臨床免疫學(xué)和免疫檢驗沉淀反應(yīng)講義

1、第六章沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在特定條件下發(fā)生特異性結(jié)合時出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。第一節(jié)沉淀反應(yīng)的特點沉淀反應(yīng)中的抗原多為蛋白質(zhì)、多糖、血清、毒素等可溶性物質(zhì)。沉淀反應(yīng)分兩個階段，第一階段為抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合，幾秒到幾十秒即可完成，出現(xiàn)可溶性小的復(fù)合物，肉眼不可見; 第二階段為形成可見的免疫復(fù)合物，約需幾十分鐘到數(shù)小時才能完成，如沉淀線、沉淀環(huán)。第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗一、絮狀沉淀試驗受抗原和抗體比例的直接影響抗原抗體溶液在電解質(zhì)的存在下結(jié)合，形成絮狀沉淀物，這種絮狀沉淀 因此常用來作為測定抗原抗體反應(yīng)最適比例的方法，常見類型有:（一）抗原稀釋法（二）抗體稀釋法（三）方陣滴定法抗原進行

2、一系列稀釋與恒定濃度抗血清反應(yīng)。 抗體進行一系列稀釋與恒定濃度抗原反應(yīng)。 方陣滴定法即棋盤滴定法。二、免疫濁度測定屬于液體內(nèi)沉淀反應(yīng)，其特點是將現(xiàn)代光學(xué)測量儀器與自動化檢測系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，可進 行液體中微量抗原、抗體及小分子半抗原定量檢測。（一）免疫比濁測定的影響因素1. 抗原抗體的比例 是濁度形成的關(guān)鍵因素。當抗原過量時，形成的IC分子小，而且會發(fā)生再解離，使?jié)岫确炊陆担馍⑸湟鄿p少，這就是高劑量鉤狀效應(yīng)。當抗體過量時，IC的形成隨著抗原遞增而增加，至抗原、抗體最適比例處達最高峰，這就是 經(jīng)典的海德堡曲線理論。在反應(yīng)體系中保持抗體適當過量，如形成抗原過量則造成測定的準確性降低。2

3、. 抗體的質(zhì)量 對免疫比濁測定法的抗體要求（1）特異性強（2）效價高（3） 親和力強：則抗體的活性高，不僅可以加快抗原抗體反應(yīng)的速度，而且形成的IC較牢固，不易 發(fā)生解離。在速率比濁法中尤為重要。（4） R型和H型抗體：根據(jù)抗血清來源的動物種類不同，分為R型抗體和H型抗體。R型抗體是指以家兔為代表的小型動物 被注射抗原免疫后制備的抗血清。這類抗血清的特點是 親和力較強，抗原抗體結(jié)合后不易發(fā)生解離。H型抗體是指以 馬為代表的大型動物 注射抗原后制備的抗血清, 這類抗血清的 親和力弱，抗原抗體結(jié)合 后極易解離。3. 抗原抗體反應(yīng)的溶液反應(yīng)液最適pH為6.58.5，否則不易形成IC,甚至可引起IC解

4、離。在一定范圍內(nèi)，離子強度大，IC形成越快；離子的種類也可影響IC的形成。一般常使用 磷酸鹽緩沖液 作為免疫比濁法的反應(yīng)液。4. 增濁劑某些非離子型親水劑對促進IC的形成有顯著的增強作用，如聚乙二醇（PEG、吐溫-20，其作用是消 除蛋白質(zhì)（抗原或抗體）分子周圍的電子云和水化層，促進抗原、抗體分子靠近，結(jié)合形成大分子復(fù)合物。（二）免疫比濁法方法分類1. 透射免疫比濁法 通過檢測光被吸收、衍射、反射和折射后光線減弱的變化，來定量抗原抗體的復(fù)合物。2. 免疫膠乳比濁法 是以膠乳作為載體 對小分子免疫復(fù)合物進行微量測定，進一步提高了免疫濁度測定 的靈敏度。3. 散射免疫比濁法通過檢測光折射和衍射而形

