33熒光定量熒光定量pcr在臨床的應(yīng)用在臨床的應(yīng)用l在反應(yīng)體系中使用在反應(yīng)體系中使用dutp和和ung酶消除以酶消除以往實(shí)驗(yàn)的污染影響往實(shí)驗(yàn)的污染影響 ung酶（尿嘧啶酶（尿嘧啶-n-糖基化酶）：選擇性糖基化酶）：選擇性水解斷裂含有水解斷裂

15、含有du的雙鏈和單鏈中的尿嘧的雙鏈和單鏈中的尿嘧啶糖苷鍵，在堿性介質(zhì)和高溫下會(huì)進(jìn)一啶糖苷鍵，在堿性介質(zhì)和高溫下會(huì)進(jìn)一步水解斷裂，酶的最佳活性溫度是步水解斷裂，酶的最佳活性溫度是50，在在95 失活。失活。熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv34熒光定量熒光定量pcr在臨床的應(yīng)用在臨床的應(yīng)用氣溶氣溶膠污膠污染物染物50 2min， 95 滅活加入加入ung酶酶熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv35熒光定量熒光定量pcr在臨床的應(yīng)用在臨床的應(yīng)用5ccactgcctctc cctgagctgtga35ccacugccucuc ccugagcuguga3加入加入dutp5cc

16、acugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga3ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga35ccacugccucuc ccugagcuguga3潛在氣溶膠污染物潛在氣溶膠污染物加入加入ung酶酶5斷裂的核苷酸片段斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段斷裂的核苷酸片段3

17、5斷裂的核苷酸片段斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段斷裂的核苷酸片段3熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv36熒光定量熒光定量pcr在臨床的應(yīng)用在臨床的應(yīng)用l乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒dna(hbv-dna)leb病毒病毒dna(ebv-dna)l人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna(hcmv-dna)l肺炎支原體肺炎支原體dna(mp-dna)l肺炎衣原體肺炎衣原體dna(

18、cp-dna)熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv37臨床標(biāo)本的采集臨床標(biāo)本的采集檢檢 測測 項(xiàng)項(xiàng) 目目標(biāo)標(biāo) 本本 類類 型型 及及 要要 求求hbv-dna血清或者血漿血清或者血漿 100l(不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝)ebv-dna血清血清100l或抗凝全血或抗凝全血 1ml(不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝)hcmv-dna血清血清100l或抗凝全血或抗凝全血 1ml (不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝)mp-dna cp-dna咽拭子、痰液或肺支氣管灌洗液咽拭子、痰液或肺支氣管灌洗液 1ml熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv38人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna檢測試劑

19、盒檢測試劑盒l(wèi)用于器官移植、骨髓移植及用于器官移植、骨髓移植及hiv陽性陽性/aids患者人巨細(xì)胞病毒感染的患者人巨細(xì)胞病毒感染的輔助診斷輔助診斷和療效監(jiān)控和療效監(jiān)控。l臨床上可以采用的標(biāo)本類型：臨床上可以采用的標(biāo)本類型：尿液尿液、乳乳汁汁、血清、血漿或血清、血漿或淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞樣本中人巨樣本中人巨細(xì)胞病毒細(xì)胞病毒dna。熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv39人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna檢測試劑盒檢測試劑盒l(wèi)巨細(xì)胞病毒巨細(xì)胞病毒dna的提?。ㄑ寤蜓獫{）的提取（血清或血漿）100l血清血清或血漿或血漿100l dna濃濃縮液縮液去除上清去除上清液，保留液，保留沉淀沉淀1200

20、0rpm，10min熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv40人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna檢測試劑盒檢測試劑盒巨細(xì)胞病毒巨細(xì)胞病毒dna的提?。ㄑ寤蜓獫{）的提?。ㄑ寤蜓獫{）加入加入50ldna提提取液取液劇烈振蕩劇烈振蕩混勻混勻5-10s100加熱加熱10min熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv41人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna檢測試劑盒檢測試劑盒l(wèi)巨細(xì)胞病毒巨細(xì)胞病毒dna的提?。ㄑ寤蜓獫{）的提?。ㄑ寤蜓獫{）4放放置或用置或用于于pcr振蕩混勻振蕩混勻510s12000rpm，5min熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv42人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病

21、毒dna檢測試劑盒檢測試劑盒l(wèi)巨細(xì)胞病毒巨細(xì)胞病毒dna的提?。蛞汉腿橹┑奶崛。蛞汉腿橹?ml尿液尿液或乳汁或乳汁去除上清去除上清液，保留液，保留沉淀沉淀12000rpm，5min熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv43人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna檢測試劑盒檢測試劑盒l(wèi)巨細(xì)胞病毒巨細(xì)胞病毒dna的提取（尿液和乳汁）的提?。蛞汉腿橹┘尤爰尤?0ldna提提取液取液劇烈振蕩劇烈振蕩混勻混勻5-10s100加熱加熱10min熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv44人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna檢測試劑盒檢測試劑盒l(wèi)巨細(xì)胞病毒巨細(xì)胞病毒dna的提?。蛞汉腿橹┑?/p>

