生物技術制藥第三章基因工程制藥

1、第三講 基因工程制藥喻昕第三講 基因工程制藥基因工程與藥物概述基因工程藥物上游技術基因工程藥物下游技術基因工程藥物的質量控制基因工程藥物制造實例第一節(jié) 概述生物技術的核心就是基因工程，基因工程技術最成功的應用就是用于生物治療的新型生物藥物的研制。傳統(tǒng)生物藥物由于來源及制備上的困難、價格等因素的影響，此外在制備過程可能受到的病毒、衣原體、支原體等的感染等問題，促使人們尋求安全、實用、療效可靠的新方法來制備生物藥物?；蚬こ陶谥饾u顯示其在生物技術藥物制備上的優(yōu)勢。應用基因工程技術可十分方便且有效地解決上述提到的問題，從量、質上都可以得到改進，且可以創(chuàng)造全新物質。如今，癌癥、病毒性疾病、心血管疾病

2、以及內分泌等方面的預防、治療和診斷已可通過基因工程技術獲得。利用基因工程技術生產藥品的優(yōu)點：（1）可以大量生產過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細胞因子等），為臨床使用提供有效的保障；（2）可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質，以便對其生理、生化和結構進行深入的研究，從而擴大這些物質的應用范圍；（3）利用基因工程技術可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內源性生理活性物質；利用基因工程技術生產藥品的優(yōu)點：（4）內源性生理活性物質在作為藥物使用時存在的不足之處，可通過基因工程和蛋白質工程進行改造和去除。如IL-2的第125位半胱氨酸是游離的，有可能引起-S-S-鍵的錯配而導致活性下降，如將此半胱氨酸改

3、為絲氨酸或丙氨酸，IL-2的活性以及熱穩(wěn)定性均有提高；（5）利用基因工程技術可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源?；蚬こ碳夹g可將不同種類和用途的基因，在原核細胞中表達的特性使其不僅在醫(yī)藥，而且在很多行業(yè)中都會有重要的應用。第二節(jié) 基因工程藥物生產的基本過程基因工程技術就是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉入新的宿主細胞，構建工程菌（或細胞），實現(xiàn)遺傳物質的重新組合，并使目的基因在工程菌內進行復制和表達的技術?；蚬こ趟幬镏圃斓闹饕绦蚴牵耗康幕虻目寺?，構建DNA重組體，將DNA重組體轉入宿主菌構建工程菌，工程菌的發(fā)酵，外源基因表達產物的分離純化，產品的檢驗等。以上程序中的每個階段都包含若

4、干細致的步驟，這些程序和步驟將會隨研究和生產條件的不同而改變。獲得目的基因獲得目的基因組建重組質粒組建重組質粒培養(yǎng)工程菌培養(yǎng)工程菌構建基因工程構建基因工程菌或細胞菌或細胞產物分離純化產物分離純化除菌過濾除菌過濾半成品檢定半成品檢定包裝包裝成品檢定成品檢定基因工程藥物制備的一般過程基因工程藥物制備的一般過程基因工程藥物生產的上游和下游上游：主要指的是目的基因分離、工程菌（或細胞）構建。上游階段的工作主要在實驗室內完成；下游：主要指的是從工程菌（或細胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產品的分離純化、質量控制等。工程菌（或細胞）構建中重要的工具該過程中重要的工具便是酶：限制性內切酶和連接酶是將所需目的基因插入適

5、當?shù)妮d體質?；蚴删w中并轉入大腸桿菌或其他宿主菌（細胞）大量復制目的基因過程中的重要工具。同時為保證目的基因的正確性，對目的基因要進行限制性內切酶和核苷酸序列分析。基因表達系統(tǒng)就是上述的工程菌或細胞，有原核生物和真核生物兩類表達系統(tǒng)；選擇基因表達的系統(tǒng)主要考慮的是保證表達蛋白質的功能，其次要考慮的是表達量的多少和分離純化的難易。下游階段在產業(yè)化中是極其重要的下游階段是將實驗室成果產業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應器的研制，高效分離介質及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產品的制備技術，生物傳感器等一系列儀器儀表的設計和制造，電子計算機的優(yōu)化控制等。工程菌的