5、成的散射光強度來定量抗原抗體的復(fù)合物。該法根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的時間和反應(yīng)結(jié)合的動力學(xué)，又可分為終點散射比濁法、固定時間散射比濁法和速率散射比濁法。（三）免疫比濁法應(yīng)用血液、體液中蛋白質(zhì)的測定如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、補體C3補體C4血漿蛋白（前白蛋白、a -抗胰蛋白酶、a -酸性糖 蛋白、a 2-巨球蛋白、血漿銅藍蛋白、結(jié)合球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白）。尿微量蛋白系列和半抗原（如激素、毒 物和各種治療性藥物）。（四）免疫比濁法優(yōu)點1. 穩(wěn)定性好2. 敏感度高（達ng/L ）3. 精確度高（CVk 5%4. 簡便快速，易于自動化5. 無放射性核素污染，適合于大批量標本的檢測第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗利用

6、可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠內(nèi)擴散，形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán) 。3. 每次測定時必須用質(zhì)控血清作質(zhì)控。4. 注意雙環(huán)現(xiàn)象（出現(xiàn)了兩種抗原性相同成分）。二、雙向擴散試驗雙向擴散試驗是讓抗原和抗體在瓊脂中各自向?qū)Ψ綌U散，在比例恰當之處形成沉淀線，沉淀線的位置、 形狀以及對比關(guān)系，可對抗原或抗體進行定性分析。雙向擴散試驗簡單易行，用途廣泛，但該技術(shù)靈敏度低，出現(xiàn)結(jié)果慢，不能精確定量，這些弱點在相當程度上限制了它的應(yīng)用。根據(jù)試驗形式可分為試管法和平板法兩種。（一）試管法（二）平板法 是鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一。根據(jù)沉淀線的有無、形態(tài)和位置可作

7、如下分析：1. 抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計（1）沉淀線如果靠近抗原孔，則表示抗體含量較大；（2）沉淀線如果靠近抗體孔，則表示抗原含量較大；（3） 不出現(xiàn)沉淀線則表明無對應(yīng)的抗體（抗原）或者抗原過量。2. 抗原或抗體相對分子量的分析（1） 抗原或抗體在瓊脂內(nèi)自由擴散，其速度受分子量的影響。分子量小者擴散快，反之則較慢。（2） 由于慢者擴散圈小，局部濃度則較大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方 ；如果兩者分子量大致 相等，則形成直線。- OAbO +j Ab-O 12*|q3. 抗原性質(zhì)的分析（1） 兩條沉淀線互相吻合相連 ，表明抗體與兩個抗原中的相同表位結(jié)合而沉淀，兩個抗原相同；（2）

8、沉淀線呈部分 相切，說明兩個抗原之間有 部分相同；（3）兩條沉淀線交叉而過，說明兩個抗原完全不同。制怙O0何AL 1H同瀘案全不同oo知親©as分相伺雙簡免疫擴敬試驗4. 抗體效價的滴定雙向擴散試驗是抗血清抗體效價滴定的常規(guī)方法。固定抗原的濃度，稀釋抗體；或者抗原和抗體雙方 皆作不同的稀釋，經(jīng)過自由擴散，形成沉淀線，以出現(xiàn)沉淀線最高的抗體稀釋度為該抗體的效價。5. 抗原或抗體純度鑒定用混合抗原或抗體鑒定抗體或抗原，出現(xiàn)一條沉淀線說明待測抗原或抗體純，出現(xiàn)多條沉淀線說明不純。雙向擴散試驗簡單易行，用途廣泛，但該技術(shù)靈敏度低，出現(xiàn)結(jié)果慢，不能精確定量，這些弱點在相 當程度上限制了它的應(yīng)用

9、。第四節(jié)免疫電泳技術(shù)電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。一、優(yōu)點（一）加快了沉淀反應(yīng)的速度；（二）電場規(guī)定了抗原抗體的擴散方向，使其集中，提高了靈敏度；（三）可將某些蛋白組分根據(jù)其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)。本法既具有抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，又具有電泳技術(shù)的高分辨率和快速、微量等特性，因此其應(yīng) 用范圍日益擴大。隨著實驗技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫電泳技術(shù)逐步發(fā)展為對流免疫電泳、火箭免疫電泳、免 疫電泳、免疫固定電泳等多項實驗技術(shù)，廣泛用于科學(xué)研究和臨床實驗診斷分析。二、對流免疫電泳 雙向免疫擴散與電泳相結(jié)合的定向加速的免疫擴散技術(shù)。在pH8.6緩沖液中，大多蛋白質(zhì)帶強負電荷，在電場中向正極移

