端粒和端粒酶陳莉南通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院PPT課件

1、 早在30年代，兩名遺傳學(xué)家Muller和Mcclintock分別在不同的實驗室用不同的生物做實驗發(fā)現(xiàn)染色體末端結(jié)構(gòu)對保持染色體的穩(wěn)定十分重要，Muller將這一結(jié)構(gòu)命名為端粒（telomere）。直到1985年Greider等從四膜蟲中真正證實了端粒的結(jié)構(gòu)為極簡單的6個核苷酸TTAGGG序列的多次重復(fù)后發(fā)現(xiàn)了端粒酶(telomerase TRAP-eze) 。 第1頁/共48頁 端粒與端粒酶是當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點。 端粒是位于真核細胞染色體末端的核酸蛋白復(fù)合體,其功能在于維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。 端粒酶是一種核酸核蛋白酶,能以自身的RNA為模板合成端粒的重復(fù)序列,以維持端粒長度的穩(wěn)定性。

2、 許多研究表明,端粒、端粒酶的功能失調(diào)將影響細胞的生物學(xué)行為，包括細胞周期的穩(wěn)定性、細胞增殖、癌變、凋亡、衰老。 第2頁/共48頁第一節(jié) 端粒與端粒酶一、端粒的結(jié)構(gòu)與功能 1972年James Watson提出了“復(fù)制末端問題”，復(fù)制DNA的DNA多聚酶并不能將線性染色體末端的DNA完全復(fù)制。也就是說在線性DNA復(fù)制時，DNA多聚酶留下染色體末端一段DNA（一段端粒）不復(fù)制。 端粒DNA復(fù)制的特點是在每次DNA 復(fù)制中，每條染色體的3端均有一段DNA無法得到復(fù)制，隨著細胞每次分裂，染色體3一末端將持續(xù)喪失50-200bp的DNA，因而細胞分裂具有一定的限度，即分裂壽命。所以端粒的長度可作為細胞

3、的“分裂時鐘”，反映細胞分裂能力。第3頁/共48頁 真核細胞染色體末端會隨著細胞分裂而縮短，這個縮短的端粒再傳給子細胞后，隨細胞的再次分裂進一步縮短。隨著每次細胞分裂，染色體末端逐漸縮短，直至細胞衰老。人類體細胞遵循這個規(guī)則從細胞出生到衰老，單細胞生物遵循這個規(guī)則分裂后定有其它機制保持單細胞生物傳代存活，生殖細胞亦如此。 第4頁/共48頁端粒：是真核細胞線性染色體末端特殊結(jié)構(gòu)。 由端粒DNA和端粒相關(guān)蛋白組成。 端粒DNA：為不含功能基因的簡單、高度重復(fù)序列, 在生物進化過程中具有高度保守性。 不同物種的端粒DNA 序列存在差異。 人類及其它脊椎動物染色體端粒的結(jié)構(gòu)是5TTAGGG3的重復(fù)序列

4、, 長約15kb。體細胞的端粒有限長度（telomere restriction fragments TRFS）大多數(shù)明顯短于生殖細胞，青年人的TRFs又顯著長于年長者，提示TRFs隨著細胞分裂或衰老，在不斷變短，主要是由于DNA聚合酶不能完成復(fù)制成線性DNA末端所致。第5頁/共48頁 端粒DNA由兩條互相配對的DNA 單鏈組成, 其雙鏈部分通過與端粒結(jié)合蛋白質(zhì)TRF1和TRF2 結(jié)合共同組成t環(huán)(t loops)。這種t 環(huán)特殊結(jié)構(gòu)可維持染色體末端的穩(wěn)定,保持染色體及其內(nèi)部基因的完整性,從而使遺傳物質(zhì)得以完整復(fù)制。缺少端粒的染色體不能穩(wěn)定存在。 端粒DNA與結(jié)構(gòu)蛋白形成的復(fù)合物如同染色體的一

5、頂“帽子”，它既可保護染色體不被降解，又避免了端粒對端融合（end-end fusion）以及染色體的喪失，同時端粒能幫助細胞識別完整染色體和受損染色體。在生理情況下，端粒作為細胞“分裂時鐘”能縮短，最終導(dǎo)致細胞脫離細胞周期。 第6頁/共48頁二、端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能 在端粒被發(fā)現(xiàn)以前，人們就推測生殖細胞之所以能世代相傳，其中可能存在一種維持端粒長度的特殊機制，體細胞可能正是由于缺乏這種機制，它的染色體末端才面臨著致死性缺失（deletion）的危險。因此在正常人體細胞間永生化細胞（immortalized cells）及腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化過程中可能也存在著與生殖細胞類似的機制。這些細胞怎樣保持細胞