22、提?。蛞汉腿橹?放放置或用置或用于于pcr振蕩混勻振蕩混勻510s12000rpm，5min熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv45人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna檢測試劑盒檢測試劑盒l(wèi)人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna的提?。馨图?xì)胞的提?。┑奶崛。馨图?xì)胞的提?。?1ml抗抗凝全血凝全血1ml生生理鹽水理鹽水0.3ml淋巴淋巴細(xì)胞分離液細(xì)胞分離液熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv46人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna檢測試劑盒檢測試劑盒l(wèi)人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna的提取（淋巴細(xì)胞的提?。┑奶崛。馨图?xì)胞的提?。┧诫x心機(jī)水平離心機(jī)2500rpm，15min淋巴細(xì)胞層

23、淋巴細(xì)胞層吸取淋巴吸取淋巴細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv47人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna檢測試劑盒檢測試劑盒l(wèi)人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna的提?。馨图?xì)胞的提?。┑奶崛。馨图?xì)胞的提取）淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞懸液懸液去除上清去除上清液，保留液，保留沉淀沉淀12000rpm，5min熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv48人巨細(xì)胞人巨細(xì)胞病毒病毒dna定量檢測試劑盒定量檢測試劑盒l(wèi)人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna的提?。馨图?xì)胞的提?。┑奶崛。馨图?xì)胞的提取）加入加入50ldna提提取液取液劇烈振蕩劇烈振蕩混勻混勻5-10s100加熱加熱10min熒光定

24、量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv49人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna檢測試劑盒檢測試劑盒l(wèi)人巨細(xì)胞病毒人巨細(xì)胞病毒dna的提?。馨图?xì)胞的提?。┑奶崛。馨图?xì)胞的提?。?放放置或用置或用于于pcr振蕩混勻振蕩混勻510s12000rpm，5min熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv50熒光定量熒光定量pcr擴(kuò)增過程擴(kuò)增過程50942min5min9315s5730sstage1stage2stage345 1 1251minstage4 1熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv51dna濃縮液的作用濃縮液的作用ldna濃縮液的成分：濃縮液的成分：peg6000、n

25、acllpeg（聚乙二醇）的作用：（聚乙二醇）的作用：peg與自由水分子與自由水分子結(jié)合，同時(shí)蛋白質(zhì)表面的水化膜被奪走，與水結(jié)合，同時(shí)蛋白質(zhì)表面的水化膜被奪走，與水分子結(jié)合的極性集團(tuán)轉(zhuǎn)而與多聚物的氧原子或分子結(jié)合的極性集團(tuán)轉(zhuǎn)而與多聚物的氧原子或者氫氧根結(jié)合，形成蛋白質(zhì)與多聚物的復(fù)合體，者氫氧根結(jié)合，形成蛋白質(zhì)與多聚物的復(fù)合體，從溶液中沉淀析出。從溶液中沉淀析出。提高低濃度標(biāo)本的檢出率提高低濃度標(biāo)本的檢出率。lpeg的濃度與沉淀出的的濃度與沉淀出的dna片段大小成反比。片段大小成反比。 熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv52dna濃縮液的作用濃縮液的作用lnacl的作用：在細(xì)胞內(nèi)的

26、作用：在細(xì)胞內(nèi)dna與蛋白質(zhì)結(jié)合成與蛋白質(zhì)結(jié)合成脫脫氧核糖核蛋白氧核糖核蛋白dnp ，而，而rna與蛋白質(zhì)結(jié)合成為與蛋白質(zhì)結(jié)合成為核糖核蛋白核糖核蛋白rnp,在不同鹽濃度中二者溶解度不在不同鹽濃度中二者溶解度不一樣。一樣。ldnp在純水或者在純水或者12m的的nacl溶解度較大，在溶解度較大，在0.14m溶解度較低，而溶解度較低，而0.14m中中rnp溶解度較大，溶解度較大，因此因此利用利用0.14m可分離可分離rnp和和dnp。 熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv53dna提取液的作用提取液的作用ldna提取液的主要成分：提取液的主要成分： np-40 tritonx-100 chelex-100 edta(ph8.0) tris-hcl (ph 8.0) naoh （乙基苯基聚乙二醇）很溫和的去垢劑，（乙基苯基聚乙二醇）很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對核膜破壞的作用弱壞掉胞膜，而對核膜破壞的作用弱 （聚乙二醇辛基苯基醚（聚乙二醇辛基苯基醚 ）一種非離子性去垢劑，）一種非離子性去垢