6、發(fā)酵工藝不同于傳統(tǒng)的抗生素和氨基酸發(fā)酵，需要對影響目的基因表達的因素進行分析，對各種影響因素進行優(yōu)化，建立適于目的基因高效表達的發(fā)酵工藝，同時建立一系列相應的分離純化、質量控制、產品保存等技術。第三節(jié) 目的基因的獲得對于目的基因的獲得需要根據(jù)目的基因的來源采取適當?shù)姆椒āτ谡婧思毎麃碓吹哪康幕?，是不能直接進行分離的。真核細胞中單拷貝基因僅是染色體DNA中的很小一部分，即使多拷貝基因也是極少的，因此從染色體中分離純化目的基因是很困難的。另外，原核表達系統(tǒng)是有局限性的，主要是由于真核基因的內含子及基因的后翻譯過程，所以真核系統(tǒng)得到了相應發(fā)展。第三節(jié) 目的基因的獲得目前克隆真核基因常用的方法有逆

7、轉錄法和化學合成法 一、逆轉錄法逆轉錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉錄成cDNA，然后進行cDNA的克隆表達。為了克隆編碼某種特異蛋白質多肽的DNA序列，可從產生該蛋白質的真核細胞中提取mRNA，以其為模板，在逆轉錄酶的作用下，反轉錄合成該蛋白質mRNA的互補DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA第一鏈為模板，在逆轉錄酶或DNA聚合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA序列。cDNA與模板mRNA序列嚴格互補，而不含內含子。第三節(jié) 目的基因的獲得一、逆轉錄法1、mRNA的純化2、cDNA第一鏈的合成3、cDNA第二鏈的合成4、cDNA克隆5、將重組體導

8、入宿主細胞6、cDNA文庫的鑒定7、目的cDNA克隆的分離和鑒定cDNA克隆示意圖mRNA逆轉錄酶ss-DNADNA多聚酶IKlenow片段逆轉錄酶ds-cDNAds-cDNA1、mRNA的純化分離純化目的基因的mRNA是極其困難的，細胞內含有3種以上的RNA，mRNA占細胞內總RNA總量的2%5%，相對分子質量大小很不一致，由幾百到幾千個核苷酸組成。在真核細胞中mRNA的3末端常常含有一多聚腺苷酸polyA組成的末端，長達20250個腺苷酸，可采用Oligo dT-纖維素，以親和層析法將mRNA從細胞總RNA中分離出來。洗脫方法是高濃度鹽溶液使mRNA特異結合于寡聚dT，再以低鹽溶液和蒸餾水

9、將其洗脫，經過兩次寡聚dT，可得到較純的mRNA。2、cDNA第一鏈的合成一般mRNA都帶有3-polyA，所以可用寡聚dT作為引物，在逆轉錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。在合成反應體系中加入一種放射性標記的dNTP，在反應中以及反應后可通過測定放射性標記的dNTP摻入量，計算出cDNA的合成效率；在凝膠電泳后，進行放射自顯影分析產物的分子大小，探索最佳反應條件。一次好的逆轉錄反應可使寡聚dT選出的mRNA有5%30%被拷貝。3、cDNA第二鏈的合成先用堿解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。由于第一鏈cDNA鏈3末端往

10、往形成一個發(fā)夾形結構，所以，可以從這一點開始合成cDNA第二鏈。此反應是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1專一性切除單鏈DNA，因此用它可以切除發(fā)夾結構。發(fā)夾結構結構切除后，雙鏈cDNA分子的大小常用變性瓊脂糖凝膠電泳進行測定。4、cDNA克隆用于cDNA克隆的載體有兩類：質粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌體DNA（如gt10、 gt11等）。根據(jù)重組后插入的cDNA是否能夠表達、能否經轉錄和翻譯合成蛋白質，又將載體分為表達型和非表達型載體。pUC及gt11為表達型載體，在cDNA插入位置的上游具有啟動基因順序；而pBR322及gt10為非表達型載體。在cDNA克隆操作中應該根