10、動；而IgG等電點偏高（pH67）,在pH8.6時帶負電荷較少，且分子量較大，移動速度慢，故向正極移動緩慢甚至不移動。在凝膠的電滲作用下，隨水流向負極，電滲引向負極移動的液流速度超過了IgG向正極的移動速度，因此抗體移向負極，在抗原抗體最適比處形成沉淀線。IgG作為蛋白質(zhì)在電泳中比較特殊，4個亞型有不同的表現(xiàn)，IgG3和lgG4與一般蛋白質(zhì)無異，泳向正 極,而IgGI和IgG2則因其帶電荷少，受電滲的作用力大于電泳，所以被水分子挾裹向負極移動。這就形成 了 igG的特殊電泳形式：一部分泳向正極，另一部分泳向負極，在抗體孔兩側(cè)都有抗體存在，因此所謂對 流只是部分IgG的電滲作用所致三、火箭免疫電

11、泳單向免疫擴散與電泳相結(jié)合的一項定量檢測技術(shù)，實質(zhì)上是 加速的單向擴散試驗。實驗時，將抗體混合于瓊脂中，樣品孔中的抗原置于負極端，電泳時抗體不移動，抗原向正極泳動，隨著抗原量的逐漸減少， 抗原泳動的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個形狀如火箭的不溶性 復(fù)合物沉淀峰。當瓊脂中抗體濃度固定時，峰的高度與抗原量呈正相關(guān)，因此用已知標準抗原作對照，抗原濃度為橫 坐標，峰的高度為縱坐標，繪制標準曲線，待測樣品濃度就可根據(jù)沉淀峰的高度在標準曲線中計算獲得。火箭電泳作為抗原定量只能測定Pg/ml以上的含量，如低于此水平則難以形成可見的沉淀峰。加入少量125I標記的標準抗原共同電

12、泳，則可在含抗體的瓊脂中形成不可見的火箭峰，經(jīng)洗滌干燥后，用X線膠片顯影，可出現(xiàn)放射顯影，這就是目前采用的免疫自顯影技術(shù)，根據(jù)自顯影火箭峰降低的程度（競爭法）可 計算出抗原的濃度。免疫自顯影技術(shù)可測出ng/ml的抗原濃度。+四、免疫電泳區(qū)帶電泳與免疫雙擴散相結(jié)合的一種免疫分析技術(shù)，為定性試驗。先用區(qū)帶電泳 技術(shù)將抗原在凝膠中電泳，分成肉眼不可見的若干區(qū)帶，電泳停止后，沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清，置室溫37C作雙向擴散，經(jīng)1824小時后，已分離成區(qū)帶的各種抗原成分與抗體槽中相應(yīng)抗體在兩者比例 適合處形成弧形沉淀線。免疫電泳所需 擴散時間長，沉淀線的數(shù)目和分辨率又受許多因素影響

13、，且結(jié)果較難分析，必須積累經(jīng)驗，才能作出恰當?shù)慕Y(jié)論。免疫電泳為 定性試驗，目前主要應(yīng)用于 純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常免疫球蛋白的識別與 鑒定方面，例如多發(fā)性骨髓瘤患者血清在免疫電泳后，可觀察到異常的M蛋白沉淀弧。五、免疫固定電泳可用于各種蛋白質(zhì)的鑒定。該方法原理是先將待檢樣品在凝膠板上作區(qū)帶電泳，將蛋白質(zhì)分離成不同區(qū)帶，然后在 其上覆蓋抗血清，當抗血清與某區(qū)帶中的單克隆免疫球蛋白結(jié)合，便形成抗原抗體復(fù)合物而 沉淀。最后通過漂洗和染色，并與蛋白質(zhì)參考泳道對照分析，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進行分型。本法可用于遷移率近似的蛋白和M蛋白的鑒定與分型，免疫球蛋白輕鏈，尿液中的本-周蛋白檢測及

