植物遺傳改良講義稿

1、植物分子育種第一章 植物分子育種技術(shù)概論常規(guī)育種雖然在農(nóng)作物產(chǎn)量提高和品質(zhì)改良方面取得了很大成績(jī)，但它存在著局限性：一是遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移難以突破生物學(xué)隔離的障礙，使優(yōu)良種質(zhì)資源的利用受到限制;二是由于基因連鎖的困擾，又不易收到理想的育種效果。近年來迅速發(fā)展的生物技術(shù)，特別是分子水平的生物技術(shù)，在提高作物產(chǎn)量，改善品質(zhì)，增強(qiáng)抗病蟲和抗逆能力等方面展示了誘人的燦爛前景第一節(jié) 植物分子育種的概念和特點(diǎn)一、植物分子育種的概念 植物分子育種是近代開創(chuàng)的育種新途徑，大量實(shí)踐證明我國在這方面取得了重要進(jìn)展。 分子育種是指分子水平生物技術(shù)在植物育種上的應(yīng)用。中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所周光宇研究員指出，植物分子

2、育種可概括為兩個(gè)層次的工程技術(shù)：1.將帶有目的性狀基因的供體總dna片段導(dǎo)入欲改良的植物受體細(xì)胞，使其后代發(fā)生變異，從中篩選出獲得目的性狀的后代或符合需要的有價(jià)值的新類型，培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性強(qiáng)的新品種。2分離目的基因，構(gòu)建重組分子，導(dǎo)入需要改良的植物受體細(xì)胞，經(jīng)過培育，篩選出獲得了目的性狀，且綜合性狀優(yōu)良的后代，育出新品種。 狹義的分子育種指的是第一層次的分子育種。二、植物分子育種的特點(diǎn) 1.遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移突破生物學(xué)隔離的障礙打破物種分類的界限，充分利用自然界豐富的遺傳資源，使遺傳物質(zhì)能在不同植物間，甚至在植物，動(dòng)物和微生物之間進(jìn)行交流，從而充分活化各物種的遺傳基礎(chǔ)，為創(chuàng)造新的生命類型奠定

3、廣泛的基礎(chǔ)2.無需經(jīng)過細(xì)胞、原生質(zhì)體離體培養(yǎng)（甚至不需離體培養(yǎng)）(針對(duì)狹義的分子育種來說) 利用整體植株的特定細(xì)胞進(jìn)行外源dna或基因的轉(zhuǎn)移，如卵細(xì)胞、受精卵或早期胚細(xì)胞，抑或幼胚，幼苗、芽叢分裂旺盛的細(xì)胞，它們隨著整體生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)程而完成外源dna或基因的導(dǎo)入、整合與轉(zhuǎn)化過程。無需經(jīng)過細(xì)胞、原生質(zhì)體離體培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)，形成再生株植等一系列繁瑣復(fù)雜的培養(yǎng)流程。3適應(yīng)面廣: 單子葉、雙子葉植物均可運(yùn)用這項(xiàng)技術(shù)達(dá)到品種創(chuàng)新與改良的育種效果。4與常規(guī)育種相比，育種時(shí)間明顯縮短，一般只需34代各選系便可穩(wěn)定。5方法簡(jiǎn)便: 室內(nèi)外(大田、盆栽場(chǎng)、溫室等)均可進(jìn)行，常規(guī)育種工作者易于掌握。第二節(jié) 植物分子

4、育種的產(chǎn)生與發(fā)展一.問題的提出 吉林農(nóng)民李貞生培育出的玉米稻（水稻×玉米）50年代 雜種玉米稻未見父本的外觀性狀；從染色體的形態(tài)特征、數(shù)目和組型分析來看，均與母本水稻相同； 但無可否認(rèn)地出現(xiàn)了一些明顯的變異：如植株高、穗大、粒大，抗逆性(耐寒，耐旱)強(qiáng)、產(chǎn)量提高，而且這些變異還 可以遺傳下去。后來發(fā)現(xiàn)在以高梁、甘蔗和蘆葦作父本，而以水稻作母本的遠(yuǎn)緣雜交實(shí)驗(yàn)中，也獲得了類似的結(jié)果：即后代的外觀特點(diǎn)與母本水稻一致，但也或多或少顯露出一部分遠(yuǎn)緣的遺傳信息在遺傳育種界對(duì)此尚存在學(xué)術(shù)觀點(diǎn)不一的爭(zhēng)論：有人持否定態(tài)瘦，認(rèn)為玉米稻不可能是雜交種，把所出現(xiàn)的變異歸咎于母本不純，或純屬自發(fā)變異。也有人認(rèn)

5、為變異是由玉米花粉物質(zhì)刺激作用；甚至還有人認(rèn)為玉米稻要長(zhǎng)出玉米棒子才算是真正的雜種二.dna片段雜交假說及其分子驗(yàn)證 1974年，周光宇多次對(duì)糧食等作物遠(yuǎn)緣雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)地調(diào)查。 要點(diǎn)：（1）認(rèn)為就整體分子而言，遠(yuǎn)緣親本間的染色體結(jié)構(gòu)是不親和的，容易相互排斥；（2）根據(jù)進(jìn)化的觀點(diǎn)，局部dna分子部分基因間的結(jié)構(gòu)有可能保持一定的親和性；因而遠(yuǎn)緣dna片段有可能進(jìn)入受體細(xì)胞，并在母本dna復(fù)制過程中，這種dna片段便與受體基因組相應(yīng)區(qū)段整合。周光宇提出了“dna片段雜交”假說，并應(yīng)用同工酶和分子雜交等技術(shù)對(duì)祖德明等培育的高梁稻及其親本材料進(jìn)行了分析，使這一假說得到了分子驗(yàn)證。分子驗(yàn)證： 酯酶同工酶

6、分析 在高梁稻(銀坊×亨加利)及其親本酯酶同工酶分析研究中發(fā)現(xiàn)一條與高梁相同而銀坊(母本)沒有的酶帶，說明高梁稻中的這條酶帶來自父本高梁； 分子雜交 取父本高梁dna與母本水稻dna進(jìn)行分子雜交，除去兩者的同源序列，以其余的高梁dna順序制備探針，與高梁稻dna進(jìn)行分子雜交，發(fā)現(xiàn)高梁稻dna中存在高梁的同源序列，此即說明高梁dna片段已整合了高粱稻的基因組中； 復(fù)性動(dòng)力學(xué)分析 在對(duì)高梁稻及其兩親本的重復(fù)順序dna復(fù)性動(dòng)力學(xué)分析研究中，發(fā)現(xiàn)高粱稻基因組的中度重復(fù)順序部分與母本水稻有差異，從而進(jìn)一步說明這是由于父本高梁dna整合于母本水稻基因組而造成的結(jié)果。第三節(jié) 外源dna導(dǎo)入育種技術(shù)

7、的探索一、花粉管通道技術(shù)（周光宇，1978）花粉管通道技術(shù)的關(guān)鍵：在于外源dna(不小于106107u)可以方便地利用植物開花授粉后天然的花粉管通道進(jìn)入胚囊，與受精卵或其前后的細(xì)胞相接觸。機(jī)理：1、這類細(xì)胞在此時(shí)尚不具備細(xì)胞壁，有如原生質(zhì)體，能夠吸收dna；2、受精后各種生命活動(dòng)十分旺盛，細(xì)胞dna與rna的合成很活躍 此時(shí)，外源dna片段的結(jié)構(gòu)、功能與受體基因組及其代謝有一定相容性時(shí)，就有可能被整合進(jìn)入受體基因組，并且可能表達(dá)和遺傳?；ǚ酃芡ǖ兰夹g(shù)可用于單子葉或雙子葉的任一開花植物這項(xiàng)技術(shù)于1978年開始在棉花和水稻上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；如棉花在自花授粉24h后，從子房頂端注入dna；水稻則在自花授粉