6、具有繼續(xù)分裂或長期分裂的能力呢？科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)端粒確實隨著每次分裂而縮短，但也會被新合成的端粒片斷再延長?？茖W(xué)家們懷疑，可能尚有末被發(fā)現(xiàn)的酶，該酶具有標(biāo)準(zhǔn)的DNA多聚酶所不具備的功能，能使已縮短的端粒延長，使科學(xué)家們興奮的是到1984年首先在四膜蟲中證實了這種能使端粒延長的酶端粒酶的存在。 第7頁/共48頁 端粒酶的結(jié)構(gòu) 端粒酶在結(jié)構(gòu)上為一核糖核蛋白復(fù)合體, ,由RNA RNA 和結(jié)合的蛋白質(zhì)組成, ,是RNARNA依賴的DNA DNA 聚合酶。它是一種特殊的能合成端粒DNADNA的酶, ,通過明顯的模板依賴方式每次添加一個核苷酸。 端粒酶實質(zhì)上是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶 端粒酶RNA(hTR)RNA

7、(hTR) 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERTTERT） 端粒酶結(jié)合蛋白（TEP） 第8頁/共48頁端粒酶RNA(hTR)RNA(hTR)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERTTERT）端粒酶結(jié)合蛋白（TEP）端粒酶RNARNA是第一個被克隆的端粒酶組分。端粒酶RNARNA含有與同源端粒DNADNA序列TTAGGGTTAGGG的互補序列, ,核糖核酸酶H H切割此模板區(qū), ,能使體外消除端粒酶延長端粒的功能。人類TERTTERT（hTERThTERT）基因為一單拷貝基因, ,定位于5 5p15. 33 ,p15. 33 ,具有7 7個保守序列結(jié)構(gòu)域單元和端粒酶特異性結(jié)構(gòu)域單元T T。破壞TERT TERT 將消除端粒

8、酶活性并致端?？s短。TEP1TEP1、生存動力神經(jīng)細胞基因( (SMN) SMN) 產(chǎn)物、 hsp90hsp90 、 PinX1PinX1、 Est1p Est1p 和Est3pEst3p 第9頁/共48頁 1 1、端粒酶RNA(hTERT)RNA(hTERT) 哺乳動物端粒酶RNAs(hTRRNAs(hTR和mTR)mTR)在許多組織的不同發(fā)育階段, ,甚至那些沒有端粒酶活性的組織中廣泛表達。 體內(nèi)端粒酶RNA RNA 的存在對端粒酶功能至關(guān)重要，影響到端粒酶RNA RNA 的穩(wěn)定性與突變, ,也可改變體內(nèi)端粒長度，并可通過改變端粒完整性或端粒結(jié)合因子的末端結(jié)合位點致細胞核分裂后期細胞死亡

9、。端粒酶RNA轉(zhuǎn)錄模板遠端區(qū)參與和底物的結(jié)合。近端區(qū)能添加特定的核苷酸,對底物識別并不重要。模板邊界區(qū)與端粒酶催化亞基TERT結(jié)合,也與端粒酶相關(guān)因子Est1p和Ku 結(jié)合。第10頁/共48頁2 2、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶( (Telomerase reverse transcriptase,TERT)Telomerase reverse transcriptase,TERT) 幾乎所有存在端粒酶的機體均含有一單獨的TERT TERT 基因, , 哺乳動物TERT TERT 的轉(zhuǎn)錄由許多轉(zhuǎn)錄因子、激素和細胞外信號嚴(yán)格控制。不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)hTERThTERT在不同的細胞內(nèi)含物中的表達。癌基因c-my