14、K、入分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測及分型，鑒定游離輕鏈，補體裂解產(chǎn)物等。免疫固定電泳最大的優(yōu)勢是分辨率強，敏感度高，操作周期短，僅需數(shù)小時，結(jié)果易于分析。六、交叉免疫電泳將區(qū)帶電泳和火箭免疫電泳相結(jié)合的免疫電泳分析技術(shù)。是一種有效的抗原蛋白定量技術(shù)，可一次同時對多種抗原定量。分辨率較高，有利于各種蛋白組分的 比較，對于蛋白質(zhì)遺傳多態(tài)性、微小異質(zhì)性、蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物和不正常片段等進行定性分析。（14題共用答案）A. 帶現(xiàn)象B. 前帶C. 后帶D. 等價帶E. 拖尾現(xiàn)象1. 沉淀反應(yīng)中抗原過量的現(xiàn)象稱為正確答案C答案解析沉淀反應(yīng)中抗原過量的現(xiàn)象稱為后帶。2. 沉淀反應(yīng)中抗體過量的現(xiàn)象稱為正確答案B

15、答案解析沉淀反應(yīng)中抗體過量的現(xiàn)象稱為前帶。3. 沉淀反應(yīng)的反應(yīng)曲線中，抗原抗體分子比例合適的范圍稱為正確答案D答案解析沉淀反應(yīng)的反應(yīng)曲線中，抗原抗體分子比例合適的范圍稱為等價帶。4. 沉淀反應(yīng)的反應(yīng)曲線中，抗原或抗體極度過剩而引起無沉淀物形成的現(xiàn)象稱為正確答案 A答案解析沉淀反應(yīng)的反應(yīng)曲線中，抗原或抗體極度過剩而引起無沉淀物形成的現(xiàn)象稱為帶現(xiàn)象。沉淀反應(yīng)的抗原是A. 顆粒性抗原B. 可溶性抗原C. 半抗原D. 超抗原E. 致敏抗原正確答案B答案解析沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在特定條件下發(fā)生特異性結(jié)合時出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。關(guān)于免疫濁度法測定錯誤的是A. 反應(yīng)液中抗體過量B. 反應(yīng)液中抗原過量C

16、. 反應(yīng)液中抗原、抗體比例合適D. 常用聚乙二醇等增濁劑E. 通常用磷酸鹽反應(yīng)液正確答案B答案解析當抗原過量時，形成的IC分子小，而且會發(fā)生再解離，使?jié)岫确炊陆?，光散射亦減少,這就是高劑量鉤狀效應(yīng)。下列有關(guān)沉淀反應(yīng)第一階段的說法，錯誤的是A. 抗原抗體的特異性結(jié)合B. 幾秒鐘至幾分鐘內(nèi)即完成C. 可用散射比濁測定反應(yīng)結(jié)果D. 出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)E. 肉眼見不到免疫復(fù)合物正確答案D答案解析沉淀反應(yīng)分兩個階段，第一階段為抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合，幾秒到幾十秒即可完成， 出現(xiàn)可溶性小的復(fù)合物，肉眼不可見；第二階段為形成可見的免疫復(fù)合物，約需幾十分鐘到數(shù)小時才 能完成，如沉淀線、沉淀環(huán)。免疫

17、沉淀反應(yīng)A. 常用于顆粒性抗原檢測B. 抗原抗體的結(jié)合瞬間肉眼可見C. 用于可溶性抗原的檢測D. 不能用于定量檢測E. 可不考慮抗原抗體的比例正確答案C答案解析免疫沉淀反應(yīng)用于可溶性抗原的檢測。關(guān)于單向擴散實驗錯誤的是A. 需先將抗原混入瓊脂內(nèi)B. 有試管法和平板法C. 需先將抗體混入瓊脂內(nèi)D. 可用于定量檢測E. 抗原抗體的比例合適處形成沉淀環(huán)正確答案 A答案解析單向擴散試驗是在瓊脂內(nèi)混入抗體，待測抗原從局部向瓊脂內(nèi)自由擴散，如抗原和相應(yīng) 抗體結(jié)合，則形成沉淀環(huán)。有試管法和平板法。通過觀察雙向瓊脂擴散試驗的結(jié)果，不能解決的問題是A. 是否存在相應(yīng)的抗原或抗體B. 抗原和抗體相對含量的估計C.