8、1 3h將dna溶液滴入切去柱頭的花柱切口處 轉(zhuǎn)化成株率一般達(dá)到1 10 % 。二、花粉管通道技術(shù)的分子驗(yàn)證 1缺口翻譯技術(shù)驗(yàn)證。 以3h標(biāo)記海島棉“416” dna分子(50kb)，于自花授粉后24h，用50l微量注射器向受體(岱字棉濾選204)子房注射10l 3h-dna。 綜合分析表明，花粉管道是外源dna進(jìn)入受體的惟一通道：外源dna經(jīng)過天然的花粉管通道而進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化種胚細(xì)胞。 2通過不同克隆的基因或特異dna片段的導(dǎo)入進(jìn)行分子驗(yàn)證。 翁堅(jiān)等應(yīng)用m13(mp7)與受體重復(fù)順序重組分子導(dǎo)入海島棉，至胚發(fā)育60d，取成熟種，提取dna，以32p標(biāo)記m13(mp7)制備探針。 從south

9、ern blot的sau 3a酶切圖譜上證明通過花粉管通道技術(shù)，mp7dna已整合進(jìn)入受體基因組，而未經(jīng)外源dna導(dǎo)入的海島棉dna對(duì)照中未測(cè)出mp7的同源dna。、3質(zhì)粒與受體共同順序重組驗(yàn)證。 應(yīng)用質(zhì)粒pne0105(kan，能在植物中表達(dá))與受體的共同順序(重復(fù)順序)重組后導(dǎo)入棉花與水稻，子代出現(xiàn)了卡那霉素耐性明顯高于受體的植株。在水稻中巳測(cè)出強(qiáng)的卡那霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的活力同時(shí)還在southern blot圖片上顯示出卡那霉素抗性基因的雜交條帶，證明外源基因?qū)氤晒?，第四?jié) 植物分子育種的興起與發(fā)展據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國約有21個(gè)省市，40個(gè)以上的實(shí)驗(yàn)室開展這方面的研究，優(yōu)質(zhì)，高產(chǎn)，抗病，抗逆的優(yōu)良

10、新品種和新品系不斷涌現(xiàn)，顯示出巨大的生產(chǎn)力效應(yīng)。從70年代中期到90年代末，分于育種經(jīng)歷了20余年的艱苦探索。這期間，一共召開了3次植物分子育種學(xué)術(shù)討論會(huì)，分子學(xué)、分子遺傳學(xué)和作物育種學(xué)的專家們匯聚一堂，總結(jié)交流經(jīng)驗(yàn)、切磋技藝、共商發(fā)展，使植物分子育種事業(yè)進(jìn)入了新階段，總的來說，植物分子育種第一層次的技術(shù)，即帶目的性狀的外源dna導(dǎo)入技術(shù)，目前已為廣大育種家們所接受，它克服了常規(guī)育種的局限性，打破了物種隔離的障礙，縮短了育種時(shí)間，為生產(chǎn)提供了一批優(yōu)良品種。第五節(jié) 植物分子育種與作物遺傳改良育種實(shí)踐證明，育種上要有新突破，目前必須抓住兩項(xiàng)工作：廣泛搜集有益的種質(zhì)資源，并加以利用。 育種方法上進(jìn)一

11、步革新。20余年的實(shí)踐證明分子育種與常規(guī)育種緊密結(jié)合，相輔相成，使作物遺傳改良的研究登上了新臺(tái)階，優(yōu)良新品種層出不窮。以下簡(jiǎn)要介紹這方面的研究成果。一、增強(qiáng)抗性1.抗病（1）棉花 棉花病害，特別是枯萎病、黃萎病等毀滅性病害，常常給生產(chǎn)帶來巨大的損失，由于豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗病等性狀之間往往存在負(fù)相關(guān)，常規(guī)育種難以打破這一局面，采用分子育種法可以逾越這一障礙，創(chuàng)造極豐富的變異來源，為農(nóng)作物抗病育種開辟了一條新途徑 黃駿麒等 以海島棉7124作供體，陸地棉910l為受體，將前者dna導(dǎo)入后者，選育出新品系3118，高抗枯萎病，并耐黃萎病，中早熟，生育期l20d左右；在抗病性鑒定中表現(xiàn)高抗枯萎病，其枯萎病

12、病指明顯低于受體，與供體相近。3118棉不僅抗病性強(qiáng)而且生產(chǎn)潛力也不錯(cuò)。在江蘇和上海大面積示范種植，表現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)，一般比當(dāng)?shù)貙?duì)照品種增產(chǎn)10以上。于元杰等 以魯棉6號(hào)為受體，將羅布麻的dna用微量注射器從幼鈴頂端縱軸向下插入胎座約0.5cm處，每鈴注10uldna，經(jīng)過各項(xiàng)鑒定和檢測(cè)分析，獲得一系列優(yōu)良的變異系如種質(zhì)系91003，不僅表現(xiàn)高產(chǎn)、纖維品質(zhì)好，而且在歷年棉花枯萎病鑒定中，顯示出良好的抗性比推廣的抗病品種中棉12號(hào)抗病性強(qiáng)另外，于元杰等還以紅麻為供體，將其dna導(dǎo)入魯棉6號(hào)，從變異后代中選育出優(yōu)質(zhì)、抗病優(yōu)質(zhì)系91006，不僅品質(zhì)優(yōu)、豐產(chǎn)性好，而且也具有較強(qiáng)的擾棉枯萎病的能力。（2）小麥

13、小麥白粉病對(duì)生產(chǎn)的危害也很嚴(yán)重從小麥資源來看，缺乏抗白粉病的親本。閻新甫、劉文軒（從1988年開始）應(yīng)用花粉管通道法將抗白粉病的二棱大麥總dna導(dǎo)入小麥感病品種花76(農(nóng)藝性狀好)。研究發(fā)現(xiàn)：d1代便出現(xiàn)了277的高抗白粉病變異株；d2代有5個(gè)株系的抗性已經(jīng)穩(wěn)定。d3和d4代作病菌接種鑒定，表現(xiàn)高抗0、1、11和15號(hào)小麥白粉病優(yōu)勢(shì)小種。通過侵染型基因測(cè)定，表明所獲得的抗自粉病基因與小麥中已知的定名抗性基因完全不同，而與大麥的抗白粉病基因一致。于元杰等 采用牛胸腺dna，小麥異屬植物披堿草(高抗白粉病和銹病)、小麥品種京花1號(hào)(無芒，中抗白粉病和條銹病)等材料作供體，取其dna分別導(dǎo)入受體普通