10、cc-myc是一個受特殊信號調(diào)節(jié)的可誘導(dǎo)癌基因, , 并可與H HRasRas、N NRasRas、多瘤病毒MTMT、LT LT 等癌基因協(xié)同作用, , 促進細胞無限增殖, , 獲得永生化并發(fā)生癌變。第11頁/共48頁 c-myc c-myc 與hTERThTERT FujimotoFujimoto等用c-myc c-myc 反義寡核甘酸轉(zhuǎn)染白血病細胞后, , 這些細胞中端粒酶活性均能被下調(diào), , 而c-myc c-myc 正義寡核甘酸無此作用。 WangWang等研究發(fā)現(xiàn)c-mycc-myc在正常人乳腺上皮細胞和二倍體成纖維細胞中誘導(dǎo)端粒酶活性, , 并能延長這些細胞的壽命。因此認為癌基因c

11、-mycc-myc為一重要的端粒酶激活劑。 存在于hTERThTERT核心啟動子中有兩個重要的c-myc c-myc 結(jié)合位點( (CACGTG,CACGTG,亦被稱為E E 盒) )。c-myc c-myc 誘導(dǎo)的hTERT hTERT 表達起始速度快, ,不受細胞增殖或額外的蛋白合成的影響, ,與c-myc c-myc 引起的直接的轉(zhuǎn)錄激活一致。但癌基因c-myc c-myc 不是唯一與hTERThTERT基因調(diào)節(jié)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。第12頁/共48頁 近期研究表明, ,Sp1 Sp1 協(xié)同c-myc c-myc 激活hTERThTERT的轉(zhuǎn)錄, ,可能還有其他因子, ,如Bcl-2 Bcl-

12、2 抗凋亡基因、E6HPVE6HPV16 16 型蛋白，以及經(jīng)過一些蛋白激酶的磷酸化使hTERT hTERT 上調(diào)。但在諸多不同類型的瘤細胞中, ,致hTERThTERT上調(diào)的基本激活劑是c-mycc-myc。 TERT TERT內(nèi)的N-N-殘基對多種功能是重要的, , 包括與端粒酶RNARNA結(jié)合、端粒酶RNA RNA 裝配和催化作用、與p53 p53 的相互作用和細胞永生化。 TERT TERT的C-C-殘基也在人類原始纖維母細胞的永生化、端粒組裝的競爭、核仁內(nèi)定位、引物結(jié)合和漸進性延長等方面起重要作用。 第13頁/共48頁 3、端粒酶相關(guān)蛋白(TEP) 端粒酶相關(guān)蛋白-1(TEP1)是一

13、多功能的RNA 結(jié)合蛋白，TEP1 缺失導(dǎo)致rRNA 水平的顯著降低以及TEP1 和rRNA 的丟失,但不導(dǎo)致端粒酶活性或端粒長度的紊亂。 生存動力神經(jīng)細胞基因(SMN) 產(chǎn)物熱休克蛋白（hsp）90 、其他涉及到TERT轉(zhuǎn)錄后修飾的蛋白包括磷酸酶-A、Akt 、cAbl 、p53 和PARP。PinX1 與人TERT體外共表達時抑制人端粒酶活性。 芽殖酵母蛋白Est1p 和Est3p 這兩個蛋白與體內(nèi)端粒酶的功能有關(guān)。Est1p 足以使端粒延長。但是,在無Est1p存在的情況下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以維持端粒長度。第14頁/共48頁 端粒酶的功能 端粒酶是在染色體末端不斷合成

14、端粒序列的酶，它可以維持端粒的長度，維持細胞增殖潛能。端粒酶以自身RNA為模板合成端粒酶重復(fù)序列，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，它的活性不依賴于DNA聚合酶，對RNA酶、蛋白酶和高溫均敏感。端粒酶活性表達能穩(wěn)定端粒的長度，抑制細胞的衰老，在生殖細胞和干細胞中可檢測到高水平的端粒酶活性。 在體內(nèi)還不清楚每一次細胞分裂有多少端粒DNADNA合成。體內(nèi)端粒酶的延長功能是一復(fù)雜的動態(tài)過程: :受雙鏈端粒結(jié)合蛋白包括RAP1 RAP1 ( (芽殖酵母) ) 、存在于t t環(huán)的TRF1 (TRF1 (依賴于端粒酶) )和TRF2(TRF2(不依賴于端粒酶) )的負調(diào)控。 第15頁/共48頁 第二節(jié) 端粒端粒酶對細胞死