11、據(jù)不同的需要選擇適當?shù)妮d體。cDNA插入片段小于10kb，可選質粒載體，如大于10kb則應選用噬菌體DNA為載體。選用表達型載體可以增加目的基因的篩選方法，有利于目的基因的篩選。cDNA文庫R. Young和R. Davis設計的gt10和gt11是噬菌體克隆載體，可用于構建cDNA文庫。一方面它們具有較高的克隆效率，1ng cDNA可產生5000個克隆，另一方面又可容納較大分子量的外源DNA片段。因為篩選噬菌斑在技術操作上較篩選細菌菌落更方便，因此gt10和gt11類載體在構建文庫時優(yōu)于質粒載體pBR322。gt10載體在合適的宿主中， gt10載體對于未攜帶cDNA的噬菌體的裂解生長有很強

12、的生物學選擇作用。cDNA插入到gt10中可使噬菌體阻礙物基因（cI）失活。當用大腸桿菌c600的突變型hflA（高頻溶原性）作為宿主時，只有攜帶cDNA插入片段的噬菌體可形成噬菌斑，而在非突變型大腸桿菌c600宿主菌中，帶與不帶cDNA插入片段的噬菌體都可形成噬菌斑。gt11載體gt11則沒有類似gt10載體的選擇作用，但它是蛋白質表達的cDNA克隆載體。 gt11的宿主菌是大腸桿菌Y1090。gt11中cDNA插入片段是克隆在-半乳糖苷酶基因編碼區(qū)（lacZ）的羧基端，在含IPTG（isopropylthio-D-galactoside,異丙基硫代- -D-半乳糖苷）和X-gal（5-br

13、omo-4-chloro-3-indolyl - -D-galactoside,5-溴-4氯-3-吲哚- -D -半乳糖苷）的平板上，帶cDNA插入片段的gt11可形成清晰的無色噬菌斑，未帶cDNA插入片段的gt11則形成藍色噬菌斑。cDNA插入片段的翻轉產物可表達成半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白。cDNA片段與載體的連接方法一：加同聚尾連接，用3末端脫氧核苷酸轉移酶催化，使載體與cDNA的3末端帶上互補的同型多聚體序列，如載體加上polyC（或A）的尾巴，則cDNA加上polyG（或T）的尾巴，這兩種粘性末端只能使載體與cDNA連接而不能自我環(huán)化，借助同型多聚體的退火作用形成重組分子，最后用T

14、4DNA連接酶封口。方法二：加人工接頭連接，用T4DNA連接酶在平末端接上人工接頭可以使DNA發(fā)生連接。所謂人工接頭是指人工合成的、連接在目的基因兩端的含有某些限制酶切位點的寡核苷酸片段。cDNA連上人工接頭后，用該種限制酶酶切就可得到粘性末端，從而能夠與載體連接；cDNA中也可能也帶有同樣的限制酶切點，為了保護cDNA不受限制酶破壞，可在加接頭前用甲基化酶修飾這些限制酶切位點。5、將重組體導入宿主細胞體外包裝的噬菌體，感染感受態(tài)大腸桿菌形成噬菌斑；或轉化感受態(tài)大腸桿菌使質粒進入細胞內。6、cDNA文庫的鑒定根據(jù)重組體的表型進行篩選，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑顏色改變法。然后采用凝膠電

15、泳、分子雜交、DNA序列分析測定等方法進行進一步篩選和鑒定。7、目的cDNA克隆的分離和鑒定從cDNA文庫中分離特異的cDNA克隆，主要采用：（1）核酸探針雜交法。用層析和高分辨電泳等技術純化微克量的目的蛋白質，根據(jù)目的蛋白質純品的氨基酸序列分析結果，人工合成相應的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫中分離特異cDNA克隆。（2）免疫反應鑒定法。在既無可供選擇的基因表型特征，又無合適探針的情況下，本法是重要途徑。用表達型載體構建的cDNA文庫，可用免疫學方法分組逐一鑒定各cDNA的表達產物，即以某種蛋白質的抗體尋找相應的特異cDNA克隆。分離得到含有目的基因的陽性克隆后，必須對其作進一步的驗證

