重組人血小板生成素的研究與開發(fā)0502終稿

1、指導(dǎo)教師：胡昌華指導(dǎo)教師：胡昌華 教授教授輔助指導(dǎo)：趙燕莉輔助指導(dǎo)：趙燕莉 學(xué)姐學(xué)姐搜集整理資料：孫振鵬搜集整理資料：孫振鵬 趙麗麗趙麗麗翻譯文獻(xiàn)、校稿：趙娜薇翻譯文獻(xiàn)、校稿：趙娜薇 李婭男李婭男pptppt動(dòng)畫制作：趙振國動(dòng)畫制作：趙振國概述 大量存在于血液中無核盤狀小細(xì)胞（直徑約3m）。 其生成受血液中的血小板生成素(tpo)調(diào)節(jié)。成年人血液中血小板數(shù)量為1030萬/mm3。 作用功能 促進(jìn)止血; 加速凝血; 維護(hù)毛細(xì)血管壁完整性。血小板生成減少：血小板生成減少： 遺傳性遺傳性 獲得性獲得性血小板破壞增加：血小板破壞增加： 非免疫性非免疫性 免疫性免疫性其他：脾亢、出血等。其他：脾亢、出血

2、等。反復(fù)化療更容易導(dǎo)致血小板減少血小板輸注血小板輸注u 存在的弊端主要有： 1）同種異體免疫反應(yīng)：導(dǎo)致無效性血小板輸注； 2）輸血感染； 3）過敏反應(yīng)； 4）來源困難，價(jià)格昂貴等。 因此，新型治療血小板減少癥的特效藥物的研發(fā)具有較為可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和深遠(yuǎn)的社會(huì)影響關(guān)于關(guān)于tpotpo和和rhtporhtpo研究歷史和現(xiàn)狀研究歷史和現(xiàn)狀主要生產(chǎn)方法及技術(shù)主要生產(chǎn)方法及技術(shù)參與競爭的主要公司參與競爭的主要公司目前存在問題及改進(jìn)目前存在問題及改進(jìn)前景與展望前景與展望巨核細(xì)胞tpo血小板生成素（內(nèi)源性細(xì)胞因子）血小板生成素（內(nèi)源性細(xì)胞因子） 與受體結(jié)合刺激增殖 分化 成熟血小板主要在肝臟合成；332個(gè)a

3、a、95kd的糖蛋白；兩個(gè)結(jié)構(gòu)域： 受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域； 富糖結(jié)構(gòu)域。tpo受體受體（c-mpl） 含有2個(gè)細(xì)胞因子受體同源結(jié)構(gòu)。 tpo與末端crm結(jié)合、激活c-mpl、啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)1958年，kelemen等人發(fā)現(xiàn)在血小板減少癥病人血漿中，存在一種可促進(jìn)巨核細(xì)胞成熟及血小板生成的物質(zhì)并命名為血小板生成素(tpo)。1994年，科學(xué)家采用反相及常規(guī)生物技術(shù)，從多個(gè)樣本中純化得tpo。 第1代tpo分子包括rhtpo、聚乙二醇化重組人巨核細(xì)胞生長衍生因子(peg-rhumgdf)。但由于臨床試驗(yàn)中不良反應(yīng)的存在, 第1代tpo分子在英美等發(fā)達(dá)國家已停止了研究，在國內(nèi)得到一定程度的發(fā)展。進(jìn)入2

4、1世紀(jì)以來，第2代tpo以其可口服給藥，且相比第一代在免疫原性方面有所改善等優(yōu)點(diǎn)被廣泛研究。主要包括3類: tpo肽類模擬物、tpo非肽類模擬物和tpo激動(dòng)劑抗體。它們以不同方式結(jié)合并激動(dòng)tpo受體從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，部分正進(jìn)行臨床試驗(yàn)。(一)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 通過構(gòu)建gst-tpo融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，在tac啟動(dòng)子作用下實(shí)現(xiàn)了在tpo在原核細(xì)胞中的高效表達(dá)，再經(jīng)gst親和色譜及凝血酶酶切得到tpo目的產(chǎn)物。具有刺激巨核細(xì)胞和血小板生成的生物活性；表達(dá)水平較低；產(chǎn)物分離純化技術(shù)尚未成熟。概述 以人胎肝cdna文庫為模板，通過pcr引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增使畢赤酵母信號(hào)肽序列取代tpo固有序列, 經(jīng)電轉(zhuǎn)化篩