15、亡和細胞永生化的影響 “端粒端粒酶假說”認為端粒酶的激活與細胞永生化和惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。染色體末端的端粒DNADNA進行性的縮短是限制人細胞壽命的先決條件。相對地, ,端粒酶的激活, ,合成端粒的DNADNA被認為是細胞永生化和癌癥發(fā)展必需的一步。目前的資料證實, ,端粒酶對長期成活的組織和長期進行有絲分裂的細胞是必需的。 第16頁/共48頁 細胞的死亡過程分為兩個階段, , 當(dāng)端?？s短至一關(guān)鍵性長度2 2kb-kb-4kb 4kb 時, ,染色體的穩(wěn)定性就會遭到破壞, ,細胞開始衰老進入M M1期（mortality stage1 M M1）。在M1期細胞對生長因子等失去反應(yīng)，產(chǎn)

16、生DNA合成蛋白抑制因子，細胞周期檢查點（cell cycle checkpoints）發(fā)送周期停止信號，DNA合成停止，DNA DNA 斷裂, ,活化p53 p53 依賴或非p53 p53 依賴的DNA DNA 損傷途徑。并誘導(dǎo)細胞周期依賴性激酶（CDKCDK）抑制物如p21 ,p27p21 ,p27產(chǎn)生, ,導(dǎo)致細胞G1G1期生長停滯, ,最終走向死亡。如果這一過程中一些癌基因SV40T抗原、PRB ,p53 ,p16 PRB ,p53 ,p16 等抑癌基因失活, ,喪失正常功能, , 均能使M1期的機制被抑制使細胞逃逸M1期，繼續(xù)生長獲得額外的增殖能力，此時端粒酶仍為陰性，端粒繼續(xù)縮短，

17、經(jīng)過20-30次分裂后，最終到達M2期。細胞由于端粒過短, ,基因不穩(wěn)定, ,絕大多數(shù)細胞死亡, ,只有極少數(shù)細胞由于端粒酶活性的上調(diào)或重新激活, ,端粒的功能得到恢復(fù), ,基因重獲穩(wěn)定, ,使細胞超越M M2期, ,成為永生化細胞。 第17頁/共48頁 端粒酶被抑制 正常人體細胞 端粒丟失 M1期阻滯 SV40T抗原 細胞分裂停止 Rb、P53與病毒蛋白結(jié)合、突變 M1M2期間隔 永生化 雙著絲粒形成 M2期退化 染色體失穩(wěn) 端粒酶被激活 細胞凋亡 端粒酶在人體細胞永生性轉(zhuǎn)化中第18頁/共48頁第三節(jié) 端粒酶細胞周期中細胞增殖、凋亡的影響 一、端粒酶對細胞周期的影響 端粒酶活性與細胞周期密切

18、相關(guān)。細胞周期所處階段不同,端粒酶活性亦不同, 端粒酶活性與細胞周期CDK-CKIs 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)有關(guān) 。實驗發(fā)現(xiàn)永生化細胞株在細胞周期各個時相都有端粒酶活性,而靜息細胞中活性降低,隨著腫瘤細胞進入G1/S 期,端粒酶活性逐漸升高,在復(fù)制S 期端粒酶活性最高,而在G2/M期端粒酶活性逐漸喪失,當(dāng)培養(yǎng)細胞處于無血清而進入G0 期時,端粒酶活性不受影響。在人乳腺癌中,端粒酶的高活性水平伴有cylinD 或cyclin E 的高表達,某些周期蛋白可能參與端粒酶活性的調(diào)控。第19頁/共48頁 各種基因毒性或環(huán)境應(yīng)激所致細胞DNA雙鏈破壞時可使野生型p53活化, 進而引起細胞周期停滯或誘導(dǎo)細胞凋亡, 使

19、細胞得以避免表型惡性轉(zhuǎn)化。端粒雙鏈DNA 的破壞是否也能活化p53依賴的信號傳導(dǎo)通路呢?kusumoto等在構(gòu)建的端粒酶和p53單或雙缺陷鼠體內(nèi)研究證實, 端粒DNA的丟失可以誘導(dǎo)活化p53和p21WAF1, 并導(dǎo)致細胞周期停滯，而p53的缺失則可促進端粒序列的丟失, 增大染色體的融合頻率。端粒功能的缺失以及相繼出現(xiàn)的基因不穩(wěn)定與p 53缺陷相協(xié)同而激活細胞惡性轉(zhuǎn)化過程。第20頁/共48頁二、端粒酶對細胞增殖的影響 曾一度認為端粒酶活性是細胞惡變或永生的標(biāo)志, ,然而, ,不但在正常組織的永生化細胞( (如造血干細胞、精子) ,) ,而且在非永生的、正常生理狀態(tài)下增殖活躍的細胞( (如受抗原刺