14、小麥品系814527。該品系豐產(chǎn)性較好，但中度感染條銹病和白粉病。經(jīng)過培育與選擇從不同組合中分別選出了既豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，又抗病的品系。 例如d041新種質(zhì)系，以小麥841527為母體，導(dǎo)入牛胸腺dna，從其變異后代中經(jīng)系譜法選育而成d041不僅早熟，而且高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)，同時(shí)高抗條銹病和干熱風(fēng)。 d259為另一優(yōu)良選系，其受體仍為814527，供體為京花1號(hào)dna。此選系品質(zhì)優(yōu)，蛋白質(zhì)和較氨酸含量均高，前者14%以上，后者0.36。突出的特點(diǎn)是高抗條銹病，葉銹病和白粉病，此外還能抗旱 在以披堿草dna導(dǎo)入814527的后代中也選育出高抗條銹病的新品系d1704。 倪建福等應(yīng)用花粉管通道技術(shù)將長(zhǎng)穗偃麥草總體

15、dna直接導(dǎo)入小麥甘麥8號(hào)，獲得了具有供體性狀的后代其中就抗條銹病田間鑒定來看，d2選出兩個(gè)變異株系，共57個(gè)單株，除1個(gè)單株感染條銹外，其余56株均表現(xiàn)高抗或免疫。（3）水稻稻瘟病和白葉枯病是危害水稻生產(chǎn)最普遍和最嚴(yán)重的病害。陳善葆、段曉嵐等（于1987年）利用花粉管通道技術(shù)將抗白葉枯病水稻品種早生愛國3號(hào)和矢祖的dna導(dǎo)入受體856403等11個(gè)粳稻感病品種，共獲得種子671粒次春播種，其中有9個(gè)受體的13個(gè)組合長(zhǎng)成d1代233株。這項(xiàng)研究充分說明供體的抗白葉枯病和其他性狀基因，在受體于代中得到了整合、表達(dá)和穩(wěn)定遺傳。黃興奇等 以抗稻瘟病的陸稻品種勐旺谷、云南藥用野生稻和燕麥作供體，采用孕

16、穗期莖注射法，將上述各種供體的dna分別導(dǎo)入水稻感病品種西南175，獲得了一批性狀變異，并能穩(wěn)定傳的后代。 在所歸類的19個(gè)材料中，經(jīng)多次鑒定、篩選，共選出7個(gè)稻瘟病抗性株系。 2.抗逆性農(nóng)作物經(jīng)常受到各種不利因素如鹽堿，干旱，水澇、寒冷及特殊金屬離子的威脅，一般情況下造成減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)顆粒無收。因而選育對(duì)不良環(huán)境具有特殊抵抗能力的新品種具有十分重要的意義。 植物分子育種有利于解決上述問題。 （1）水稻 李遭遠(yuǎn)等 利用廣西藥用野生稻gxl722、gxl723、gxl686、gxl838和普通野生稻gx0803作供體，以不同類型的栽培稻品種(秈釉稻工11個(gè)，粳稻1個(gè))作受體，應(yīng)用花粉管通道技術(shù)將藥

17、用野生稻dna導(dǎo)入栽培稻。選育出糯稻桂d1號(hào)，耐旱，耐瘠，苗期抗寒，成熱期抗早衰產(chǎn)量高，現(xiàn)已大面積推廣。（2）小麥 于元杰等 應(yīng)用浸滴法將小麥供體京花l號(hào)dna導(dǎo)入受體814527品系，通過系譜法育成d259品系該小麥品系分蔡性強(qiáng)、長(zhǎng)勢(shì)旺、抗逆性強(qiáng)，對(duì)肥反應(yīng)敏感；高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病，抗干旱，在未澆水的早地試種，表現(xiàn)良好（3）棉花 吳小月應(yīng)用授粉后外源dna導(dǎo)入技術(shù)將中棉常熱黑子的dna導(dǎo)入受體陸地棉品種岱紅岱，成功地育成了一個(gè)高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)，吐絮集中、抗逆性強(qiáng)、耐潰澇并耐枯萎病的棉花新品種湘棉12號(hào)，1989年已通過湖南省晶種審定。 于元杰等 在棉花分子育種研究中將羅布麻dna導(dǎo)入魯棉6號(hào)，育成抗蟲

18、，抗鹽種質(zhì)系91015經(jīng)中國農(nóng)科院棉花研究所鑒定，在其他供試棉花品種的棉鈴蟲蟲株率高達(dá)100的情況下，該種質(zhì)系的蟲株率僅為26，7，表現(xiàn)了良好的抗蟲性該系對(duì)鹽堿的抗性也較強(qiáng)，試驗(yàn)表明在土壤含鹽量高達(dá)0.6的條件下能正常出苗 1993年在山東無棣縣鹽堿地(含鹽量0.5x一0.55)試種，出苗率為75.5，皮棉每667m2產(chǎn)65.7kg，從同一組合所獲得的另一棉花種質(zhì)系91010，表現(xiàn)抗鹽、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等特點(diǎn)，91010在抗鹽性盆栽鑒定中，在土壤含鹽量達(dá)0.6%的條件下，出苗正常；用0，6nacl溶液授種發(fā)芽檢測(cè)，在其他棉花品種不能正常發(fā)芽的情況下，其發(fā)芽率仍高達(dá)85.6。1993年在無棣縣鹽堿地(

19、含鹽量0.50.5s)試種，出苗率為67，每667m2產(chǎn)皮棉5.45kg。網(wǎng)上消息（摘自經(jīng)貿(mào)信息） 我國科學(xué)家培育成功海水澆灌作物中國科學(xué)家近日宣布（2003-6-11），他們已在全世界首次成功培育出可在海灘上種植、用海水直接澆灌生長(zhǎng)的作物，并已將種子傳到第四代。 這項(xiàng)我國重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目已通過國家驗(yàn)收。主持該項(xiàng)目的海南大學(xué)教授林棲鳳說，他們將耐鹽植物分子通過花粉管通道導(dǎo)入西紅柿、茄子、豇豆、辣椒四種淡水蔬菜中，大大提高了它們的耐鹽性。驗(yàn)收組組長(zhǎng)余誕年指出，經(jīng)過十年研究，這項(xiàng)技術(shù)基本成熟?？萍疾俊⑥r(nóng)業(yè)部和國家海洋局決定向全國逐步推廣種植。 著名科學(xué)家、分子育種理論與技術(shù)創(chuàng)始人周光宇教授稱，這一

20、巨大成果對(duì)解決淡水資源嚴(yán)重匱乏、人口爆炸、耕地日趨減少的世界性難題，具有開拓性的時(shí)代意義，“為國際耐鹽植物分子育種的發(fā)展作出了跨世紀(jì)貢獻(xiàn)?！蹦壳?，美國、日本等國的科學(xué)家也在進(jìn)行相同研究，我國科學(xué)家的成果被認(rèn)為處于領(lǐng)先地位。美國康奈爾大學(xué)教授、著名生物學(xué)家吳瑞評(píng)價(jià)說，海南耐鹽植物分子育種的成功意義重大，“在國際上尚未見到有同類報(bào)道?！庇浾咴谖挥诤Ｄ系脑囼?yàn)基地看到，耐鹽蔬菜種植在畝海灘上，用百分之百海水澆灌。 除海水澆灌外，耐鹽蔬菜只需施少量肥料，成本低。種植方法與淡水種植一樣，產(chǎn)量相當(dāng)。海南地處熱帶，一年可種三茬。驗(yàn)收結(jié)果顯示，耐鹽蔬菜的營(yíng)養(yǎng)成份與淡水蔬菜無異，滋味則更好。這項(xiàng)研究有三個(gè)國內(nèi)外首