16、和鑒定，主要是進行限制酶圖譜的繪制、雜交分析、基因定位、基因測序以及確定基因的轉錄方向、轉錄起始點等。1985，PCR發(fā)明以后，RT-PCR得到了廣泛的應用。二、化學合成法人工化學合成的限制：一不能合成太長的基因，5060bp；二是人工合成時，遺傳密碼的簡并性可導致中性突變；三是費用較高。第四節(jié) 基因表達進行基因研究，我們主要關心的是目的基因的表達產量、表達產物的穩(wěn)定性、產物的生物學活性和表達產物的分離純化。因此在進行基因表達設計時，需綜合考慮各種影響因素以建立最佳基因表達體系。一、宿主細胞的選擇對于宿主細胞其應該：容易獲得較高濃度的細胞；能利用易得廉價原料；不致病、不產生內毒素；發(fā)熱量低，需

17、氧低，適當?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)；容易進行代謝調控；容易進行DNA重組技術操作；產物的產量、產率高，產物容易提取純化?；虮磉_有兩類宿主細胞：一類是原核細胞，目前常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等；另一類是真核細胞，常用的有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。1、原核細胞-1（1）大腸桿菌大腸桿菌表達基因工程產物的形式：細胞不溶性表達（包含體）、細胞內可溶性表達、細胞周質表達等，極少數(shù)情況下還可分泌到細胞外表達。不同的表達形式具有不同的表達水平，且雜質的含量和種類也會變化。大腸桿菌中的表達的特點：不存在信號肽，產品多為胞內產物； 分泌能力不足，真核蛋白質常形成不溶性的包含體，產物須在下游處理過

18、程中經過變性和復性處理才能恢復其生物活性； 不存在翻譯后修飾作用； 翻譯通常從甲硫氨酸的AUG密碼子開始，故目的蛋白質的N端常多余一個甲硫氨酸殘基，容易引起免疫反應； 產生的內毒素難以除去； 產生的蛋白質酶會破壞蛋白質。1、原核細胞-2（2）枯草芽孢桿菌分泌能力強，可以將蛋白質產物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體。該菌也不能使蛋白質產物糖基化，另外由于它有很強的胞外蛋白酶，會對產物進行不同程度的降解，因此在外源基因克隆表達的應用中受到影響。1、原核細胞-3（3）鏈霉菌其是重要的工業(yè)微生物，近年來作為外源基因表達體系正日益受到人們的重視。其主要特點是：不致病、使用安全，分泌能力強，可將表達產物直

19、接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力，變鉛青鏈霉菌限制修飾能力弱，可以作為理想的受體菌?，F(xiàn)已構建了一系列有效的載體，下游培養(yǎng)工藝也已經成熟。2、真核細胞-1（1）酵母 特點：真核生物細胞，故有后翻譯過程；基因組小，僅為大腸桿菌的4倍； 世代時間短，有單倍體和雙倍體兩種形式；基因操作與原核生物相似；可以建立有分泌功能的表達系統(tǒng)，將產物分泌出胞外，分離純化工藝相對簡單。在各種酵母中以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的應用歷史最為悠久，研究資料也最豐富。2、真核細胞-2（2）絲狀真菌近年來，已在約30種以上絲狀真菌中建立了DNA轉化系統(tǒng)，其特點是：有很強的蛋白分泌能力；能正確

20、進行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化等，而且其糖基化方式與高等真核生物相似；絲狀真菌（如曲霉等）等又確認是安全菌株，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。2、真核細胞-3（3）哺乳動物細胞哺乳動物細胞由于外源基因的表達產物可由重組轉化的細胞分泌到培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)成分完全由人控制，從而使產物純化變得容易。哺乳動物細胞分泌的基因產物是糖基化的，接近或類似于天然產物。但動物細胞生產慢，產率低，且培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度較稀。二、大腸桿菌中的基因表達1、載體表達載體必須具備的條件（1）載體能獨立地進行復制：分嚴緊型和松弛型，前者在宿主細胞中拷貝數(shù)僅13個，后者在宿主細胞中拷貝數(shù)可高達3000個。（2）應具