18、 抗原和抗體相對分子量的分析D. 判斷兩種抗原的性質(zhì)是否相同E. 抗體濃度的確定正確答案E答案解析雙向擴散試驗是讓抗原和抗體雙方都在瓊脂中各自向?qū)Ψ綌U散，在比例恰當之處形成抗 原抗體沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對比關(guān)系，可對抗原或抗體進行定性分析。根據(jù)試 驗形式也可分為試管法和平板法兩種。（一）試管法（二）平板法 是鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一。根據(jù)沉淀線的有無、形態(tài)和位置可 作如下分析：1. 抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計。2. 抗原或抗體相對分子量的分析。3. 抗原性質(zhì)的分析。4. 抗體效價的滴定。5. 抗原或抗體純度鑒定。免疫電泳的影響因素不包括A. 電場強度

19、B. 溶液pHC. 離子強度D. 抗體純度E. 電滲正確答案D答案解析免疫電泳的影響因素不包括抗體純度。單向擴散試驗時錯誤的是A. 將一定量的抗體混入瓊脂中B. 每次測定必須做標準曲線C. 不必每次測定都做標準曲線D. 將抗原加入所打的孔中E. 2448小時看結(jié)果正確答案C答案解析單向擴散試驗時錯誤的是：不必每次測定都做標準曲線。雙向瓊脂擴散試驗中，若抗原的含量比抗體多且分子量比抗體小，則沉淀線應(yīng)為A. 靠近抗原孔，且弧線彎向抗原側(cè)B. 靠近抗原孔，且弧線彎向抗體側(cè)C. 靠近抗體孔，且弧線彎向抗原側(cè)D. 靠近抗體孔，且弧線彎向抗體側(cè)E. 居于抗原抗體孔中間，且弧線彎向抗原側(cè)正確答案D答案解析沉

20、淀線的形成是根據(jù)抗原抗體兩者比例所致，沉淀線如果靠近抗原孔，則表示抗體含量 較大；沉淀線如果靠近抗體孔，則表示抗原含量較大；不出現(xiàn)沉淀線則表明無對應(yīng)的抗體或抗原或者 抗原過量?？乖蚩贵w相對分子量的分析抗原或抗體在瓊脂內(nèi)自由擴散，其速度受分子量的影響。分子量小者擴散快，反之則較慢。由于慢者擴散圈小，局部濃度則較大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方； 如果兩者分子量大致相等，則形成直線。雙擴平板法測量兩種不相關(guān)成分的抗原時，沉淀線A. 二條直線相交叉B. 二條弧線完全融合 C二條弧線部分融合D. 二條弧線不連接E. 二條直線平行正確答案 A答案解析抗原性質(zhì)的分析兩種受檢抗原的性質(zhì)可完全相同、部分相

21、同或完全不同。三種情況在雙向擴散試驗中表現(xiàn)如下：兩條沉淀線互相吻合相連，表明抗體與兩個抗原中的相同表位結(jié)合而沉淀， 兩個抗原相同；沉淀線呈部分相切，說明兩個抗原之間有部分相同；兩條沉淀線交叉而過，說明兩個 抗原完全不同。雙擴平板法出現(xiàn)多條沉淀線的原因是A. 抗原過剩B. 抗體過剩C. 抗原缺乏D. 抗體缺乏E. 抗原或抗體不純正確答案E答案解析抗原或抗體純度鑒定用混合抗原或抗體鑒定抗體或抗原，出現(xiàn)一條沉淀線說明待測抗原或抗體純，出現(xiàn)多條沉淀線說明不純。Fahey曲線適用于A. 小分子抗原，長時間擴散（48小時）B. 小分子抗原，短時間擴散（24小時）C. 大分子抗原，長時間擴散（48小時）D. 大分子抗原，短時間擴散（24小時）E. 小分子抗原，無時間擴散正確答案B答案解