20、激的T T及B B淋巴細胞、口腔和食道粘膜上皮、皮膚基底層角質(zhì)形成細胞、宮頸上皮、小腸上皮) ) 也可檢出端粒酶活性。但Lehner Lehner 等用定量RT-PCR RT-PCR 法在子宮內(nèi)膜癌、增生期子宮內(nèi)膜、分泌期子宮內(nèi)膜及萎縮性子宮內(nèi)膜檢測到hTERT mRNA hTERT mRNA 表達值差異顯著?？梢? ,不同增殖程度的子宮內(nèi)膜均表達端粒酶活性, ,但其程度不同。因此, ,借助端粒酶定性檢測判斷良惡性增殖, ,其意義明顯不如定量檢測。第21頁/共48頁 已有多次報道:改變實驗條件可使多種端粒酶活性陰性細胞表達端粒酶活性,并獲得永生;反之,抑制某些增殖活躍組織的端粒酶活性能抑制細胞

21、增殖。 另有人發(fā)現(xiàn):端粒酶通過調(diào)節(jié)端粒長度和生長促進因子基因表達來影響細胞增殖 。提示端粒酶是細胞生長、增殖中的重要機制。 第22頁/共48頁 但少數(shù)永生化的腫瘤細胞株和一些軟組織腫瘤雖然沒有端粒酶活性,但仍有較長端粒,提示還存在不依賴端粒酶的端粒延長機制 。 此外用識別hTR 3端不同序列的三種核酶作用于腫瘤細胞,4周內(nèi)端粒酶活性降低,端粒縮短,增殖速度沒有改變。 其他研究如黑素瘤細胞,8周內(nèi)端粒酶活性降低,但是傳代超過20 代后,端粒長度不縮短,細胞持續(xù)增殖。說明除了端粒、端粒酶引起細胞增殖的作用外，還有其他引起細胞的增殖機制。第23頁/共48頁三、 端粒酶對細胞凋亡的影響 啟動凋亡的某些

22、基因位于端粒結(jié)構(gòu)附近, 完整的端粒結(jié)構(gòu)可以抑制這些基因的表達, 而維持端粒長度主要依賴于端粒酶。 Holt等在實驗中發(fā)現(xiàn), 通過異位表達端粒酶,而使端粒長度保持穩(wěn)定的某些正常細胞對凋亡的抵抗力增強； 用實驗方法使端粒酶陽性細胞端粒延長, 子代細胞生存和抗凋亡能力將增強；端粒酶陽性永生化細胞要比端粒酶陰性永生化細胞有更強的抗凋亡生存能力。這些與兩個主要的凋亡途徑核內(nèi)鈣依賴核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)途徑和Caspese家族中IL-1B轉(zhuǎn)換酶活化途徑存在缺陷有關(guān)。此外, 研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)hTERT 顯性突變,降低腫瘤細胞內(nèi)源性端粒酶活性, 腫瘤細胞端粒將持續(xù)縮短, 繼之異常有絲分裂增多, 并最終出現(xiàn)大量凋亡細胞。第

23、24頁/共48頁第四節(jié) 端粒酶與衰老 如何使人體衰老延遲，一直都是人類所不斷追求的。雖然科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一些抗衰老的藥物和方法，但都不夠理想。細胞經(jīng)過一定次數(shù)分裂后，端粒的不斷丟失使細胞就進入不可逆轉(zhuǎn)的生長抑制狀態(tài)，脫離了細胞周期而衰老、凋亡，此過程即為復(fù)制性衰老。在體外培養(yǎng)中，衰老細胞逐漸增多的過程中，可用端粒序列的逐漸丟失來作衰老量化機制精確模型。隨著年齡增長，染色體中端粒長度縮短。第25頁/共48頁 在早老患者中有一個過早的端?？s短，進而縮短的端粒允許染色體融合，這些現(xiàn)象與年老患者的細胞中或培養(yǎng)的老化細胞中染色體組型衰老異常的高發(fā)生率密切相關(guān)。既然端粒酶活性表達能穩(wěn)定端粒的長度，使端粒在細