21、創(chuàng)：一是將海水植物紅樹的總基因?qū)氲参铮欢侵苯佑煤Ｋ疂补?；三是高耐鹽性。 二.提高產(chǎn)量、改良品質(zhì) 在育種中值得注意的是在綜合性狀優(yōu)良的基礎(chǔ)上，將高產(chǎn)與優(yōu)質(zhì)結(jié)合起采，自然還要考慮抗性和適應(yīng)能力，這是選育新品種的總趨勢(shì)。 隨著人民生活水平的提高，對(duì)各種作物的品質(zhì)提出了更高的要求，忽視了這一點(diǎn)，雖育出了高產(chǎn)品種，但其品質(zhì)未達(dá)要求，也難以在生產(chǎn)上推廣。 實(shí)踐證明，通過分子育種的手段可以很好地將兩者結(jié)合起來，選育出生產(chǎn)上受歡迎的既高產(chǎn)又優(yōu)質(zhì)的新品種。（1）棉花 棉花是紡織工業(yè)和人類衣著的主要原料，棉紡工業(yè)對(duì)棉花纖維品質(zhì)的要求主要考慮纖維長(zhǎng)度、整齊度、細(xì)度、成熟度和強(qiáng)度。于元杰等 從紅麻dna導(dǎo)入魯

22、棉6號(hào)的后代中選育出91006優(yōu)質(zhì)、抗病品系，其品質(zhì)明顯優(yōu)于受體和對(duì)照品種中棉2?？姑藁菸?，豐產(chǎn)性也較好。在魯棉6號(hào)+羅布麻dna的組合后代中也發(fā)現(xiàn)一些綜合性狀好，抗逆性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)品系如91013。這個(gè)品系衣分高，纖維的長(zhǎng)度，細(xì)度和強(qiáng)度均優(yōu)于魯棉6號(hào)和推廣品種中棉12號(hào)。（2）小麥小麥籽粒的品質(zhì)也是育種家們當(dāng)前極為重視的問題。籽粒品質(zhì)涉及到營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)。前者要求蛋白質(zhì)含量高，而且各種氨基酸的比例要適當(dāng)，特別是要富含賴氨酸；后者指出粉率，面粉色澤。烘烤品質(zhì)等，以往在小麥育種上多重視產(chǎn)量的提高，面對(duì)品質(zhì)注意不夠，近年來對(duì)小麥籽粒的品質(zhì)提出了較高的要求有的單位應(yīng)用外源dna導(dǎo)入的方法進(jìn)行了研

23、究，收到很好的效果于元杰等 將牛胸腺dna導(dǎo)入814527晶系，從其后代中選育出d041品系， 表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)(高蛋白質(zhì)，高賴氨酸)，高產(chǎn)、且早熟，抗病其蛋白質(zhì)含量達(dá)到15以上，賴氨酸含量為0.39，蛋氨酸含量0.25（3）水稻 富威力等 采用水稻的近緣屬菰的dna導(dǎo)入水稻品種北陸128等8個(gè)品系，這些品系在生育期，抗病性和品質(zhì)方面需要加以改良。據(jù)分析供體菰籽粒的蛋白質(zhì)含量一般為13.4l，受體水稻則較低(9.31)，d1代變異株慕的蛋白質(zhì)含量多介于兩者之間，為8.50一重3.86。賴來展等以蛋白質(zhì)含量高(14.03)的黑米品種作供體，以高產(chǎn)品種單引1號(hào)和白米品種化殺組合雜種f1為受體，采用花粉管通

24、道法，獲得稃色及米皮色變異d4代個(gè)別株系表現(xiàn)為穩(wěn)定的黑米稻；d5代穩(wěn)定的黑米株系達(dá)到50。 這種黑色性狀在后代中不斷積累加強(qiáng) 從d3代便選出黑米高蛋白品系，蛋白質(zhì)含量達(dá)到13.75%； 說明色素和高蛋白的遺傳信息均已進(jìn)入受體基因組，得到了整合與表達(dá)。每667m2產(chǎn)量可達(dá)325kg，比供體提高30%此品系集天然色素，高蛋白、高產(chǎn)于一體，為黑色保健食品工業(yè)的發(fā)展提供了新原料。 萬文舉等 應(yīng)用浸胚法將慈利玉米dna導(dǎo)入水稻品種湘早秈8號(hào)，獲得了大量變異后代，從中選出高產(chǎn)、抗病抗逆性強(qiáng)的新品系ger-1。 洪亞輝等 以玉米dna浸泡早稻91-l，從其后代中選個(gè)優(yōu)良變異品系； 如dh系列，每667m2產(chǎn)

25、量超過500kg稻米品質(zhì)經(jīng)中國水稻研究所檢測(cè)，絕大部分項(xiàng)目達(dá)米質(zhì)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其中蛋白質(zhì)含量為135左右，最高的達(dá)到14。9。另一優(yōu)良品系的來源是以水稻鄂宜105為受體，密穗高梁dna為供體，采用花粉管通道法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)過多代嚴(yán)格篩選和檢測(cè)，選出了矮稈、優(yōu)質(zhì)、抗病，抗逆性強(qiáng)的水稻新品系dh3和高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的水稻新品系dh5。小結(jié)經(jīng)過科學(xué)工作者的艱辛探索，植物分子育種在品種的遺傳改良和創(chuàng)造新類型方面已作出了巨大成績(jī) 分子育種能巧妙地打破物種界限；育種工作者可以深入到自然界，廣泛搜集和利用有益的遺傳資源，從而為豐富后代的遺傳基礎(chǔ)創(chuàng)造條件大量實(shí)踐證明，開展分子育種，可以解決常規(guī)育種難以克服的困難

26、，培育出符合需要的新品種。值得重視的是分子育種必須與常規(guī)育種相結(jié)合，才能相輔相成。雷勃鈞等 利用花粉管通道技術(shù)將高蛋白半野生大豆dna導(dǎo)入栽培大豆。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明后代變異涉及到成熟期，種皮色澤和蛋白質(zhì)含量等方面。 d8807組合(黑農(nóng)26+含早熟血緣的綏農(nóng)8號(hào)dna)，在d2代便分離出3個(gè)早熟株系，與受體相比，成熟期提早15d，從d3代起便穩(wěn)定遺傳。 d90-1072品系產(chǎn)量比對(duì)照品種提高191； d8701組合(受體黑龍35+龍79-3433-1)，后代有4個(gè)株系蛋白質(zhì)含量比受體提高了l2個(gè)百分點(diǎn)； d8705組合(受體虎林綠草豆，供體龍79-42044)在d2代發(fā)生瘋狂分離，株系間蛋白質(zhì)含

27、量有差異，均普遍高于受體，最高的比受體提高6個(gè)百分點(diǎn)。各性狀從d4代開始穩(wěn)定?？俤na導(dǎo)入的后代出現(xiàn)大量變異。 但是：dna到底以什么狀態(tài)進(jìn)入受體?進(jìn)去的是dna片段，還是基因?它們又是如何進(jìn)入受體基因組的? 實(shí)際情況目前尚不清楚因而目前總dna導(dǎo)入還帶有很大盲目性。在總結(jié)成績(jī)和經(jīng)驗(yàn)的同時(shí)，應(yīng)逐步轉(zhuǎn)入分子育種的第二個(gè)層次：從分子水平上識(shí)別和分離目的基因，進(jìn)而構(gòu)建重組體，并將該基因準(zhǔn)確地送入到受體細(xì)胞，與其基因組相整合。第二章 植物dna的提取與檢測(cè)目前，國內(nèi)外已有許多dna提取方法：有較為通用的；有專門針對(duì)含較高多糖、多酚等次生代謝植物的；有針對(duì)具體物種的，如棉花、甘薯、蓮屬植物等等。不管采用

