分離提取質(zhì)粒DNA并用分光光度計測量含量

1、分離提取質(zhì)粒 DNA 并用分光光度計測量含量危險評估和安全考慮知情書開始實驗前，請認(rèn)真閱讀以下內(nèi)容，并簽名十二烷基磺酸鈉 （SDS）：有毒，具 有腐蝕性，請戴手 套、穿實驗服，如 果濺到皮膚上，請 用大量的水沖洗。氫氧化鈉（ NaOH ）：具有強 烈腐蝕性，請戴手 套、穿實驗服，如 果濺到皮膚上，請用大量的水沖洗。異丙醇：具有很強 的腐蝕性，戴上手 套，穿上工作服， 如果濺到皮膚上， 請用大量的水沖 洗。微型離心機：很高 的速度旋轉(zhuǎn)，要保 證離心管在離心機 中平衡放置，所有 的蓋子都要蓋緊， 有的離心機帶有內(nèi) 蓋，同樣要蓋緊。大腸桿菌 （E.coli）：根據(jù) ACDP 目錄 1，危險 性較低，

2、將活細(xì)菌 和其他任何與活細(xì) 菌接觸到的物品放 到指定的廢物缸 內(nèi)，然后高壓滅菌 處理，處理完后要 徹底洗手，如果手 沾有細(xì)菌，用抗微 生物的洗潔劑洗手，用消毒劑擦干 任何水滴。簽名：1、學(xué)習(xí)目標(biāo)本實訓(xùn)結(jié)束時，應(yīng)該會以下技能：利 用標(biāo)準(zhǔn)實驗程序分離提取質(zhì)粒 DNA利 用紫外分光光度計測量 DNA 濃度，并判斷提取的 DNA 純度說 出在實驗過程中，每一步試驗的相關(guān)性，并討論在分子生物學(xué)技術(shù)中分離 DNA 能力的重要性。2、實驗方法（1 DNA 的分離 收集 1.5 ml培養(yǎng)液 12 000g離心 1分鐘（確信離心管平衡放置）沉淀細(xì)菌，棄去 上清。備注：小心倒掉所有上清，這樣可以使沉淀盡量干燥。

3、每個離心管加入 200 l GTE溶液，充分混勻沉淀細(xì)菌，于室溫放置 5分 鐘。 加入 400l新配制的堿裂解液，上下溫柔翻轉(zhuǎn)幾次（不要用漩渦器，也不要劇烈 震蕩），輕輕混勻，在冰上放置 5分鐘。備注：細(xì)菌將很快在堿裂解溶液中裂解，如果裂解了，將會觀察到細(xì)胞懸液是澄 清的，如果打開離心管蓋子，會發(fā)現(xiàn)裂解后的溶液變得非常粘稠，像鼻涕一樣。 加入 300l冰預(yù)冷的 3 M 醋酸鉀溶液，溫柔的上下顛倒幾次，在冰上放置 5分 鐘。備注：醋酸鉀中和堿裂解液中的 NaOH ，這時可以看見白色像棉花絮狀的細(xì) 胞碎片和染色體沉淀形成。 最高速離心 1 分鐘，并把上清液轉(zhuǎn)移到一個新的做記號的離心管中。 備注：小

4、心操作，不要吸取任何沉淀，萬一吸取了沉淀，可以再一次離心。 加入 0.6倍體積（ 540 l）的預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置 2分鐘。 備注：這一步， DNA 從溶液中沉淀下來，可能使溶液看上去有點渾濁，不用 擔(dān)心，這時的 DNA 可能有幾個微克。 最高速離心 1 分鐘，棄去上清。備注： DNA 沉淀肉眼很難看見，但是我們把離心管放入離心機時，可以把離 心管鉸鏈朝外，這樣通過離心， DNA 會沉在鉸鏈正下方的離心管底部。 用1ml 冰預(yù)冷 70% v/v乙醇溶液洗滌兩次。加入乙醇時稍微混勻，離心 30秒， 用微量取樣器移走乙醇。備注：小心！不要把沉淀 DNA 吸走，這時的沉淀更白也更容

5、易看見。 離心 1 分鐘，棄去上清液，空氣中干燥沉淀 510 分鐘。備注：一旦沉淀干燥了，應(yīng)該沒有乙醇?xì)埩魵馕丁?用 50lTE pH 7.5 溶解，加入 1l 10 mg/ml RNAase 溶液，室溫放置 1530分鐘（ 2）通過紫外分光光度計測量 DNA 的含量 用 TE 緩沖液作稀釋劑，根據(jù)比色皿對 DNA 溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，例?3ml 的比色皿，加入 30l DNA 溶液和 2970 l TE 緩沖液。在 260 nm和280 nm處 測量吸光值，并用 TE 作為對照溶液（空白對照）。 , 計算質(zhì)粒 DNA 的方法：50g/ml的 DNA A260 為1.0。備注：本實驗預(yù)期結(jié)果

6、為： 5ml培養(yǎng)液得到的 DNA 為 2 10g。DNA 的純度：純 DNA A260/A280 的比值是 1.8。備注：如果有蛋白質(zhì)污染，比值 經(jīng)常會降低。 結(jié)果Wavelength (nm Absorbance2602803、考核及評價1）計算提取質(zhì)粒 DNA 的濃度，考慮到稀釋倍數(shù)，并做出評價2）計算提取 DNA 溶液 A260/A280 的比值，并判斷純度。3）討論分離提取的 DNA 的 3 個用途。4）在第 10 步為什么要加上 RNase？A 為了降解 RNA ，這樣提取的質(zhì)粒 DNA 就沒有 RNA 污染B 為了降解蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)能使質(zhì)粒和染色體緊密的在一起C 使染色體 DNA 更容易沉淀D 為了降解 DNA ，這樣提取的質(zhì)粒 RNA 就沒有 DNA 污染 E 為了降解細(xì)菌染色體 DNA（5）裂解液中含有 0.2N NaOH，NaOH分子量為 40，如果配制 100ml這種溶液， 應(yīng)該稱多少克 NaOH？A8.0 g B0.4 g C0.8 g D4.0 g E以上都不對（ 6）下列