24、胞復(fù)制過程中不會丟失，細胞衰老的進程也能被阻止，從而壽命延長這正是人們研究的端粒酶與抗衰老關(guān)系的新熱點。第26頁/共48頁 端粒酶延長端粒長度以減慢細胞衰老最早的證據(jù)來自BodnarBodnar等的研究，19981998年其在ScienceScience上刊文報道：將人的端粒酶基因?qū)攵肆Ｃ戈幮缘恼Ｈ梭w細胞中激活其表達并培養(yǎng)細胞，然后與未導(dǎo)入該基因的細胞比較，發(fā)現(xiàn)前者端粒明顯增長，細胞分裂旺盛，細胞壽命比后者大大延長，更令人關(guān)注的是細胞并無腫瘤樣改變。KudoKudo等報道端粒酶活性和細胞凋亡可作為伴有或不伴有子宮內(nèi)發(fā)育延遲的胎盤衰老的標(biāo)志。第27頁/共48頁 MattsonMattson等

25、亦認為在研究神經(jīng)細胞分化和存活中激活端粒酶與TERTTERT功能，能較好地避免神經(jīng)細胞死亡，還可以促進神經(jīng)細胞在各種神經(jīng)元退化性病變條件下的恢復(fù)。 阿爾茨海默?。ˋlzheimers diseaseAlzheimers disease，ADAD）是一種常見于老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，其患者的腦血管壁中可分離出致ADAD神經(jīng)元退行性病變的- -淀粉樣蛋白。 Zhu Zhu等利用反義技術(shù)和端粒酶抑制劑引發(fā)胎鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞中TERTTERT的功能抑制，發(fā)現(xiàn)顯著增加了由- -淀粉樣蛋白肽引起的細胞凋亡； 嗜鉻細胞瘤細胞中TERTTERT的過量表達會降低此種細胞凋亡。 第28頁/共48頁其原因是TE

26、RTTERT功能降低的神經(jīng)細胞在暴露于- -淀粉蛋白中能增強其氧化性并使線粒體功能發(fā)生障礙，因而引起細胞凋亡。TERTTERT在神經(jīng)退行性病變實驗?zāi)Ｐ椭姓宫F(xiàn)出有神經(jīng)保護性功能，提示在神經(jīng)細胞中若能提高端粒酶的活性可能會抑制與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性病變，如ADAD和腦老化的發(fā)生等。第29頁/共48頁 端?？s短加快可在許多病變中觀察到: :如Down Down 綜合征、Werner Werner 綜合征、毛細管擴張失調(diào)癥 、先天性角化不良等, ,雖然有些遺傳異常和端粒缺陷的關(guān)系還不清楚, ,但可能的原因有: : 端粒核酸外切酶活性和( (或) )有效利用的增加。端粒過度丟失。在發(fā)育或出生后端粒補償機

27、制的不足( (端粒酶或正性ALTALT樣功能) )。 端?？s短加速可由于環(huán)境的應(yīng)急介導(dǎo)的DNA DNA 損害或?qū)@些損害敏感度增加所致。不管何種原因, ,端粒縮短速率增加可致增殖組織的早衰特征, ,但也促進由于致瘤突變而獲得增殖活性提高的克隆過分生長。 第30頁/共48頁第五節(jié) 端粒酶活化是腫瘤的顯著特征 盡管有研究認為端粒長度維持還可以借助于非端粒酶依賴模式，即端粒替代延長（altematire Lengthening of telomere ALTaltematire Lengthening of telomere ALT）機制，但其存在上并不能否認永生化細胞中端粒酶的重要作用。自從199

28、41994年KimKim等創(chuàng)立TRAPTRAP法檢測端粒酶活性以來，越來越多的文獻證明端粒酶活性在大多數(shù)人類原發(fā)性腫瘤標(biāo)本及腫瘤衍生細胞系中可被檢測到。美國學(xué)者在400多例來源于12 種不同組織的原發(fā)腫瘤病例中，腫瘤組織的端粒酶陽性率高達84.8，而腫瘤周圍組織或良性病變中陽性率僅為4.4。第31頁/共48頁 附表 人體組織中端粒酶活性 腫瘤部位/類型 與腫瘤鄰近正常組織/良性病變 腫瘤組織（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%）結(jié)腸0/45（0）22/23（95.6%）肝1/1（