28、哪種方法，應(yīng)該考慮到以下幾點(diǎn)：第一，如果需鑒定的材料數(shù)量有限，就應(yīng)采取dna微量提取方案；第二，如果材料含有較多的類萜、丹寧、多糖等，就應(yīng)在dna提取中考慮是否能控制住這些物質(zhì)對(duì)限制性內(nèi)切酶或pcr聚合酶的抑制作用；第三，如果采用pcr分析，dna提取步驟越少越好，這是因?yàn)閜cr反應(yīng)極其靈敏，多步驟及多種試劑容易引起交叉污染，從而影響pcr分析的準(zhǔn)確性。第一節(jié) 植物總dna提取方法一、植物總dna大量提取方法 二、植物總dna微量提取方法三、植物總dna稍大量提取方法含多酚類材料的dna提取方法以棉花為例；1.取新鮮棉胚3g，加5ml預(yù)冷95%乙醇于研缽中勻漿。(04)2.取勻漿液再加5ml乙

29、醇和10ml乙醚，攪拌3060rnin后棄上清;3.取沉淀粉加20ml丙酮，攪拌l2h后，棄上1清液；4.取沉淀物，再加少量丙酮液脫水，重復(fù)3次(適溫干燥或抽真空)；5.脫脂丙酮干粉，加30ml 0.4mol nacl，稍加攪拌后，4000r/min離心5min后，棄上清液；6.洗滌物，加1015ml 12molnacl，l15mlsds液，攪拌l2min后，4000rmin離心l0min，棄沉淀；7.取上清液，加2倍體積預(yù)冷乙醇，沉淀核酸-蛋白復(fù)合物，8.沉淀或細(xì)絲，加1ml 0.14mol nacl，0.1mol edta，0.1moltris·hci緩沖液，ph 8.2；6l0

30、mg蛋白酶，37繼續(xù)保溫15min；9.消化液加nacl，使終濃度為12mol，37繼續(xù)保溫30min后，加sds使終濃度為l2，37繼續(xù)保慍15min，4000rmin離心15min；10.取上清液，加乙醇沉淀桉酸，沉淀或細(xì)絲溶于5ml 2molnacl，再加乙醇沉淀核酸，重復(fù)2次，最后溶子3ml 2molnacl；11.4000rmin離心15min；12.取上清液用sepharose-4柱層析，2molnacl洗脫獲純化dna液。再檢測(cè)后待用第二節(jié) 植物細(xì)胞核dna提取方法 第三節(jié) 植物細(xì)胞器dna提取方法線粒體dna（mtdna）、葉綠體dna（ctdna）第三節(jié) 核酸分子的純度檢測(cè)及

31、處理獲得純度達(dá)到一定程度的核酸分子是分子操作成敗的關(guān)鍵。事實(shí)上，分子操作的每一步都要進(jìn)行監(jiān)控。核酸分離出來以后，便要對(duì)其純度和濃度加以檢測(cè)dna和rna都是由大量的雜環(huán)堿基核苷酸組成的多聚體分子，雜環(huán)的紫外吸收特性使dna和rna分子在260nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈的吸光峰。利用這一特性對(duì)dna和rna的濃度與純度進(jìn)行檢測(cè)。在核酸分離過程中，污染核酸的主要物質(zhì)為: 細(xì)胞內(nèi)含物如蛋白質(zhì)、多糖以及提取藥劑如苯酚。 盡管這些污染物在提取流程中進(jìn)行了針對(duì)性的控制，當(dāng)控制不夠充分的情況下，污染便會(huì)發(fā)生。蛋白質(zhì)由于含有芳香族氨基酸殘基，也具有紫外吸收特性，但其吸收峰值為280nm;苯酚的紫外吸收也在這一峰值; 所

32、以核酸分子中蛋白質(zhì)和酚的污染情況可以通過比較260nm的吸光值和280nm的吸光值得出。一、核酸濃度的檢測(cè)(一)紫外吸收光譜法 核酸濃度的檢測(cè)最常用也是最方便的方法是紫外吸收光譜法。 核酸溶液260nm的od值為1時(shí)，相當(dāng)于大約50gml雙鏈dna，40gml單鏈dna,或rna，或約20gml的單鏈寡核苷酸。進(jìn)行紫外吸收光譜法檢測(cè)核酸要獲較準(zhǔn)確的濃度：一要避免核酸分子的相互污染。例如dna中混有rna或寡核苷酸或者rna存在有dna，二要對(duì)核酸樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尅Ｊ箿y(cè)定的od值在與濃度呈線性關(guān)系的范圍內(nèi)，如0.020.5范圍內(nèi)。檢測(cè)出od260后，核酸濃度可由下式計(jì)算出：dna濃度(gml)

33、=od260×50 ×稀釋倍數(shù) rna濃度(gml)=od260×40 ×稀釋倍數(shù)寡核苷酸濃度(gml)=od260×20 ×稀釋倍數(shù)(二)電泳比較法 是利用dna嵌入溴化乙錠分子受紫外激發(fā)，發(fā)出熒光，發(fā)射熒光的強(qiáng)弱與dna量成正相關(guān)，通過與標(biāo)準(zhǔn)dna樣品熒光強(qiáng)度的對(duì)比來判斷樣品dna濃度的一種定量方法。進(jìn)行電泳比較法dna定量，要制備標(biāo)準(zhǔn)濃度的dna。如利用-dna或魚精dna，溶解成梯度0、2、5、5、10、20、30、40和50mgml，將一定體積的標(biāo)準(zhǔn)濃度dna和待測(cè)樣品點(diǎn)樣以含溴化乙錠(0.5mgml)的0.8%瓊脂糖凝膠中

34、，經(jīng)過電泳后，拍攝dna熒光帶，比較得測(cè)樣的熒光與標(biāo)準(zhǔn)dna熒光的強(qiáng)度推測(cè)出其dna含量。(三)紫外吸收薄層掃描法 紫外吸收薄層掃描法綜合了上述兩種方法： 先通過凝膠電泳將dna在瓊脂糖中分離開來，然后用薄層掃描儀測(cè)定紫外吸收od260，吸收波的面積即反映了dna的濃度，這一濃度通過與標(biāo)準(zhǔn)dna峰面積的對(duì)照計(jì)算即可以得出dna濃度的絕對(duì)值。 這一方法不受dna中混有rna或多合dna分子共存的限制，只要能用電泳將它們分離開來都可適用。 二、dna純度分析蛋白質(zhì)和苯酚在280nm有吸收峰，會(huì)使受污染的dna紫外吸收值od260od280明顯下降。因?yàn)?，dna純品od260od280=1.8 rn

35、a純品od260od280=2.0所以，od260od280<1.8， 即表明dna中含有蛋白質(zhì)或苯酚，需要進(jìn)一步純化，如果，od260od280>2.0，即說明dna中有rna或者降解寡核苷酸等的污染 三、dna的進(jìn)一步純化 dna的進(jìn)一步純化，首先要弄清其中污染了哪種物質(zhì)。如果是蛋白質(zhì)的污染：先以te將dna稀釋至0.1ugml左右，加入終濃度為0.5的sds和12.5ugml的蛋白酶k，50保溫1h后以氯仿:異戊醇抽提兩次，然后加入終濃度0.3mol的naac和2倍體積的乙醇沉淀dna，dna沉淀的70乙醇洗一次后干燥，溶解如果dna樣品中混有苯酚：可以氯仿：異戊醇抽提二次，