21、有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選，且克隆位點位于啟動子序列后，以便外源基因表達。（3）應具有很強的啟動子，能為大腸桿菌的RNA酶所識別。表達載體必須具備的條件（4）應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才進行轉錄。阻遏子的阻遏作用可以由物理（如溫度）、化學（如IPTG、IAA等）因素進行調節(jié)，因而可人為地選擇啟動子啟始轉錄mRNA的時機，以獲得外源蛋白質表達合成的最佳時機。外源基因的高效表達往往會抑制宿主細胞的生長、增殖，而阻遏子可使宿主細胞免除此不良影響。表達載體必須具備的條件（5）應具有很強的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉錄克隆的外源基因，而不

22、轉錄其他無關的基因，同時，很強的終止子所產生的mRNA較為穩(wěn)定。誘導表達時，由于強啟動子所致的高水平轉錄反過來還會影響質粒DNA本身的復制，從而引起質粒的不穩(wěn)定或脫質?，F(xiàn)象，因此表達載體需在外源基因的下游安置一個強轉錄終止子，以克服由質粒轉錄引進的質粒不穩(wěn)定。表達載體必須具備的條件（6）所產生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列（Shine-Dalgarno sequence），以便轉錄后能順利翻譯。大家可以翻到書本73面，其中介紹了兩個基因工程藥物研究中常用的表達載體。pBV220系統(tǒng)和pET系統(tǒng)。2、影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素（1）外源基因的拷貝數(shù)（2）外源

23、基因的表達效率：啟動子的強度、核糖體結合位點的有效性、SD序列和起始密碼ATG的間距、密碼子的組成等都會不同程度地影響外源基因的表達效率。（3）表達產物的穩(wěn)定性：組建融合蛋白；利用大腸桿菌的信號肽或真核多肽中自身的信號肽； 采用位點突變的方法；選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細胞，可能會減弱表達產物的降解。如黃嘌呤核苷（Ion）是大腸桿菌合成蛋白酶的主要底物，Ion-營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌不能合成黃嘌呤核苷，從而不能合成蛋白酶，減少了表達產物在細胞體內的降解。2、影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素（4）細胞的代謝負荷外源基因的表達產物屬于異己物質，并可能對宿主細胞有毒性。調節(jié)表達物質的積累與細胞的生

24、長和代謝之間的平衡有利于外源基因的高效表達。另外通過將細胞的生長和外源基因的表達分成兩個階段，或將宿主細胞的生長與重組質粒的復制分開兩種手段也可以減輕細胞代謝的負荷。形成不溶性的包含體可以降低表達產物對宿主細胞的毒害作用2、影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素（5）工程菌的培養(yǎng)條件除宿主、載體和克隆基因三者之間的關系影響外源基因的高水平表達外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。以后會對其進行詳細的介紹。3、真核基因早大腸桿菌中的表達形式（1）融合蛋白的形式（2）非融合蛋白的形式：指在大腸桿菌中表達的蛋白質以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含任何細菌多肽序列。為此，表達非融合蛋白的操縱

25、子必須改建成：細菌或噬菌體的啟動子細菌的核糖體結合位點（SD序列）真核基因的起始密碼子結構基因終止密碼。要表達非融合蛋白，要求SD序列與翻譯起始密碼ATG之間的距離要適合，SD序列與翻譯起始密碼ATG之間即使只改變23個堿基，表達效率也會受到很大的影響。非融合蛋白易被蛋白酶破壞，其N端常帶有甲硫氨酸，可引起人免疫反應。3、真核基因早大腸桿菌中的表達形式（3）分泌型表達蛋白藥物基因：外源蛋白的表達是通過將外源基因融合到編碼原核蛋白信號肽序列的下游來實現(xiàn)的。利用大腸桿菌的信號肽，構建分泌型表達質粒，常用的信號肽有堿性磷酸酶信號肽（phoA）、膜外周質蛋白信號肽（OmpA）、霍亂弧菌毒素B亞單位（C