29、100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）腎0/55（0）40/55（72.7%）神經(jīng)母細胞瘤 0/17（0）94/100（94%）血液（淋巴瘤，CLL ALL） 21/23（91.3%）腦6/8（75%）其它（頭頂部，Wilms瘤） 8/93（8.6%） 24/26 (92.3) 合計 14/332 （4.2%） 365/430 (84.8)第32頁/共48頁 ShayShay等報道了幾年不同學(xué)者對腫瘤端粒酶探討的檢測結(jié)果，總結(jié)了正常組織（196196例），原位癌（410410例），惡性腫瘤（20312031例）和癌旁組織（690690例）的端粒酶的陽性率，它們分別是0.5%0.5%、30

30、%30%、85%85%和11%11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的陽性率為85.0%85.0%95.0%95.0%，而對應(yīng)的癌旁或良性病變組織中，端粒酶基本上不能檢出或活性極微弱。SumidaSumida等的研究結(jié)果表明, ,端粒酶在各種腫瘤中的陽性率分別為: :口腔鱗狀細胞癌80 %80 %90%,90%,食道癌87%,87%,胃癌85%,85%,肺癌80.1%,80.1%,肝癌85%,85%,乳腺癌85%,85%,腎癌71%,71%,胰腺癌95%,95%,端粒酶陽性率與腫瘤發(fā)生之間表現(xiàn)出良好的相關(guān)性。 第33頁/共48頁 Orlando 等對泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤進行了深入的

31、流行病學(xué)調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎癌組織中端粒酶陽性率為69%(345/497),正常腎組織為2%(7/344);膀胱癌組織中端粒酶陽性率為90%(342/381),正常組織為27% (36/134);膀胱癌患者尿液中端粒酶陽性率為65%(436/675) ,膀胱灌洗液中端粒酶陽性率為72 %(131/182) ,而正常人為9%(47/ 486);前列腺癌組織中端粒酶陽性率為80%(266/332),鄰近組織為38%(32/83) ,前列腺上皮瘤為16%(4/25) ,良性前列腺肥大為8%(11/129) 。 第34頁/共48頁 85%90%的人腫瘤細胞中可以檢測到端粒酶活性,而正常細胞中卻沒有或活性很

32、低。人們推測腫瘤細胞逃避衰老持續(xù)增殖是端粒酶激活或端粒維持機制改變的結(jié)果。 一般認為,端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生過程中的一個后期事件,使腫瘤細胞的端粒不再進行性縮短而得以維持,避免了細胞正常的復(fù)制-衰亡機制的制約而獲得永生性,這是惡性腫瘤細胞顯著的生物學(xué)特征之一,是癌變機制中一個十分重要的環(huán)節(jié)。第35頁/共48頁 對細胞端粒功能的觀察和推測的最顯著的特征是發(fā)生端粒長度的維持,甚至在離開常規(guī)的激活時端粒長度維持機制(TMM)的延長,使初期細胞突破衰老屏障后癌變。發(fā)生的原因,最可能為過度的端粒酶激活或ALT樣功能在在細胞癌變中端粒長度的保留或增加,允許在致瘤突變發(fā)生時異常克隆的擴展。 一些端粒酶陰

33、性的癌癥通過一種或幾種ALT途經(jīng)維持端粒的長度。端粒酶或ALT機制存在于絕大多數(shù)腫瘤細胞中以通過添加端粒重復(fù)序列而維持端粒的長度。 在一些腫瘤中也觀察到一些端?？s短的現(xiàn)象，可能的機制是由于細胞分裂的增加端?？s短，導(dǎo)致異常修復(fù)事件使染色體發(fā)生端端融合。端端融合的后果是在隨后的細胞分裂過程中發(fā)生染色體斷裂, ,進而導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定和腫瘤易感性。 第36頁/共48頁 美國學(xué)者在CML和AML的端粒動力學(xué)研究中，用southern印跡法測量端粒長度，用stretch-PCR法測出端粒酶活性，在CML白細胞中，端粒酶活性非常低與正常組織相似。但若CML急性發(fā)作時，白細胞中端粒酶活性就表現(xiàn)為顯著升高。表明C