36、將苯酚抽除，再以乙醇沉淀和干燥等。如果樣品中混有rna：先經(jīng)rna酶酶解，然后再抽提、乙醇沉淀，對(duì)于寡核苷酸、多糖等的污染則要通過層析法或凝膠電泳將其除去第三章 植物外源dna的導(dǎo)入方法外源dna的導(dǎo)入：是指通過某種特定的途徑將外源基因或外源dna片段導(dǎo)入受體細(xì)胞，使之整合到受體細(xì)胞基因組中，而實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)的過程。它是分子育種的一個(gè)重要技術(shù)環(huán)節(jié)。經(jīng)過10多年來的研究，巳建立起了10余種不同的導(dǎo)入方法。按技術(shù)屬性可將它們分為物理法、化學(xué)法及生物法三類。物理法: 如基因槍法、電激法、注射法、激光穿刺法，超聲波法，碳化硅纖維法等；化學(xué)方法: 聚乙二醇(peg)法，磷酸鈣-dna共沉淀、脂質(zhì)體法等.

37、生物法:農(nóng)桿菌法，花粉管通道法，浸漬法，病毒法等如果按照媒體類型的有或無，可分為載體介導(dǎo)法、直接導(dǎo)入法和種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)法三類。 載體介導(dǎo)法（間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)）:是將目的dna轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌或病毒中，并以之為載體，隨著它們對(duì)植物的感染面將目的dna導(dǎo)入植物細(xì)胞中。 直接導(dǎo)入法（直接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)）:是以裸露的外源dna通過化學(xué)或物理方法直接導(dǎo)入植物細(xì)胞，它主要包括前面所說的化學(xué)方法和物理方法。 種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)法（生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)移系統(tǒng)）：是借助植物自身的種質(zhì)細(xì)胞與媒體(如花粉，卵細(xì)胞，子房，花粉管通道、幼胚等)來實(shí)現(xiàn)外源dna導(dǎo)入的方法它包括花粉管導(dǎo)入法，子房，幼穗、幼胚注射法，種子漫漬法等。第一節(jié) 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法利用農(nóng)

38、桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，將外源目的基因或dna片段插入ti質(zhì)粒的t-dna中，并隨之導(dǎo)入受體植物細(xì)胞，而獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法，即為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。t-dna轉(zhuǎn)移的過程可簡(jiǎn)要地概括如下： 損傷的植物細(xì)胞產(chǎn)生乙酰丁香酮等植物酚類物質(zhì)作為農(nóng)桿菌的侵染信號(hào)； 這些化學(xué)誘導(dǎo)物(又稱信號(hào)分子)透過農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜激活vira和virg基因，再激活vir區(qū)的其他基因；這些vir基因活化后，其產(chǎn)物對(duì)t-dna進(jìn)行加工、剪切，并引導(dǎo)t-dna整合進(jìn)植物基因組， t-dna在植物細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生植物激素，刺激植物形成腫瘤。轉(zhuǎn)化程序：植物受體系統(tǒng)的建立、ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建、工程農(nóng)桿菌的制備、外源基因的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化體的篩

39、選和轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)等一系列步驟。第二節(jié) 基因槍法基因槍法，又稱：微彈轟擊法、粒子轟擊法、高速粒子噴射技術(shù)、彈道微靶點(diǎn)射擊：是一種借助高速金屬微粒將dna分子引入活細(xì)胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)。最早是由美國cornell大學(xué)的sanfrod等(1987)研制出火藥引爆的基因槍。klein等(1987)首次在洋蔥上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphericol acetyl transferase，cat)基因?qū)胙笫[表皮細(xì)胞1990年美國杜邦公司推出了pds·1000型商品基因槍，此后，高壓放電、壓縮氣體驅(qū)動(dòng)等各種類型基因搶相繼出現(xiàn)，并都在實(shí)際應(yīng)用中得到了不斷的改進(jìn)和發(fā)展，開創(chuàng)

40、了基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的新局面，使基因槍轉(zhuǎn)化法成為繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)法之后又一廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)化技術(shù)。第三節(jié) peg法聚乙二醇（polyethyleneglycol，）法是從促進(jìn)原生質(zhì)體融合的方法中衍生出來的，于1980年由dave等首先建立 pazkowski等(1984)報(bào)道了第一側(cè)用peg法轉(zhuǎn)基因成功的植物 后來隨著單子葉植物原生質(zhì)體分離培養(yǎng)的植株再生技術(shù)的發(fā)展,peg法轉(zhuǎn)化植物成功的報(bào)道已越采越多。其方法本身也隨之得到很大的改進(jìn)，轉(zhuǎn)化率已達(dá)到了現(xiàn)在的10-2甚至更高，已成為了一種常用且比較成熟的植物原生質(zhì)轉(zhuǎn)化方法基本原理 peg是一種選擇性化學(xué)滲透劑，分子質(zhì)量可從150012000，ph從4.66.5，

41、因多聚程度不同而異。 它可以使細(xì)胞膜之間或使dna與細(xì)胞膜形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連，并可通過改變細(xì)胞膜表面的電荷，引起細(xì)胞膜透性變化，從而促進(jìn)外源大分子進(jìn)入原生質(zhì)體，因此稱之為peg誘導(dǎo)法。 peg誘導(dǎo)所引起的細(xì)胞膜透性改變是可以恢復(fù)的。 在peg轉(zhuǎn)化過程中常需加入ca2+離子，這種二價(jià)陽離子可與dna結(jié)合成dna-磷酸鈣復(fù)合物而使dna沉積于原生質(zhì)體的膜表面，并促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞作用 此外，高ph值可誘導(dǎo)原生質(zhì)體的融合和外源dna分子的攝取，因此，peg轉(zhuǎn)化時(shí)常將溶液ph調(diào)到8.0左右，但高于10時(shí)則會(huì)損傷原生質(zhì)體。peg法正是利用以上因素作用于植物原生質(zhì)體，使加在培養(yǎng)液中的外源dn

42、a分子進(jìn)入細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化目的的。第四節(jié) 浸漬法 浸漬法：是指將植物的種子，胚、胚珠，子房、花粉粒、幼穗，懸浮細(xì)胞甚至幼苗等直接浸泡在外源dna溶液中，利用滲透作用把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞并得到整合與表達(dá)的一種轉(zhuǎn)化方法。這種方法實(shí)際上在經(jīng)典的基因工程誕生之前就有人開始探索了，這一想法的萌芽是受細(xì)菌轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的啟發(fā)，早在1969年，德國學(xué)者h(yuǎn)ess便報(bào)道了用外源dna浸泡矮牽牛的萌動(dòng)種子而出現(xiàn)變異性狀的結(jié)果。一、基本原理 浸漬法主要是利用植物細(xì)胞自身的物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)將外源dna分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞。現(xiàn)已證明植物細(xì)胞至少可以通過以下幾種途徑將外源dna吸入細(xì)胞內(nèi)： 外源dna可以通過細(xì)胞間隙與胞間連絲組成