26、TXB）等。特點：一些可被胞內蛋白酶所降解的蛋白質在周質中是穩(wěn)定的；由于有些蛋白質能按一定的方式折疊，所以在細胞內表達時無活性的蛋白質分泌表達時卻具有活性；蛋白信號肽和編碼序列之間能被切割，因而分泌蛋白質不含起始密碼ATG所編碼的甲硫氨酸等。但是，產量不高、信號肽不被切割或不在特定位置上切割等。三、酵母中的基因表達酵母表達系統(tǒng)是隨著酵母質粒和酵母轉化技術的建立而逐步發(fā)展起來的，其與其它表達系統(tǒng)一樣，包括載體、啟動子等控制序列和宿主細胞3個部分。1、載體（1）載體的復制序列（1）載體的復制序列：根據(jù)來自酵母的復制序列的構成和特性。載體可以分為四大類：Yep類（yeast episomal pla

27、smid，酵母附加體質粒），這類載體的復制序列為酵母2質粒成分。 2質粒是多數(shù)釀酒酵母中天然存在的質粒，長6.3kb，可獨立復制。將2質粒中復制起點區(qū)及REp3基因區(qū)的序列引入載體，就足以維持在大多數(shù)酵母株系中的復制能力。以2質粒為基礎的載體，因具有較高的拷貝數(shù)、轉化頻率和穩(wěn)定性而被廣泛使用。Ypp類（yeast replication plasmid，酵母復制型質粒）此類載體的復制序列是非2來源的自主復制序列（autonomous replication sequence，ARS），可來自酵母染色體，也可來自其他生物。此類載體穩(wěn)定性差，拷貝數(shù)也少，轉化頻率為103105/ g DNA。1、載

28、體（1）載體的復制序列YCp；類（yeast centromeric plasmid，酵母著絲粒質粒）此類載體的復制序列也屬于ARS，并且含有酵母染色體中心粒成分，有的還引入酵母染色體端粒成分。它們作為一種類似染色體的單位參與細胞有絲分裂和減數(shù)分裂，在子代細胞中精確地分配，因此有很好的穩(wěn)定性。但它們的拷貝 數(shù)只有1個，轉化頻率為103104/ g DNA。1、載體（1）載體的復制序列YIp類（yeast inteegrative plasmid，酵母整合型質粒），此類載體含有可與酵母染色體重組的序列，可以完全整合到染色體中。因此它依靠酵母染色體進行復制，具有很好的穩(wěn)定性?？截悢?shù)只有一個，轉化頻

29、率為1100/ g DNA。1、載體（2）克隆載體從大腸桿菌中制備質粒比從酵母中容易得多，因此酵母質粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進行的，只有在最后階段才轉入酵母中，這就要求酵母載體也同時具有在大腸桿菌中復制和增殖的能力。為此，向酵母載體中引入大腸桿菌質粒pBR322的ori部分和Ampr或Tetr部分，這樣構成的載體同時帶有細菌和酵母的復制原點和選擇標記。酵母最常使用的選擇性標記是某些氨基酸或核苷酸合成酶系基因，也可以是利用抗性基因作為選擇性標記。克隆載體既可以在細菌中進行質粒復制和表型選擇，又能在酵母中進行質粒復制和表型選擇。1、載體（3）表達載體將酵母菌的啟動子和終止子等有關控制序列

30、引入載體的適當位點后，就構成了酵母菌的表達載體。酵母菌的表達載體有兩類：普通表達載體和精確表達載體，前者只能方便地引入外源基因并進行表達，對表達產物的組成，特別是對其N末端氨基酸是否增減并無嚴格要求。后者要求在啟動子或前導肽編碼序列的適當部位有內切酶點，以利于接入外源基因，并使他在表達后加工后N末端氨基酸序列與天然產物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸2、影響目的基因在酵母菌中表達的因素（1）外源基因的拷貝數(shù)外源基因通常是由多拷貝的質粒載體導入宿主細胞的，質粒的拷貝數(shù)及其在宿主細胞內的穩(wěn)定性對外源基因的表達起決定作用。有些質粒在導入宿主細胞后，在傳代培養(yǎng)中很快丟失，不能用于工業(yè)生產。通過