5、獲重組酵母,并用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。概述 將含有編碼人血小板生成素核苷酸序列的cho細(xì)胞接種在細(xì)胞罐內(nèi)擴(kuò)增培養(yǎng)得到高表達(dá)收獲液。然后通過一系列純化工藝，獲得高純度和生物活性的rhtpo。評(píng)價(jià)適于rhtpo的大規(guī)模生產(chǎn)；終產(chǎn)物純度較高；分離純化表達(dá)產(chǎn)物的步驟過于繁瑣。轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選的篩選目的基因目的基因的擴(kuò)增的擴(kuò)增轉(zhuǎn)染細(xì)胞目的轉(zhuǎn)染細(xì)胞目的基因的檢測(cè)基因的檢測(cè)目的基因目的基因的獲得的獲得組建重組建重組質(zhì)粒組質(zhì)粒構(gòu)建工構(gòu)建工程細(xì)胞程細(xì)胞質(zhì)量控制配制藥品制劑目的產(chǎn)物的分離純化培養(yǎng)工程細(xì)胞株add your textadd your textadd your textadd your text方法

6、與技術(shù)路線（下游階段）go目的基因的獲得（pcr）1. 模板變性模板變性 雙鏈雙鏈 dna 模板在模板在 95 c 變變性性為單鏈為單鏈 dna。2. 引物退火引物退火 引物與單鏈引物與單鏈 dna 互補(bǔ)并互補(bǔ)并退火。退火。3. 延伸反應(yīng)延伸反應(yīng) 耐熱的耐熱的 dna 聚合酶催化聚合酶催化子鏈的合成。子鏈的合成。back組建重組質(zhì)粒b b質(zhì)粒質(zhì)粒a a質(zhì)粒質(zhì)粒pdc-t質(zhì)粒質(zhì)粒 王志云，等，西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，第22卷，第六期，2001back構(gòu)建工程細(xì)胞u用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染back磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法back轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選 王志云，等，西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，第2

7、2卷，第六期，2001back目的基因的擴(kuò)增 王志云，等，西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，第22卷，第六期，2001back轉(zhuǎn)染細(xì)胞目的基因的檢測(cè) 王志云，等，西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，第22卷，第六期，2001back培養(yǎng)工程細(xì)胞株細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖rhtpo的的表達(dá)表達(dá)step step back目的產(chǎn)物的分離純化經(jīng)過經(jīng)過sds-pagesds-page、hplchplc檢測(cè)證明，種產(chǎn)品純度檢測(cè)證明，種產(chǎn)品純度。濃縮脫鹽濃縮脫鹽陰離子陰離子交換層析交換層析疏水層析疏水層析凝膠凝膠過濾層析過濾層析back配制藥品制劑back質(zhì)量控制back沈陽三生制藥股份有限公司歷經(jīng)近10年的潛心研發(fā)得出的藥物“特比澳”（入選至國

8、家“863”計(jì)劃、“十五”重大科技項(xiàng)目）曾于2005年5月獲得國家一類新藥證書，成為世界上第一個(gè)完成rhtpo臨床試驗(yàn)并被批準(zhǔn)上市的基因工程藥物。rhtpo商品化藥物的出現(xiàn)生產(chǎn)商生產(chǎn)商規(guī)格規(guī)格沈陽三生制藥股份有限公司15000u/ml 3000u/ml 7500u/ml等吉巨芬（rhil-11）浙江杭州九源基因工程有限公司、齊魯制藥有限公司3mg（2.4107au）/支氨肽素丹東華盛生物制藥有限公司每片0.2g復(fù)方皂礬丸陜西郝其軍制藥有限責(zé)任公司每丸0.2g醋酸潑尼松片每片5mg地塞米松天津天藥藥業(yè)股份有限公司每片0.75mg硫唑嘌呤片浙江奧托康制藥集團(tuán)股份有限公司每片50mg靜脈注射用人免疫

9、球蛋白武漢瑞德生物制品有限責(zé)任公司、北京天壇生物制品股份有限公司有效成分igg含量為50g/l特比澳（rhtpo）與吉巨芬（il-11）兩種藥物的細(xì)化對(duì)比特比澳耐受性試驗(yàn)特比澳耐受性試驗(yàn)-單次給藥單次給藥參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào) 2004 262004 26（4 4）:437-41:437-41減少血小板數(shù)恢復(fù)所需天數(shù)已實(shí)現(xiàn)商品化的藥物（特比澳）存在的問題已實(shí)現(xiàn)商品化的藥物（特比澳）存在的問題偶有發(fā)熱、肌肉酸痛等；生產(chǎn)工藝復(fù)雜；終產(chǎn)物價(jià)格昂貴，多數(shù)階層患者難以承受。第1代tpo相關(guān)分子聚乙二醇化重組人巨核細(xì)胞生長衍生因子，具有免疫原性，故而終止試驗(yàn)。 分離提取工藝方面； 生物活性的保證； 適當(dāng)降低所需成本； 最優(yōu)化治療劑量、療程的探討。葛蘭素史克公司正在研發(fā)的產(chǎn)品第二代tpo分子promacta，是口服非肽類血小板生成素受體激動(dòng)劑，臨床前和前兩期臨床研究顯示本品可升高血小板數(shù)目。 其他