43、的網(wǎng)絡(luò)化的運(yùn)輸系統(tǒng)而被運(yùn)輸?shù)矫恳粋€(gè)細(xì)胞內(nèi)； 植物細(xì)胞也可以通過類似動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)吞作用將外源dna攝入細(xì)胞內(nèi)；植物組織中細(xì)胞的膜透性改變也可以為大分子物質(zhì)透過細(xì)胞膜提供機(jī)會(huì)，尤其是在生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞以及分生細(xì)胞中，外源dna進(jìn)入細(xì)胞中的機(jī)會(huì)更大。二、基本方法 浸漬法，就是將不同的受體系統(tǒng)直接放入供體dna(包括總dna和質(zhì)粒dna)溶液中浸泡一段時(shí)間，再經(jīng)過自然發(fā)育或人工培養(yǎng)面得到轉(zhuǎn)化植株。以種子為受體的基本操作方法：1.將種子用0.1的升汞或2030次氯酸鈉消毒，無菌剝?nèi)シN皮(也可剝出幼胚)；2.將剝出的種子浸于無菌的0.1×ssc緩沖液中，加入20的二甲基亞砜(dmso)；3.加

44、入供體dna溶液(100200gm1)，浸泡30min至數(shù)h； 4.用無菌0.1×ssc緩沖液沖洗干凈；5.將種子放在無菌濾紙上吸干水分后，轉(zhuǎn)入無激素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；6.將生長(zhǎng)發(fā)育正常的胚轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選(用質(zhì)粒dna浸泡的種子)，或成苗后轉(zhuǎn)載到土壤中進(jìn)行變異性狀分析(用總dna浸泡的種子)。三、基本特點(diǎn) 浸漬法是高等植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)中最簡(jiǎn)單，快速，便宜的一種轉(zhuǎn)化方法它不需要昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜的組織培養(yǎng)技術(shù)，可以進(jìn)行大批量的受體轉(zhuǎn)化工作，并且此法容易推廣普及。 但該法的轉(zhuǎn)化頻率較低，重復(fù)性較差，篩選和檢測(cè)也困難，往往很難得到分子生物學(xué)證據(jù)。第五節(jié) 花粉管通道法花粉管通道

45、法：是利用植物受精過程中形成的花粉管通道將外源dna導(dǎo)入植物的技術(shù)。 是由我國學(xué)者周光宇提出并建立的一種非常實(shí)用的轉(zhuǎn)基因技術(shù) 這一方法也在實(shí)際應(yīng)用中得到了不斷的發(fā)展和完善，成為分子育種最有價(jià)值的方法之一。 一、基本原理授粉后外源dna能沿著花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞。周光宇等認(rèn)為在受精及胚胎發(fā)育的初期是植物接受遠(yuǎn)緣遺傳物質(zhì)的敏感時(shí)期。因?yàn)椋海?）精、卵細(xì)胞類似天然的原生質(zhì)體；（2）在精子入卵時(shí)，卵膜有一個(gè)開閉的過程；（3）合子期，胞壁的形成也尚未完備，胞壁的屏障作用還很小，因此外源基因進(jìn)入受體卵細(xì)胞及合子的阻力也較小：（4）雄配子體花粉萌發(fā)

46、時(shí)，頂部也擁有無壁的小孔，外源遺傳物質(zhì)也容易吸入二、操作方法利用花粉管道道導(dǎo)入外源dna的技術(shù)已發(fā)展出多種行之有效的操作方法，基本歸納為三類：1.柱頭切除法：當(dāng)受體植物自花授粉一定時(shí)間后(一般23h）切去花柱； 然后馬上在切口上滴入供體dna溶液，濃度為50100ug/ml，溶于1xssc(150m molnacl，15m mol檸檬酸鈉，ph7.5）；最后套袋隔離至種子成熟。2.花粉粒吸入法： 收集新鮮花粉加入到供體dna溶液(0.3mol蔗糖、20mmol硼酸鈉，dna終濃度40ugml)中，混勻，使外源dna被吸入花粉粒；然后取混合液滴于預(yù)先去雄套袋隔離的雌蕊上進(jìn)行人工授粉；再繼續(xù)套袋至

47、種予成熟。3柱頭涂抹法： 在未授粉前先用dna溶液涂抹柱頭，然后人工授粉套袋隔離，通過花粉管的伸入將外源dna帶入胚囊，成熟后收獲種子 上述各種方法的操作程序中，都要設(shè)置以不含dna的等量ssc溶液作相同處理為對(duì)照所有獲得的處理與對(duì)照的種子均需點(diǎn)播在同一試驗(yàn)田進(jìn)行田間鑒定和篩選三、基本特點(diǎn) 花粉管通道法是利用自然繁殖過程中整體植株的卵細(xì)胞、受精卵或早期胚細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化受體，無需細(xì)胞，原生質(zhì)體等組織培養(yǎng)和誘導(dǎo)再生植株等一整套人工培養(yǎng)過程。 這樣，就避免了原生質(zhì)體再生以及組織培養(yǎng)過程中可能導(dǎo)致染色體變異或優(yōu)良農(nóng)藝性狀喪失的問題。 且此方法不受植物種屬的限制，在具備有性生殖過程的任何植物上都能應(yīng)用 另

48、外，此法簡(jiǎn)便，易于掌握，可以在大田，盆栽或溫室中進(jìn)行，育種時(shí)間短，篩選遺傳穩(wěn)定的品系一般只需34代時(shí)間， 再者，通過外源總dna片段的導(dǎo)入可以了解一些具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的農(nóng)藝性狀是否能夠通過dna片段進(jìn)行轉(zhuǎn)移、這些性狀是單基因性狀還是多基因性狀，從而能為目的基因的克隆提供參考和材料。 但此法的使用在時(shí)間上受到開花季節(jié)的限制，而且應(yīng)用總dna片段的導(dǎo)入，篩選到的子代可能帶有目的基因以外的dna片段 總之，目前花粉管導(dǎo)入法已有了一定的理論基礎(chǔ)和大量的實(shí)踐證實(shí)，它的簡(jiǎn)捷特性以及可以直接得到轉(zhuǎn)化種子等優(yōu)點(diǎn)使之成為目前廣泛使用的轉(zhuǎn)化方法之一第六節(jié) 顯微注射法顯微注射： 是利用顯微裝置將大分子物質(zhì)或細(xì)胞器注

49、射到培養(yǎng)細(xì)胞的一項(xiàng)技術(shù)。 該技術(shù)歷史悠久，最初主要用于兩犧類動(dòng)物的核移植以及哺乳類和魚類卵細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化。 近年來，植物懸浮細(xì)胞、花粉粒以及多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分生組織、胚狀體等都被用作顯徽注射的受體材料，并使該方法在理論上和技術(shù)上都有了進(jìn)一步的發(fā)展 。一、基本原理 其基本原理是利用顯微注射儀將外源dna直接注入受體細(xì)胞，并使其成活、增殖而發(fā)育成為轉(zhuǎn)基因個(gè)體。 顯微注射中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是固定受體細(xì)胞，目前采用的固定方法有三種： 脂糖包埋法。多聚-l-賴氨酸粘連法。吸管支持法。二、操作步驟 1.注射微針的制備2.受體材料的制備和固定3.受體材料的顯微注射4.注射后的細(xì)胞培養(yǎng)三、基本特點(diǎn) 顯微注射法的突出