31、整合質粒，將外源基因整合到宿主染色體上，雖然很穩(wěn)定，但通常只有一個拷貝，不能高效表達。高穩(wěn)定的高拷貝數(shù)的質?？墒雇庠椿蚋咝П磉_，但高拷貝數(shù)通常會引起細胞生長量的降低；而單拷貝數(shù)的質粒對細胞的最大生長沒有影響，因而也能達到高效表達。（2）外源基因的表達效率啟動子外源基因在酵母中表達的效率主要與啟動子、分泌信號和終止序列有關。啟動子 “表達框架”。啟動子是由上游激活序列和保留的近端啟動子組成。近端啟動子含有一個轉錄所必需的TATA序列和mRNA起始轉錄位點起始密碼子。終止區(qū)含有終止mRNA轉錄所需的信號。（2）外源基因的表達效率啟動子在酵母菌中經常利用的啟動子有組成型和誘導型啟動子，不同啟動子對

32、不同外源基因的表達水平的調節(jié)作用明顯不同。 啟動子類型 所用的基因 基因符號 組成型 磷酸甘油酸激酶 PGK 烯醇酶 ENOL 3-磷酸甘油醛脫氫酶 GAPDH 乙醇脫氫酶1 ADH1 磷酸三糖異構酶 TRI 信息素-因子 MF 1誘導型 細胞色素C CYC1 酸性磷酸脂酶 PHO5 半乳糖激酶 GAL1 UDP-D-半乳糖-4-差向酶 GAL10（2）外源基因的表達效率啟動子分泌信號的效率。分泌信號包括信號肽部分以及前導肽部分的編碼序列，它幫助后面的表達產物分泌出酵母細胞，并在適當?shù)牟课挥砂麅鹊鞍酌讣庸で袛啾磉_產物和前導肽之間的肽鍵，產生正確的表達產物。分泌信號是酵母菌表達蛋白的起始分泌、糖

33、基化和蛋白折疊加工等不可缺少的因素。終止序列的影響：終止序列保證產物（mRNA）在適當部位終止和加上polyA尾部，這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定并被有效地翻譯。在酵母中表達的人工合成基因一般不含終止序列，必須借用外加的終止序列或載體上現(xiàn)有的終止序列。常用的外加終止序列有ADH1、CYC1、MF1和PGK。（3）外源蛋白的糖基化外源蛋白在酵母細胞中可發(fā)生N-糖苷鍵（天冬酰胺連接）和O-糖苷鍵（絲氨酸或蘇氨酸連接）的兩種不同的糖基化，與哺乳動物中發(fā)生的糖基化相同。外源蛋白經釀酒酵母合成、氨基末端修飾、二硫鍵形成、蛋白質折疊和糖基化后，可靠有效地以活性型分泌到培養(yǎng)基中，而且某些蛋白質糖基化后更加穩(wěn)

34、定，便于分離精制。（4）宿主菌株的影響不同的酵母菌株及其生理狀況對外源基因的表達有明顯的影響。表達用的酵母宿主菌株應具備下列要求：菌體生長力強；菌體內源蛋白酶要較弱；菌株性能穩(wěn)定，常用的幾乎是突變株，避免使用回復突變率高的不穩(wěn)定體系；最好使用二倍體或多倍體菌株；分泌能力強。四、動物中的基因表達優(yōu)點：產物類似于天然產物，容易分離純化缺點：動物細胞生長慢，培養(yǎng)條件苛刻，費用高培養(yǎng)液濃度較小。書中第82頁表3-2對大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞3類主要基因工程表達體系簡要進行了比較。第五節(jié) 基因工程菌的穩(wěn)定性一、質粒不穩(wěn)定產生的原因工程菌的質粒由于分裂的原因而不穩(wěn)定；質粒的拷貝數(shù)所決定的不穩(wěn)定；培養(yǎng)條件：比生長速率控制；質粒穩(wěn)定性分析方法：先在不含抗性標記培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再于含抗性標記培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)比值計算質粒的穩(wěn)定性。二、提高質粒穩(wěn)定性的方法為提高培養(yǎng)過程中質粒的穩(wěn)定性，一般采用兩階段法，第一階段先使菌體生長至一定密度，第二階段誘導外源基因的表達。在培養(yǎng)基中加入選擇性壓力如抗生素等，以抑制質粒丟失菌的生長，也是提高質粒穩(wěn)定性的方法。采用適當?shù)牟僮鞣绞娇墒构こ叹L速率具有優(yōu)勢，并使工程菌和