34、ML由慢性到急性發(fā)作時，高度激活了端粒酶。通過對CML和AML病情進展研究，發(fā)現(xiàn)所有病例中腫瘤細胞的端粒與相應(yīng)正常細胞相比都是縮短的，這可能是由于腫瘤細胞分裂次數(shù)遠遠大于正常細胞之故。第37頁/共48頁端粒危機 有些實體腫瘤細胞中端粒酶激活，但端粒并末縮短而是延長出現(xiàn)了矛盾的現(xiàn)象，被稱之為端粒危機（端?？s短和端粒酶激活）。這是腫瘤細胞克隆繁衍的強大驅(qū)動力，促進腫瘤的發(fā)展。 端粒危機的 假說的可能解釋為：許多血液學(xué)的惡性腫瘤都不會在局部形成腫瘤，細胞的增殖和循環(huán)都是單細胞的，因此每一個白血病細胞都將競爭更有效的增殖，使突變細胞在短期內(nèi)形成群落。與此相反實體腫瘤位于一點而不移動，因此子代對于不同突

35、變的競爭被其緊鄰所限制。實體腫瘤中大多數(shù)成功的克隆將比白血病細胞有更穩(wěn)定的遺傳特性。因為位于特殊環(huán)境中的特殊表型必須保持相當(dāng)長的時間才能克隆形成群落，所以實體腫瘤只有具備較長的端粒，才能有較穩(wěn)定的遺傳特性，具備“最好”的表型從而被選擇，進而生長繁殖。第38頁/共48頁 端粒酶水平與某些腫瘤惡性程度相關(guān)。采用端粒重復(fù)放大測定法( (telomeric repeat amplification protocol ,TRAP) telomeric repeat amplification protocol ,TRAP) 檢測膀胱癌患者尿液中端粒酶的活性,期腫瘤患者端粒酶陽性率為79 %(79 %(包

36、括15 15 例細胞學(xué)檢測陰性患者) , ) , 期和期腫瘤患者端粒酶陽性率分別為84%84%及87.5 %; 66%87.5 %; 66%的膀胱炎患者端粒酶陰性, ,其中7 7 例有假陽性; ;而健康者均為陰性。 對區(qū)分良性與惡性甲狀腺瘤, , hTERT hTERT 是敏感的標(biāo)志物 , ,從24 24 例患者的甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺物中提取RNA ,RNA ,進行RT-PCR RT-PCR 擴增hTERT hTERT 基因, ,與細胞學(xué)和組織學(xué)檢查結(jié)果比較, ,hTERT hTERT 陽性與惡性甲狀腺瘤的符合率為93 % ,93 % ,hTERT hTERT 陰性與良性甲狀腺瘤的符合率為90 %9

37、0 %。因此, ,隨著研究的不斷深入, ,端粒酶和hTERThTERT有望成為腫瘤診斷及惡性程度分類的標(biāo)志物 。 第39頁/共48頁第六節(jié) 以端粒酶為靶標(biāo)的抗癌藥物研究 在85%85%以上的腫瘤細胞和組織中高度表達端粒酶，因此端粒酶是一個較理想的抗腫瘤藥物靶標(biāo)。(1)(1)使用端粒酶抑制劑后, ,腫瘤細胞端?？s短直至足以對增殖產(chǎn)生負面效應(yīng), ,這種時間上的滯后與起始端粒的長度有關(guān)；(2)(2)至少在理論上腫瘤細胞存在抗端粒酶抑制劑或不依賴端粒酶的端粒維持機制的可能；(3)(3)端粒酶抑制劑對人表達端粒酶的體細胞可能有作用, ,例如造血干細胞、生殖細胞、表皮基層細胞和腸腺管細胞, ,但這種作用可能很小, ,因為新生組織的干細胞比腫瘤細胞的端粒要長得多。在細胞靜止期, ,端粒不縮短, ,端粒酶幾乎沒有活性。第40頁/共48頁 端粒酶抑制劑對腫瘤細胞和端粒酶陽性的正常細胞的作用是不同的: :腫瘤細胞對端粒酶抑制劑很敏感, ,作用一定時間后細胞出現(xiàn)生長抑制或凋亡; ; 生殖細胞在端粒酶抑制劑的作用下, ,端粒長度稍有縮短, ,然后繼續(xù)生長, ,端粒不再縮短; ; 干細胞與端粒酶陰性的細胞相比, ,其端粒縮短的速度慢得多,