50、優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率高，有研究表明，它的瞬時(shí)表達(dá)頻率可達(dá)30或更高，這是其他方法所不及的 另外，它是一種純粹的物理方法，能適用于各種植物和各種材料。 最近有人利用改良后的這一方法對(duì)植物的子房，穗頸等進(jìn)行直接注射，也獲得了理想的結(jié)果。 再者，此法的整個(gè)操作過程對(duì)受體細(xì)胞無藥物毒害，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。其缺點(diǎn)是操作繁瑣耗時(shí)，工作效率低，并需要精細(xì)的操作技術(shù)和精密的儀器設(shè)備，難以進(jìn)行大批量的轉(zhuǎn)化工作第七節(jié) 電激法電激法也稱電穿孔法：是利用高壓電脈沖作用使細(xì)胞膜上形成可逆性的瞬間通道，從而使外源dna分子進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法。此法是80年代初發(fā)展起來的，最初主要用于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。一、基本原理 細(xì)胞膜主要

51、由脂類組成，每一個(gè)脂質(zhì)分子都有極性的頭部和疏水的尾部，因此細(xì)胞膜可以視為一種電容，其靜息膜電位(vm)約為100mv。 當(dāng)細(xì)胞處于一個(gè)外加電場(chǎng)中時(shí)，膜電位增高，即v>vm。v的高低與電場(chǎng)強(qiáng)度(e)成正比。隨著e的不斷增大，v也不斷升高，于是膜被壓縮變薄。 當(dāng)v升高到一定值時(shí)，膜被擊穿形成微孔，此壓稱之為擊穿電壓(vc) 如果電場(chǎng)強(qiáng)度不再繼續(xù)增大，此時(shí)所形成的膜孔數(shù)量少、孔徑小，間隔一段時(shí)間后即可復(fù)原，這稱之為“可逆擊穿”。 對(duì)受體細(xì)胞施以可逆擊穿電場(chǎng)強(qiáng)度即可達(dá)到電擊穿孔轉(zhuǎn)化的目的二、基本特點(diǎn) 電激法在轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體上取得了良好的效果，已被國際上公認(rèn)為是一種成熟可靠的轉(zhuǎn)化方法。 它除了同樣具

52、有peg法的優(yōu)點(diǎn)外，還具有操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率較高的特點(diǎn)，特別適用于瞬時(shí)表達(dá)的研究。 另外，這種方法無宿主的限制，對(duì)胚性愈傷組織、懸浮細(xì)胞，分生組織均可采用。并有研究表明，此法與peg法結(jié)合使用，可大大提高轉(zhuǎn)化頻率。 其缺點(diǎn)是易造成細(xì)胞膜的損傷，使植板率降低，而且儀器也較昂貴，各項(xiàng)轉(zhuǎn)化參數(shù)還有待進(jìn)一步的優(yōu)化。第八節(jié) 超聲波導(dǎo)入法超聲波導(dǎo)入法：利用低聲強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用將外源dna分子導(dǎo)入細(xì)胞的一種轉(zhuǎn)化方法， 我國學(xué)者最早建立并應(yīng)用該技術(shù)將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞。一、基本原理超聲波是指頻率為2×10 42×109hz的聲波，它的生物學(xué)效應(yīng)主要是機(jī)械作用，熱化作用和空化作用。熱

53、化作用：生物組織在超聲機(jī)械能的作用下由于粘滯吸收，將一部分超聲被轉(zhuǎn)化為熱能，使生物組織的慍度上升，稱之為超聲波的熱化作用。機(jī)械力作用：由于生物組織大多數(shù)屬軟組織，因而在超聲波的機(jī)械力作用下，其細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生變形，當(dāng)超聲波的強(qiáng)度增加到一定程度時(shí)，細(xì)胞膜就會(huì)擊穿。空化作用：組織在緩沖液中經(jīng)超聲波處理后，在緩沖液下會(huì)形成大量的小氣泡這些小氣泡在湮滅過程中產(chǎn)生高溫及高壓，甚至產(chǎn)生電離效應(yīng)，而導(dǎo)致細(xì)胞壁與質(zhì)膜的擊穿或可逆的通透性的變化。 這些因素將使得外源dna進(jìn)入到細(xì)胞中。二、基本特點(diǎn) 超聲波轉(zhuǎn)化方法不受受體種類的限制，不僅適用于原生質(zhì)體，而且適用于帶壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并且操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高，不失為一種很

54、有應(yīng)用潛力的轉(zhuǎn)化方法但該轉(zhuǎn)化方法外源dna用量較大，另外還有許多參數(shù)有待于優(yōu)化。第九節(jié) 激光微束法 激光微束法：利用激光微束使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜穿孔，從而將dna導(dǎo)入細(xì)胞的方法。1984年tsukakoshi等這種方法對(duì)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行dna轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。一、基本原理激光是一種很強(qiáng)的相干單色電磁射線，細(xì)胞膜系統(tǒng)或細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)由于能夠吸收特定波長(zhǎng)的激光產(chǎn)生熱效應(yīng)而引起某種程度的損傷。一定波長(zhǎng)的激光束經(jīng)聚焦后到達(dá)細(xì)胞膜表面時(shí)其直徑大約只有0.30.5nm。這種直徑很小，但能量很高的激光束可使細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆性穿孔，利用激光微束的這種穿刺效應(yīng)可以使外源dna導(dǎo)入到受體細(xì)胞中。二、基本特點(diǎn) 激光徽束轉(zhuǎn)化技術(shù)同基

55、因槍、電擊穿孔和超聲波法一樣，屬于物理轉(zhuǎn)化方法。 其優(yōu)點(diǎn)是無宿主限制，可適用于各種功能植物材料和各種類型的受體細(xì)胞，并且操作簡(jiǎn)單、方便，轉(zhuǎn)化效率較高，每分鐘可操作100個(gè)左右的細(xì)胞，比顯微注射法效率提高20倍，比化學(xué)法提高三個(gè)數(shù)量級(jí)； 另外，還可進(jìn)行細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)化，由于激光微束小于細(xì)胞器，它可以在顯微水平上直接對(duì)細(xì)胞器擊孔，實(shí)現(xiàn)外源dna對(duì)細(xì)胞器的轉(zhuǎn)移 但其需要昂貴的儀器設(shè)備，轉(zhuǎn)化頻率只有10-210-4。其穩(wěn)定性和安全性目前還不如電激法和基因槍法第十節(jié) 碳化硅纖維介導(dǎo)法碳化硅纖維介導(dǎo)法是由美國明尼蘇達(dá)州立大學(xué)kaeppler等(1990)首先建立起來的。 一、基本原理 碳化硅是一種單晶硅，

56、平均直徑為0.6um，長(zhǎng)度為直080um。這種纖維具有很高延展強(qiáng)度，其物理特性類似于石棉，表面光滑、不易結(jié)塊。 將它加入到含有受體細(xì)胞和外源dna的轉(zhuǎn)化液中混合振蕩，在相互碰撞中，纖維絲可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生穿刺作用，那些粘附于纖維絲上或細(xì)胞壁上的dna將隨之進(jìn)入細(xì)胞，而完成轉(zhuǎn)化作用 值得注意的是，碳化硅纖維吸入肺部容易引起傷害，因此應(yīng)在通風(fēng)柜中進(jìn)行操作，一般先配成5%的懸液備用，以減少它往空氣中的飄逸。二、基本特點(diǎn) 碳化硅穿刺技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速，成本低的特點(diǎn)，而且單子葉及雙子葉植物均可采用，不需要昂貴的設(shè)備，可以轉(zhuǎn)化完整細(xì)胞和組織。 但這種方法尚不夠成熟，轉(zhuǎn)化組織快時(shí)，多只對(duì)表層細(xì)胞有效，尚有許多參數(shù)有待進(jìn)一步優(yōu)化。 另外，穿入細(xì)胞的